고체상 추출과 GC/MS를 이용한 소변 중 대마 대사체 (THCCOOH) 분석 Determination of 11-nor-9-carboxy-Δ9-tetrahydrocannabinol (THCCOOH) in human urine by solid-phase extraction and GC/MS원문보기
소변 중 대마 남용여부를 판별하는데 기준이 되는 tetrahydrocannabinol (THC)의 대사체 성분인 11-nor-9-carboxy-${\Delta}^9$-tetrahydrocannabinol (THCCOOH)를 고체상 추출법 (solid-phase extraction, SPE)과 가스크로마토그래피/질량분석법 (GC/MS)을 이용하여 신속하게 분석 할 수 있는 방법을 제시하였다. 본 실험은 시험관에 소변 3 mL를 취해 염기성 (pH 10) 조건에서 가수분해 한 후, 양이온교환카트리지를 사용하여 THCCOOH 성분을 선택적으로 추출하고, 증발 건고한 다음 유도체 반응을 시켜 GC/MS로 분석하였다. 그 결과 분석방법의 검출한계 (LOD)는 0.4 ng/mL이고, 정량한계 (LOQ)는 1.2 ng/mL이였다. 검정곡선의 직선성 상관계수 ($r^2$)는 1.2 (LLE는 1.3)~50.0 ng/mL의 농도범위에서 0.999를 나타내었다. 그리고 정밀도 (precision)와 정확도 (accuracy)는 모두 ${\pm}1.20%$ 이내로 안정적이었으며, 회수율(recovery)은 83.6~90.7%로 측정되었다. 액체상 추출법 (liquid-liquid extraction, LLE)과 비교할 때, SPE 방법이 회수율은 낮았지만 검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도에서는 큰 차이가 없었다. 그러나 LLE 방법은 추출과정에 시간과 노력이 많이 드는 반면, SPE 방법은 상대적으로 추출 조작이 간편하고 신속하게 추출되었으며, 추출 잔류물도 깨끗하였다. SPE를 이용한 추출방법을 다수의 대마 흡연자 소변에 적용하였을 때 기존에 사용하던 LLE 방법보다 간편하고, 신속하게 대마 대사체 분석이 가능하였다.
소변 중 대마 남용여부를 판별하는데 기준이 되는 tetrahydrocannabinol (THC)의 대사체 성분인 11-nor-9-carboxy-${\Delta}^9$-tetrahydrocannabinol (THCCOOH)를 고체상 추출법 (solid-phase extraction, SPE)과 가스크로마토그래피/질량분석법 (GC/MS)을 이용하여 신속하게 분석 할 수 있는 방법을 제시하였다. 본 실험은 시험관에 소변 3 mL를 취해 염기성 (pH 10) 조건에서 가수분해 한 후, 양이온교환 카트리지를 사용하여 THCCOOH 성분을 선택적으로 추출하고, 증발 건고한 다음 유도체 반응을 시켜 GC/MS로 분석하였다. 그 결과 분석방법의 검출한계 (LOD)는 0.4 ng/mL이고, 정량한계 (LOQ)는 1.2 ng/mL이였다. 검정곡선의 직선성 상관계수 ($r^2$)는 1.2 (LLE는 1.3)~50.0 ng/mL의 농도범위에서 0.999를 나타내었다. 그리고 정밀도 (precision)와 정확도 (accuracy)는 모두 ${\pm}1.20%$ 이내로 안정적이었으며, 회수율(recovery)은 83.6~90.7%로 측정되었다. 액체상 추출법 (liquid-liquid extraction, LLE)과 비교할 때, SPE 방법이 회수율은 낮았지만 검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도에서는 큰 차이가 없었다. 그러나 LLE 방법은 추출과정에 시간과 노력이 많이 드는 반면, SPE 방법은 상대적으로 추출 조작이 간편하고 신속하게 추출되었으며, 추출 잔류물도 깨끗하였다. SPE를 이용한 추출방법을 다수의 대마 흡연자 소변에 적용하였을 때 기존에 사용하던 LLE 방법보다 간편하고, 신속하게 대마 대사체 분석이 가능하였다.
11-nor-9-carboxy-${\Delta}^9$-tetrahydrocannabinol (THCCOOH) is the major metabolite of tetrahydrocannabinol (THC) which is the primary psychoactive component of marijuana. It is also the target analyte for the discrimination marijuana use. A method using solid-phase extraction (SPE) and ...
