선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기능성 향장소재로서 활성이 기대되는 병풀을 초음파 병행 공정으로 추출하고, 이들 초음파 추출물의 향장활성을 일반 열수 추출물과 비교 분석함으로써 향장 활성에서 초음파 병행 공정의 효과를 확인하고자 실험을 수행하였다.
- 최근의 연구들을 통해 병풀의 추출물 및 유효성분인 asiaticoside가 저농도에서도 높은 콜라겐 생성 유도 효과 및 세포 증식의 촉진은 물론, 콜라겐 감소에 결정적 요인으로 작용하는 MMP (Matrix Metallo Proteinase)의 억제 효과를 나타내는 것이 보고되었다 (Gilchrest, 1989; Park and Kim, 1995). 따라서 본 연구에서는 피부 재생 촉진 및 유도 효과를 가지는 병풀의 효율적인 추출 공정으로 초음파를 병행한 추출 공정을 수행하고 그 효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Tyrosinase 억제 효과는 dopachrome방법 (Hearing, 1987)을 이용하여 측정하였다. 150 ㎕의 mushroom tyrosinase (150 unit), 225 ㎕의 2.5 mM L-tyrosine, 225 ㎕의 0.4 M Hepes buffer (pH 6.8), 그리고 300 ㎕의 ethanol 용액 혹은 시료 (1.0 ㎎/㎖) 용액을 섞은 후, 배양 전과 15분간 배양 후 각각의 흡광도를 475 ㎚에서 측정하여 억제되는 정도를 살펴보았다. Tyrosinase의 억제정도는 다음과 같이 계산하였다.
- 실험을 위해서는 mouse 유래 melanocyte인 Clone M-3 세포를 사용하였다. M-3 세포 접종 후 50 ㎍/㎖ 농도의 시료를 3일간 처리하고 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 세척하고, 각 well 당 1.0 ㎖의 1 N NaOH를 첨가한 후 교반하여 세포막을 융해함으로써 melanin 성분을 녹여 나오게 한 뒤, 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색 가시광선 영역인 400 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다.
- 5 × 105 cells/㎖의 농도로 35 ㎜ dish에서 약 80% confluency에 도달할 때까지 배양하였다. UV 조사 전에 원래의 배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지 내 serum 성분을 제거한 다음 UV등 (35W, UV, Coralife)에 필터를 이용하여 UVA (6.3 J/㎠)를 24시간 조사하였다. UVA 조사 후에는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 병풀 시료를 1.
- 3 J/㎠)를 24시간 조사하였다. UVA 조사 후에는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 병풀 시료를 1.0 ㎎/㎖의 농도로 투여하여 24시간 동안 배양하였다.
- , Korea)를 이용하여 60 ㎑의 초음파를 30분간 병행해 주었다. 각 시료들은 감압여과 후 농축 및 동결건조를 통해 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 4 M potassium tetraborate 100 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하여 끓는 수조에서 3분간 배양시킨 후 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 dimethyl aminobenzaldehyde 용액 (p-dimethyl amino-benzaldehyde 4 g, 100% acetic acid 350 ㎖ 및 10 N HCl 50 ㎖ 혼합액) 3.3 ㎖를 반응 혼합물에 첨가한 후 37℃ 수욕 상에서 20분간 배양한 후 585 ㎚서 흡광도를 측정하였다. 저해비율은 다음과 같이 계산하였다.
- Hyaluronic acid는 피부의 세균 침입이나 독성물질 침투를 막는 역할을 하는 다당류로 분해효소인 hyaluronidase의 작용으로 가수분해 된다. 따라서 hyaluronidase의 활성 억제를 통해 피부 면역을 증진할 수 있으며, 본 실험에서는 Rooster Comb에서 형성된 N-acetylglucosamine의 양을 분광광도계로 측정하여 시료의 hyaluronidase 억제 활성을 판단하였다. 0.
- 0 ㎎/㎖로 100 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10% (w/v) TCA (trichloroacetic acid) 100 ㎕를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치한 후 증류수로 5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.4% (w/v) SRB용액을 100 ㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 4~5회 정도 세척, 건조 시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540 ㎚에서 microplate reader (Thermo max, Molecular Devices, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 병풀 추출물의 초음파 병행 공정을 통한 향장활성 증진 효과를 확인하기 위해 병풀의 대표적 활성으로 알려져 있는 피부보호 효과 중 하나인 hyaluronidase 억제 활성을 확인하였다. Hyalurondase는 피부 보습 및 탄력 유지에 기여하는 hyaluronic acid의 분해효소로 피부면역 저해인자로 알려져 있다.
