선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- , 1996). 따라서 본 연구에서는 조직재생 등을 통하여 생체면역에 높은 활성이 기대되는 병풀 추출물의 추출조건 및 용매에 따른 면역 활성을 탐색함으로써 병풀의 면역 기작 구명은 물론 면역제재로 사용을 위한 최적 추출 조건을 확립하고자 실험 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 1에 나타내었다. (A)는 병풀의 주요 활성물질로 알려져 있는 asiaticoside의 standard peak로 나머지 추출물의 peak와 비교하여 각 추출공정에 따른 활성성분의 용출 정도를 확인하였다. (B)는 일반적으로 천연물의 추출에 많이 이용되는 100℃ 물 추출물의 peak를 나타낸 것이고, (C)와 (D)는 각각 60℃에탄올 추출물과 이의 초음파 병행 추출물에 대한 분석 peak를 나타낸 것이다.
- ATCC로부터 분양 받은 NK-92MI cell을 α-MEM배지에 2 mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, 10-4M 2-mercaptoethanol, 12.5% fetal bovine serum (FBS) 와 12.5% horse serum (Myelocult)에 2 × 107 cells/㎖의 농도로 희석시켜 이용하였다.
- Cytokine은 IL-6와 TNF-α의 정량을 Chemicon (USA)사의 IL-6와 TNF-α 정량 kit를 사용하여 측정하였다.
- NK 세포의 활성 측정은 시료를 첨가한 면역 T세포의 배양액을 NK 세포에 첨가하여 나타나는 생육도의 변화를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 활성을 측정하였다. Table 3은 T세포에 각 시료를 첨가하여 배양한 후 그 배양액을 NK 세포에 첨가하였을 때 나타나는 NK 세포의 활성도를 조건별로 비교하여 나타낸 표이다.
- , 2007)에 사용된 초음파 추출 방법을 변형하여, 각 추출물을 다시 각각의 추출온도에서 초음파 발생기로 30분간 60 ㎑의 초음파를 병행하여 초음파 병행 추출물을 수득하였다. 각 시료들은 감압여과 및 농축 후 동결건조를 통해 분말을 얻어 수율을 측정하고 실험에 사용하였다.
- 각 추출공정을 통한 병풀 시료의 성분 차이를 알아보고자 천연물의 일반성분 분석에 통상적으로 사용되는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC; High-Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 병풀의 주요 활성물질로 알려져 있는 asiaticoside 및 각 추출공정을 통한 병풀 추출물의 peak를 얻고 상호 비교 분석을 시도하였다.
- 병풀 유래 성분은 피부치료에 효능이 입증되어 시판 피부외용제 등의 핵심 물질로 사용되고 있다. 따라서 피부면역 제재로 활성이 기대되는 병풀 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 인간 정상 섬유아세포인 CCD-986sk를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 세포독성은 3-(4,5-dimethythiazo-2-gl)-25-dipheny-tetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 mosmann 방법을 변형하여 실시하였다.
- 면역기능 증강 효과는 인간 면역 세포인 T cell (Jurkat)과 B cell (Raji)을 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 1.
- 면역세포 생육 증진 효과는 인간 면역 세포인 T cell (Jurkat, ATTC, USA)과 B cell (Raji, ATTC, USA)을 이용하여 검증하였다. 실험에 사용된 면역세포는 RPMI 1640배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK cell은 α-MEM배지에 2mM L-glutamine, 0.
- 면역증진 효과의 확인을 위해 인간 면역체계에서 중요한 역할을 담당하는 면역 B세포와 T세포를 이용하여 시료 첨가에 따른 생육도를 측정하고 생육 촉진 효과를 비교하였다. Fig.
- 따라서 피부면역 제재로 활성이 기대되는 병풀 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 인간 정상 섬유아세포인 CCD-986sk를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 세포독성은 3-(4,5-dimethythiazo-2-gl)-25-dipheny-tetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 mosmann 방법을 변형하여 실시하였다. CCD-986sk 세포를 2 × 104 cells/well 농도로 96 well plate에 접종한 후 각 well의 70~80% confluence 배양시점에 시료를 투여하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
- 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 1.0 × 104 cells/㎖의 농도로 조절한 후 시료를 투여하여 8일 동안 배양하면서 매일 각 well의 cell을 hemacytometer로 세포 수를 측정하여 생육도를 측정하는 방법을 사용하였다 (Kim et al., 2005).
- Urban)은 2007년 4월에 제주도에서 채취한 것을 전남대학교 생물학과로부터 지원받아 사용하였다. 시료는 음건하여 각각 10배의 증류수와 에탄올을 이용하여 각각 100℃와 60℃에서 24시간동안 추출하였으며, 초본류에 적용하여 생리활성의 증진이 가능한 것으로 보고된 초음파 병행 추출 연구 (Kwon et al., 2007)에 사용된 초음파 추출 방법을 변형하여, 각 추출물을 다시 각각의 추출온도에서 초음파 발생기로 30분간 60 ㎑의 초음파를 병행하여 초음파 병행 추출물을 수득하였다. 각 시료들은 감압여과 및 농축 후 동결건조를 통해 분말을 얻어 수율을 측정하고 실험에 사용하였다.