11-nor-9-carboxy-${\Delta}^9$-tetrahydrocannabinol (THCCOOH) is the major metabolite of tetrahydrocannabinol (THC) which is the primary psychoactive component of marijuana. It is also the target analyte for the discrimination marijuana use. A method using solid-phase extraction (SPE) and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) was developed for the determination of THCCOOH in human urine. Urine samples (3 mL) were extracted by SPE column with a cation exchange cartridge after basic hydrolysis. The eluents were then evaporated, derivatized, and injected into the GC/MS. The limits of detection (LOD) and quantitation (LOQ) were 0.4 and 1.2 ng/mL, respectively. The response was linear with a correlation coefficient of 0.999 within the concentration range of 1.2 (LLE 1.3)~50.0 ng/mL. The precision and accuracy were stable within 1.20% and the recovery was 83.6~90.7%. The recovery of SPE method was lower than that of liquid-liquid extraction (LLE), but there were no apparent differences in LOD, LOQ, precision and accuracy between the two methods. While SPE method is used as a very effective and rapid procedure for sample pretreatment, and clean extracts, LLE method was not suitable for the extraction procedure of THCCOOH in urine. The applicability of the method was proven by analyzing a urine samples from a marijuana abusers.
11-nor-9-carboxy-${\Delta}^9$-tetrahydrocannabinol (THCCOOH) is the major metabolite of tetrahydrocannabinol (THC) which is the primary psychoactive component of marijuana. It is also the target analyte for the discrimination marijuana use. A method using solid-phase extraction (SPE) and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) was developed for the determination of THCCOOH in human urine. Urine samples (3 mL) were extracted by SPE column with a cation exchange cartridge after basic hydrolysis. The eluents were then evaporated, derivatized, and injected into the GC/MS. The limits of detection (LOD) and quantitation (LOQ) were 0.4 and 1.2 ng/mL, respectively. The response was linear with a correlation coefficient of 0.999 within the concentration range of 1.2 (LLE 1.3)~50.0 ng/mL. The precision and accuracy were stable within 1.20% and the recovery was 83.6~90.7%. The recovery of SPE method was lower than that of liquid-liquid extraction (LLE), but there were no apparent differences in LOD, LOQ, precision and accuracy between the two methods. While SPE method is used as a very effective and rapid procedure for sample pretreatment, and clean extracts, LLE method was not suitable for the extraction procedure of THCCOOH in urine. The applicability of the method was proven by analyzing a urine samples from a marijuana abusers.
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문제 정의
본 연구는 대마 남용자 수사에서 채취한 흡연자 소변을 감식할 때 LLE 방법 대신에 전처리가 간편한 SPE 방법을 적용하여 대마 대사체 성분 THCCOOH 를 추출하고, GC/MS로 분석할 수 있는 신속한 방법을 개발하는데 그 목적이 있다.
제안 방법
Intraday는 1일 동안 3회 실험한 결과를 가지고 구하였다. 그리고 interday는 10일 동안 반복 실험한 결과를 가지고 측정하였다.
Intraday는 1일 동안 3회 실험한 결과를 가지고 구하였다. 그리고 interday는 10일 동안 반복 실험한 결과를 가지고 측정하였다.
정밀도는 각각의 농도에서 측정된 값들을 비교하여 구하였으며, 그 결과는 변동계수(coefficient of variance, % CV)로 나타냈다. 그리고 정확도는 각 농도의 표준액을 분석하여 얻은 측정농도(calculated concentration) 와 첨가농도(nominal concentration)를 비교하여 구하였다. 그 결과는 편중값(%, bias)으로 나타냈다.
농도 1 µg/mL 표준용액을 이용하여 검정곡선 작성용 표준액을 1.2 (LLE는 1.3), 2, 5, 10, 20, 50 ng/mL 의 농도로 제조하였다. 검정곡선 작성용 표준액은 대조 소변 3 mL에 각각의 농도에 맞추어 표준용액을 첨가하여 질소 하에 증발시킨 후, 각각의 농도에 내부 표준용액(THCCOOH-d3, 1 µg/mL) 30 µL를 첨가하여 실험을 실시하였다.