- urban) 초본은 2007년 4월 채취한 것을 지원받아 사용하였다. 시료는 지상부를 분리하여 사용하였으며 추출은 음건된 시료에 10배수의 에탄올과 증류수를 용매로 이용하여 각각 60℃와 100℃에서 24시간 동안 실시하였으며, 이들 중 절반은 다시 각각의 추출온도에서 초음파 발생기 (Asia Industry Co., Korea)를 이용하여 60 ㎑의 초음파를 30분간 병행해 주었다. 각 시료들은 감압여과 후 농축 및 동결건조를 통해 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 실험 대상 세포의 농도를 4~5 × 104 cells/㎖으로 96 well plate의 각 well에 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양 (37℃ 5% CO2)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖로 100 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.
- 4에 나타내었다. 양성대조군으로는 피부 재생 효과를 나타내는 것으로 알려진 collagen 중에서 시약으로 주로 사용되는 송아지 유래 collagen type I과 ascorbic acid를 사용하여 실험 비교하였다. 모든 병풀 시료가 첨가를 통해 0.
- 광노화에 의한 피부주름 생성에 중요한 역할을 담당하고 있는 MMP-1의 발현은 UVA에 의해 세포에서 JNK/p38의 활성도가 증가하고 전사인자인 AP-1의 활성도가 증가되는 신호전달 경로를 통해 증가되어 피부에서 교원질의 결핍을 초래한다고 알려져 있다. 이처럼 자외선에 의해 증가되는 MMP-1 발현에 미치는 병풀 추출 시료의 영향을 알아보고자 인간 섬유아세포에 UVA를 조사하고 시료를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 ELISA로 측정한 MMP-1 발현 저해 효과를 Fig. 3에 나타내었다.
- 추출물 투여를 통한 Clone M-3 세포의 melanin 생합성 및 세포 생존율을 알아보기 위하여 병풀 추출 시료를 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖의 농도로 3일간 처리하여 melanin 생성량을 측정하였다. 실험 결과 melanin 생성은 세포생존율 및 형태학적 변화와는 많은 관련성을 보이지 않았으며, 초음파를 병행한 에탄올 추출물 시료가 0.
대상 데이터
- 병풀 시료의 세포독성 및 MMP-1 발현 억제 실험은 인간 피부 섬유아세포인 CCD-986sk (KCLB, Korea)를 이용하여 확인하였으며, melanin 생성은 mouse melanocyte인 Clone M-3 세포 (ATCC, USA)를 이용하였다. 실험에 사용된 피부섬유아세포 및 melanocyte는 각각 DMEM과 RPMI 1640 배지에 10% heating-inactivated fetal bovine serum (FBS)를 첨가시켜 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 병풀 (Centella asiatica L. urban) 초본은 2007년 4월 채취한 것을 지원받아 사용하였다. 시료는 지상부를 분리하여 사용하였으며 추출은 음건된 시료에 10배수의 에탄올과 증류수를 용매로 이용하여 각각 60℃와 100℃에서 24시간 동안 실시하였으며, 이들 중 절반은 다시 각각의 추출온도에서 초음파 발생기 (Asia Industry Co.
- 세포배양에 사용된 배지 및 혈청은 Gibco (USA)로부터 구입하였고, Hepes buffer 및 gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 시약들은 Sigma로부터 analyzed guarantied 또는 regent grade로 구입하여 실험에 사용하였다.
- 병풀 시료의 세포독성 및 MMP-1 발현 억제 실험은 인간 피부 섬유아세포인 CCD-986sk (KCLB, Korea)를 이용하여 확인하였으며, melanin 생성은 mouse melanocyte인 Clone M-3 세포 (ATCC, USA)를 이용하였다. 실험에 사용된 피부섬유아세포 및 melanocyte는 각각 DMEM과 RPMI 1640 배지에 10% heating-inactivated fetal bovine serum (FBS)를 첨가시켜 배양하였다.
- , 2006). 실험을 위해서는 mouse 유래 melanocyte인 Clone M-3 세포를 사용하였다. M-3 세포 접종 후 50 ㎍/㎖ 농도의 시료를 3일간 처리하고 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 세척하고, 각 well 당 1.