- 시료의 분석을 위해 100℃ 물 및 60℃ 에탄올 추출물과 60℃ 에탄올 추출 후 초음파를 병행한 추출물의 시료를 HPLC 분석용 water에 녹여 각각 100 ppm의 농도로 조제하고 0.2 ㎛ syringe filter로 여과하여 injection volume 20 ㎕로 측정하였다. HPLC 기기는 BIO-TEK instrument (Italy)사 HPLC 500 series의 BIO-TEK 522 controller Pump와 BIOTEK HPLC 535 UV Detector (214 ㎚)를 사용하였고, Column은 Alltech사의 Prevail C18 (5 ㎛, 4.
- 5 g/ℓ로 100 ㎕씩 첨가하여 다시 배양 (37℃, 5% CO2)하였다. 원심분리기를 이용하여 배양배지의 상층액을 취한 다음 450 ㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D값을 표준물질을 이용해 작성한 표준곡선과 비교하여 cytokine의 양을 측정하였다 (Han et al., 1998).
- 인간 T세포를 T-25 Flask에 배양하면서 sample을 투여한 후 증식정도를 관찰하면서 3~4번의 계대 배양 후 세포를 원심분리하여 상층액을 취하였다. NK-92MI cell을 24well plate에 4~5 × 10 피부 면역제재로 활성이 기대되는 병풀 추출물의 세포독성을 인간 섬유 아세포인 CCD-986sk를 이용하여 SRB방법으로 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다.
대상 데이터
- HPLC 기기는 BIO-TEK instrument (Italy)사 HPLC 500 series의 BIO-TEK 522 controller Pump와 BIOTEK HPLC 535 UV Detector (214 ㎚)를 사용하였고, Column은 Alltech사의 Prevail C18 (5 ㎛, 4.6 × 250 ㎜)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 병풀 (Centella asiatica L. Urban)은 2007년 4월에 제주도에서 채취한 것을 전남대학교 생물학과로부터 지원받아 사용하였다. 시료는 음건하여 각각 10배의 증류수와 에탄올을 이용하여 각각 100℃와 60℃에서 24시간동안 추출하였으며, 초본류에 적용하여 생리활성의 증진이 가능한 것으로 보고된 초음파 병행 추출 연구 (Kwon et al.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Alpha minimum essential medium (α-MEM)은 GIBCO (USA)사로부터 구입하였고, Hepes buffer는 SIGMA (USA)사에서 구입하여 사용하였다.
- 혈청은 GIBCO사의 fetal bovine serum과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다. 세포염색을 위한 sulforthodamineB (SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 면역세포는 RPMI 1640배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK cell은 α-MEM배지에 2mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, 10-4M2-mercaptoethanol, 12.5% fetal bovine serum (FBS)와 12.5% horse serum (Myelocult)을 첨가시켜 배양하였다.
- 6 × 250 ㎜)을 사용하였다. 이동상은 물과 메탄올 (50 : 50, v/v)의 혼합용액을 사용하였고, 유속은 0.40 ㎖/min 으로 흘려주었으며, asiaticoside standard는 Chromadex (USA)사로부터 구입하여 사용하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Alpha minimum essential medium (α-MEM)은 GIBCO (USA)사로부터 구입하였고, Hepes buffer는 SIGMA (USA)사에서 구입하여 사용하였다. 혈청은 GIBCO사의 fetal bovine serum과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다. 세포염색을 위한 sulforthodamineB (SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 결과를 통해 각 추출 공정에 따른 용출 성분에 차이가 있음을 확인할 수 있었다. (B)와 (C)의 비교를 통해 수율 측정에서와 마찬가지로 병풀의 수용성 성분이 물 보다 에탄올에 많이 용출되어 나온 것을 확인할 수 있었다. 에탄올 추출물의 HPLC peak는 물 추출물에 비해 분산된 양상을 보이는데, 이를 통해 물에 녹지 않았던 병풀의 일부 성분이 에탄올에 용출되어 나온 것으로 볼 수 있으며, 이는 물과 에탄올의 극성 차이 등에 기인하는 것으로 사료된다.
- Table 3은 T세포에 각 시료를 첨가하여 배양한 후 그 배양액을 NK 세포에 첨가하였을 때 나타나는 NK 세포의 활성도를 조건별로 비교하여 나타낸 표이다. 6일 동안 생육도를 관찰하였는데 모든 시료첨가 조건에서 대조구와 비교하여 증가된 생육도를 확인할 수 있었다. 가장 높은 활성을 나타낸 것은 60℃ 에탄올 추출물로 6일째 10.