대마 흡연자 소변을 증류수와 대조 소변으로 각각 희석하였을 때 기질의 영향에 의한 농도 변화를 확인 하였다. 이는 남용 빈도가 많은 흡연자의 경우 정량 농도범위 이상(50 ng/mL)에 해당되는 시료들이 많아 정량 분석시 희석이 필요하기 때문이다.
본 연구 결과로부터 우리는 대마 흡연자의 소변 중에 포함된 대마 대사체 성분 THCCOOH를 SPE 방법을 이용하여 추출하고, GC/MS로 신속하게 분석 할 수 있는 방법을 개발하였다. 기존 LLE 방법과 개발한 SPE 방법을 비교 검토한 결과 SPE 방법은 LLE 방법에 비하여 처리과정이 간편하고 처리 시간도 짧으며, 추출된 잔류물도 상대적으로 깨끗하였다.
검정곡선 작성용 표준액은 대조 소변 3 mL에 각각의 농도에 맞추어 표준용액을 첨가하여 질소 하에 증발시킨 후, 각각의 농도에 내부 표준용액(THCCOOH-d3, 1 µg/mL) 30 µL를 첨가하여 실험을 실시하였다. 실험은 SPE와 LLE 각각의 시료 처리 방법과 동일하게 처리하고 분석하여 검정곡선을 작성하였다.
따라서 성분의 분리와 감도를 향상시키기 위해서는 카르복실기와 수산화기를 비극성 성질로 전환해 주는 유도체화 과정이 필요하다. 이를 위해 유도체 시약(BSTFA/1% TMCS)을 사용한 TMS 유도체를 합성하여 분석하였다. Table 1은 대마 대사체인 THCCOOH-2 TMS와 내부표준물질 THCCOOH-d3-2 TMS의 검출 이온과 머무름 시간을 나타낸 것이다.
정밀도(precision)와 정확도(accuracy) 실험은 대조 소변에 농도 1 µg/mL 표준용액을 이용하여 5, 15, 40 ng/mL의 농도가 되도록 각각 첨가한 후 시료 처리방법과 동일한 방법으로 처리하고 분석하여 측정하였다. 정밀도는 각각의 농도에서 측정된 값들을 비교하여 구하였으며, 그 결과는 변동계수(coefficient of variance, % CV)로 나타냈다.
회수율 실험은 대조 소변에 농도 1 µg/mL 표준용액을 이용하여 5, 15, 40 ng/mL의 농도가 되도록 각각 첨가한 후 시료 처리방법과 동일한 방법으로 처리하고 분석하였다. 회수율은 대조 소변에 표준용액을 첨가하여 추출 한 후 분석한 결과와 대조 소변을 추출 한 후 표준용액을 첨가하여 분석한 결과를 상호 비교하여 구하였다.
희석 배율은 증류수와 대조 소변을 각각 사용하여 5, 10, 20으로 하였다. 흡연자 소변을 증류수와 대조 소변으로 각각 희석하여 준비한 시료를 SPE 방법에 따라 3회 추출하고 GC/MS로 분석한 후, 희석하지 않은 흡연자 소변의 농도와 비교하여 회수율을 구하였다.
이는 남용 빈도가 많은 흡연자의 경우 정량 농도범위 이상(50 ng/mL)에 해당되는 시료들이 많아 정량 분석시 희석이 필요하기 때문이다. 희석 배율은 증류수와 대조 소변을 각각 사용하여 5, 10, 20으로 하였다. 흡연자 소변을 증류수와 대조 소변으로 각각 희석하여 준비한 시료를 SPE 방법에 따라 3회 추출하고 GC/MS로 분석한 후, 희석하지 않은 흡연자 소변의 농도와 비교하여 회수율을 구하였다.
대상 데이터
)은 미국 Cerilliant사에서 구입하였다. 고체상 추출용 cartridge는 양이온 교환수지(60 mg)가 충진된 미국 Waters사 MCX cartridge를 사용하였다. 유도체 시약으로 N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) 에 1% trimethylchlorosilane(TMCS) 첨가된 혼합 시약을 미국 Alltech사에서 구입하였다.
분석 전 시료는 4℃의 저온 냉장고에 보관하였다. 그리고 대조 소변 시료는 대마를 흡연한 사실이 없는 38세 건강한 남자 소변을 채취하여 사용하였다.