- 피부 섬유아세포인 CCD-986sk를 1.5 × 105 cells/㎖의 농도로 35 ㎜ dish에서 약 80% confluency에 도달할 때까지 배양하였다.
데이터처리
- 각 실험의 결과는 triplicate determinations에 의한 Mean ± SD (Standard deviation)로 표시했으며 각 평균치 간의 차이는 Microsoft excel의 student t-test에 의해 p < 0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 억제 효과는 dopachrome방법 (Hearing, 1987)을 이용하여 측정하였다. 150 ㎕의 mushroom tyrosinase (150 unit), 225 ㎕의 2.
- UVA 조사에 의해 유도되는 MMP-1 발현량 측정은 Dunsmore등이 사용한 방법 (Dunsmore et al., 1996)을 이용하여 실시하였다. UVA 조사 전과 후의 시료를 각각 처리하여 24시간 배양한 배지를 96 well plate에 분주하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
- 병풀 시료의 세포독성은 병풀의 추출 성분이 피부외용제 및 주름개선용으로 주로 사용되는 것을 감안하여 인간 섬유 아세포인 CCD-986sk를 이용하여, 세포 단백질 염색을 통해 세포의 증식 및 독성을 측정하는 방법인 SRB (sulforhodamine B) assay (Doll & Peto, 1983)로 측정하였다.
성능/효과
- MMP-1은 UVA 조사를 통해 처리 전 대비 136.1%까지 증가하는 모습을 보였으나, 시료 첨가를 통해 증가가 억제되는 경향을 나타내었는데, 대부분의 시료 조건에서 농도에 비례하여 억제 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 가장 높은 억제 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 에탄올 추출물로 최대 시료 투여 농도인 1.
- 1%까지 증가하는 모습을 보였으나, 시료 첨가를 통해 증가가 억제되는 경향을 나타내었는데, 대부분의 시료 조건에서 농도에 비례하여 억제 활성이 증가하는 경향을 나타내었다. 가장 높은 억제 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 에탄올 추출물로 최대 시료 투여 농도인 1.0 ㎎/㎖에서 100.2%의 수치를 나타내 UVA를 조사하지 않은 대조군과 유사한 수치를 나타내었다. 이는 병풀 수용성 추출 시료가 MMP-1 발현 저해 활성을 가지고 있으며 초음파 병행을 통해서 그 효과가 추가적으로 증진될 수 있음을 나타내는 것이다.
- 2에 나타내었다. 결과를 통해 모든 시료조건에서 hyaluronidase가 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 저해 수준은 농도에 비례하여 증가하는 경향을 나타내었으며, 실험을 통해 시료에 따라 20~60%의 저해 활성을 나타내었다. 가장 높은 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 에탄올 추출물로 최대 시료 투여농도인 1.
- , 2008). 결과를 통해 최대 투여농도인 1.0 ㎎/㎖에서도 모든 조건의 시료가 정상세포의 생존율을 67% 이상으로 유지시킴에 따라 병풀 수용성 추출물 시료가 인간 정상 피부 섬유아세포에 대해 유의할만한 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
- 양성대조군으로는 피부 재생 효과를 나타내는 것으로 알려진 collagen 중에서 시약으로 주로 사용되는 송아지 유래 collagen type I과 ascorbic acid를 사용하여 실험 비교하였다. 모든 병풀 시료가 첨가를 통해 0.2 ㎎/㎖ 농도에서부터 50% 이상의 수치를 나타내었으며 농도 증가에 따라 억제 활성도 소폭 증가하는 경향을 나타내었다. 초음파를 병행한 추출물이 그렇지 않은 시료에 비해 5% 가량 높은 억제 활성을 나타내었으며, 특히 최고농도인 1.
- 5%로 가장 높은 값을 나타내었다. 반면 초음파를 병행한 시료들이 같은 농도에서 나타낸 29%가 가장 낮은 세포독성 수치였으며, 용매조건별로는 큰 차이를 보이지 않았으나 초음파를 병행한 추출물의 독성이 병행하지 않은 것에 비해 5~9% 감소된 수치를 보임에 따라 초음파 병행을 통해 세포독성의 저감이 가능할 것으로 사료된다. 이러한 결과는 기존의 연구결과에 미루어 보아 초음파 병행 공정을 통해 유도된 공동현상으로 추출물 내 독성성분의 변성 및 파괴가 일어나기 때문인 것으로 사료된다 (Kwon et al.
- 1은 인간 피부 섬유아세포인 CCD-986sk에 대한 병풀 추출 시료의 세포독성을 SRB assay로 측정하여 나타낸 것이다. 세포독성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 최대 투여농도인 1.0 ㎎/㎖에서 70℃ 에탄올 추출물이 32.5%로 가장 높은 값을 나타내었다. 반면 초음파를 병행한 시료들이 같은 농도에서 나타낸 29%가 가장 낮은 세포독성 수치였으며, 용매조건별로는 큰 차이를 보이지 않았으나 초음파를 병행한 추출물의 독성이 병행하지 않은 것에 비해 5~9% 감소된 수치를 보임에 따라 초음파 병행을 통해 세포독성의 저감이 가능할 것으로 사료된다.
- 0 ㎎/㎖의 농도로 3일간 처리하여 melanin 생성량을 측정하였다. 실험 결과 melanin 생성은 세포생존율 및 형태학적 변화와는 많은 관련성을 보이지 않았으며, 초음파를 병행한 에탄올 추출물 시료가 0.2~1.0 ㎎/㎖의 각 농도에서 각각 93.2%, 90.3%, 88.5%, 85.1%, 84.2%의 생성량을 나타내 다른 시료들과 비교해 근소한 차이로 가장 높은 생성 억제 효과를 나타내었다. 특히, 최고농도인 1.
- 6%의 가장 높은 억제활성을 나타내었다. 이는 병풀 유래 수용성 성분이 고농도의 처리를 통해 송아지로부터 분리한 콜라겐보다 높은 활성을 나타낸 것으로 피부재생, 피부 면역활성 및 항노화 성분을 가져 피부외상치료제로 이용되는 병풀이 향장제품으로도 적용 가능함을 시사하는 결과이다. 한편, 기존 tyrosinase 저해활성은 페놀함량 및 항산화 효과와 상관관계에 있음이 보고됨에 따라 병풀의 페놀함량 측정 연구도 함께 이루어져야 할 것으로 사료된다 (Lee et al.
- 7%를 나타낸 양성대조군 ascorbic acid에 비해 높은 생성 저해율을 나타내었다. 이를 통해 병풀 추출 시료가 melanin 생성량 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
- 2 ㎎/㎖ 농도에서부터 50% 이상의 수치를 나타내었으며 농도 증가에 따라 억제 활성도 소폭 증가하는 경향을 나타내었다. 초음파를 병행한 추출물이 그렇지 않은 시료에 비해 5% 가량 높은 억제 활성을 나타내었으며, 특히 최고농도인 1.0 ㎎/㎖에서는 초음파를 병행한 시료가 양성대조군으로 사용된 collagen type 1 및 ascorbic acid를 상회하는 결과를 나타내었다. 한 초음파를 병행한 에탄올 추출물의 경우 1.
- 2%의 생성량을 나타내 다른 시료들과 비교해 근소한 차이로 가장 높은 생성 억제 효과를 나타내었다. 특히, 최고농도인 1.0 ㎎/㎖에서 60℃ 에탄올 추출물 및 초음파를 병행한 에탄올 추출 시료가 각각 85.6%와 84.2%의 생성량을 나타냄에 따라 일반 100℃ 물 추출물을 제외한 모든 조건의 병풀 추출물이 86.7%를 나타낸 양성대조군 ascorbic acid에 비해 높은 생성 저해율을 나타내었다. 이를 통해 병풀 추출 시료가 melanin 생성량 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
후속연구
- 이상의 연구 결과를 통해 melanin 과다생성을 억제하면서 세포독성은 낮아야 하는 향장 미백소재로서 병풀의 활용 가능성이 매우 높을 것으로 사료된다.
- 이는 병풀 유래 수용성 성분이 고농도의 처리를 통해 송아지로부터 분리한 콜라겐보다 높은 활성을 나타낸 것으로 피부재생, 피부 면역활성 및 항노화 성분을 가져 피부외상치료제로 이용되는 병풀이 향장제품으로도 적용 가능함을 시사하는 결과이다. 한편, 기존 tyrosinase 저해활성은 페놀함량 및 항산화 효과와 상관관계에 있음이 보고됨에 따라 병풀의 페놀함량 측정 연구도 함께 이루어져야 할 것으로 사료된다 (Lee et al., 2006).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.