분석기기는 미국 HewlettPackard사의 HP 6890 Series Gas Chromatograph/HP 5973 Mass Selective Detector를 사용하였으며, 시료 자동주입기는 HP 6890 series injector를 사용하였다. 분석 칼럼은 미국 Agilent Technologies사의 DB-5MS(30 m×0.25 mm I.D., 0.25 µm film thickness) 를 사용하였다. 운반기체는 헬륨 가스를 사용하였으며, 유속은 0.
가 사용되었다. 분석기기는 미국 HewlettPackard사의 HP 6890 Series Gas Chromatograph/HP 5973 Mass Selective Detector를 사용하였으며, 시료 자동주입기는 HP 6890 series injector를 사용하였다. 분석 칼럼은 미국 Agilent Technologies사의 DB-5MS(30 m×0.
연구에 사용된 시료는 전국 검찰청 마약수사팀에서 의뢰한 대마 흡연자로 의심되는 시료 중 예비감식방법인 형광편광면역반응측정(TDx) 결과가 양성인 31명의 소변에 대해 적용하였다. 분석 전 시료는 4℃의 저온 냉장고에 보관하였다.
25 µm film thickness) 를 사용하였다. 운반기체는 헬륨 가스를 사용하였으며, 유속은 0.7 mL/min으로 하였다. 칼럼 온도는 200℃에서 1분간 유지시킨 후 290℃까지는 30℃/ min 속도로 온도를 높이고, 그 후 300℃까지는 35℃/min 속도로 승온 한 다음 2분 동안 유지시켰다.
고체상 추출용 cartridge는 양이온 교환수지(60 mg)가 충진된 미국 Waters사 MCX cartridge를 사용하였다. 유도체 시약으로 N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) 에 1% trimethylchlorosilane(TMCS) 첨가된 혼합 시약을 미국 Alltech사에서 구입하였다. 추출과정에 사용된 용매 및 시약은 모두 특급시약을 사용하였다.
표준물질 11-nor-9-carboxy-∆9 -tetrahydrocannabinol (THCCOOH)과 중수소가 치환된 내부표준물질 11-nor-9-carboxy-∆9 -tetrahydrocannabinol-d3 (THCCOOHd3 )은 미국 Cerilliant사에서 구입하였다. 고체상 추출용 cartridge는 양이온 교환수지(60 mg)가 충진된 미국 Waters사 MCX cartridge를 사용하였다.
데이터처리
정밀도(precision)와 정확도(accuracy) 실험은 대조 소변에 농도 1 µg/mL 표준용액을 이용하여 5, 15, 40 ng/mL의 농도가 되도록 각각 첨가한 후 시료 처리방법과 동일한 방법으로 처리하고 분석하여 측정하였다. 정밀도는 각각의 농도에서 측정된 값들을 비교하여 구하였으며, 그 결과는 변동계수(coefficient of variance, % CV)로 나타냈다. 그리고 정확도는 각 농도의 표준액을 분석하여 얻은 측정농도(calculated concentration) 와 첨가농도(nominal concentration)를 비교하여 구하였다.
회수율 실험은 대조 소변에 농도 1 µg/mL 표준용액을 이용하여 5, 15, 40 ng/mL의 농도가 되도록 각각 첨가한 후 시료 처리방법과 동일한 방법으로 처리하고 분석하였다. 회수율은 대조 소변에 표준용액을 첨가하여 추출 한 후 분석한 결과와 대조 소변을 추출 한 후 표준용액을 첨가하여 분석한 결과를 상호 비교하여 구하였다.
이론/모형
Table 3. The matrices effect of the concentration of a urine sample diluted with blank urine and deionized water on the recoveries of THCCOOH on the SPE method.
주입구와 검출기의 온도는 각각 250℃와 280℃로 설정하였다. 시료 주입은 splitless 모드 방식을 적용 하였으며, 이온 검출 방법은 selected ion monitoring 모드를 적용하였다.
성능/효과
7%로 측정되었다. LLE 및 SPE 방법 모두 검출한계(LOD)는 0.4 ng/mL로 동일하였으며, 정량한계 (LOQ)는 LLE 방법은 1.3 ng/mL, SPE 방법은 1.2 ng/ mL로 측정되었다. 정확도 실험결과 LLE 방법의 bias 값은 -7.
그러나 기존의 LLE 방법을 사용할 경우 추출과 원심분리 과정의 자동화가 어렵다. 개발한 SPE 방법은 LLE 방법에 비하여 처리시간이 단축되고, 깨끗한 추출 잔류물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 소변 처리과정의 자동화에도 적합하였다. 결론적으로, 대마 흡연자 소변에 SPE 추출방법과 GC/ MS에 의한 분석방법을 적용함으로써 간편하고, 신속 하게 흡연여부 확인이 가능하였다.
2. 검정곡선과 유효성 검정결과
검정곡선은 LLE와 SPE 방법 모두 정량범위 내에서 상관계수(r2) 0.999의 직선성을 나타냈다(Table 2)
. 회수율은 LLE 방법은 94.
개발한 SPE 방법은 LLE 방법에 비하여 처리시간이 단축되고, 깨끗한 추출 잔류물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 소변 처리과정의 자동화에도 적합하였다. 결론적으로, 대마 흡연자 소변에 SPE 추출방법과 GC/ MS에 의한 분석방법을 적용함으로써 간편하고, 신속 하게 흡연여부 확인이 가능하였다.
LLE 방법에 의한 회수율이 높아 정량값들이 일반적으로 SPE 방법 보다 높게 나타났다. 그러나 SPE 방법의 정량값들이 낮게 나타났지만, 검출한계가 0.4 ng/mL로 LLE 방법과 동일하게 측정되어, SPE 방법을 이용하여 소변 중 대마 흡연 여부를 확인하는 것은 문제가 되지 않음을 대마 흡연자 소변 분석결과로부터 알 수 있었다.
본 연구 결과로부터 우리는 대마 흡연자의 소변 중에 포함된 대마 대사체 성분 THCCOOH를 SPE 방법을 이용하여 추출하고, GC/MS로 신속하게 분석 할 수 있는 방법을 개발하였다. 기존 LLE 방법과 개발한 SPE 방법을 비교 검토한 결과 SPE 방법은 LLE 방법에 비하여 처리과정이 간편하고 처리 시간도 짧으며, 추출된 잔류물도 상대적으로 깨끗하였다. 대마 흡연여부 확인을 위하여 다수의 소변 시료를 신속·정확하게 처리해야 하는 마약류 감식 분야에서는 시료 처리과 정의 자동화가 필요하다.
그리고 증류수와 대조 소변의 서로 다른 기질에 따른 회수율 또한 큰 차이가 없었다. 본 결과로부터 두 기질을 이용하여 정량 농도범위 이상(50 ng/mL)의 대마 흡연자 소변을 일정 배율 이하로 희석하여도 농도 변화는 거의 없었다.
증류수와 대조 소변으로 대마 흡연자 소변을 각각 희석하여 분석한 결과를 Table 3에 나타내었다. 이들 두 기질에 의해 5, 10, 20배로 희석하여 분석한 농도를 희석하기 전의 농도와 비교한 결과 회수율은 96.8~99.4%로 나타났다. 그리고 증류수와 대조 소변의 서로 다른 기질에 따른 회수율 또한 큰 차이가 없었다.
1% 편차를 나타냈다. 정밀도 실험결과 LLE 방법의 CV 값은 2.1~4.5% 범위이고, SPE 방법은 4.5~8.3%범위로 유의성 있는 결과를 나타내고 있다.
2 ng/ mL로 측정되었다. 정확도 실험결과 LLE 방법의 bias 값은 -7.6~ -0.6% 편차를 나타냈으며, SPE 방법은 -8.6~ -0.1% 편차를 나타냈다. 정밀도 실험결과 LLE 방법의 CV 값은 2.
999의 직선성을 나타냈다(Table 2). 회수율은 LLE 방법은 94.1~96.1%, SPE 방법은 83.6~90.7%로 측정되었다. LLE 및 SPE 방법 모두 검출한계(LOD)는 0.
참고문헌 (20)
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H. Teixeira, P. Proenca, A. Castanheira, S. Santos, M. Lopez-Rivadulla, F. Corte-Real, E. P. Marques, and D. N. Vieira, Forensic Sci. Int., 146, Suppl : S61-63 (2004)
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