- 가장 높은 활성을 나타낸 것은 60℃ 에탄올 추출물로 6일째 10.8 × 104 cells/㎖를 나타내어 9.8 × 104 cells/㎖를 나타낸 대조군에 비해 약 10%의 활성 증가를 확인할 수 있었다.
- 각 시료 첨가에 따른 B세포의 IL-6와 TNF-α의 분비량을 살펴보면 모든 첨가군에서 대조군에 비해 높은 분비량을 나타낸 것을 확인할 수 있으며, 그 중에서 초음파 병행 60℃ 에탄올 추출물이 6일째 각각 4.16 × 10−4 pg/cell과 4.74×10−4 pg/cell를 보이며 가장 많은 분비량을 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
- Table 2는 인간면역 세포의 생육 증강도를 뒷받침할 수 있는 자료로서 면역 세포들이 분비하는 cytokine (IL-6와 TNFα)의 분비량을 B, T cell에서 측정한 결과를 나타낸 것이다. 각 시료에 따른 cytokine 분비량은 면역세포 생육도와 유의적인 값을 나타내었다. 각 시료 첨가에 따른 B세포의 IL-6와 TNF-α의 분비량을 살펴보면 모든 첨가군에서 대조군에 비해 높은 분비량을 나타낸 것을 확인할 수 있으며, 그 중에서 초음파 병행 60℃ 에탄올 추출물이 6일째 각각 4.
- 73 × 10-4 pg/cell로 나타내 증진 효과를 나타냈다. 또한, 초음파 병행 에탄올 시료를 첨가한 면역 T세포의 분비물에 의한 NK 세포 활성에서도 10%의 생육증진효과를 나타내었다. 이를 통해 병풀의 에탄올 추출물이 면역 활성을 가지고 있으며 초음파 공정을 통해 활성의 증진이 나타날 수 있음을 확인하였다.
- 모든 시료가 대수기인 3~6일째 대조군에 비해 증가된 생육도를 나타내었으며 특히 초음파를 병행한 60℃ 에탄올 추출물은 6일째 가장 높은 11.3 × 104 cell/㎖를 나타내며 대조군에 비해 9.7% 이상 증진된 생육도를 보여주었다.
- 2에 나타내었다. 모든 시료에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 최대 투여농도인 1.0 ㎎/㎖에서 60℃ 에탄올 추출물이 32%로 가장 높은 값을 나타내었다. 용매조건별로는 큰 차이를 보이지 않았으나 초음파를 병행한 추출물의 독성이 병행하지 않은 것에 비해 5~9% 감소된 수치를 보임에 따라 초음파 병행을 통해 세포독성을 저감 시킬 수 있는 것으로 사료된다.
- 병풀의 추출 수율을 Table 1에 나타내었다. 모든 조건 중 초음파를 병행한 60℃ 에탄올 추출물이 10.41%로 일반 100℃ 물 추출에 비해 38% 이상 높은 추출 수율을 나타내었다. 특히 초음파 공정을 병행하지 않은 조건에서도 60℃ 에탄올 추출물이 100℃ 물 추출물에 비해 높은 수율을 나타냄에 따라 병풀의 수용성 물질이 물보다 에탄올에 더욱 잘 용출되어 나오는 것으로 사료된다.
- 본 연구는 병풀의 초음파 추출 시 용매에 따른 면역활성 증진 효과를 탐색하고자 수행되었다, 각 추출공정의 수율 비교에서 초음파 공정을 병행한 60℃ 에탄올 추출이 일반 100℃물 추출에 비해 15% 높은 수율을 나타냈으며, 에탄올을 용매로 한 추출이 동일한 조건의 물 추출에 비해 모두 높은 수율을 나타냈다. 이는 용매의 극성과 용출되는 병풀 내 성분의 극성에 기인하는 것으로 사료된다.
- 73 × 10−4 pg/cell을 나타내며 다른 시료와 비교하여 대체로 많은 cytokine 분비량을 나타내었다. 생육도 측정에서와 마찬가지로 대조구에 비해 시료첨가구가 높은 cytokine 분비량을 나타내었으며, 초음파 병행 60℃ 에탄올 추출물, 초음파병행 100℃ 물 추출물의 순으로 많은 cytokine의 분비를 나타내었다. 이는 해당화의 뿌리 추출물을 통한 연구(Lee et al.
- 5는 T세포 생육에 따른 cytokine 분비와 NK세포의 생육 간의 관계를 나타낸 것으로 초음파를 병행한 60℃ 에탄올 추출물과 100℃ 물 추출물을 비교한 그래프이다. 시료 첨가에 따른 T세포의 cytokine 분비량과 NK세포의 생육 모두 100℃ 물 추출물에 비해 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물이 높게 나타난 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 시료 첨가를 통한 면역세포의 생육 및 cytokine 분비와 이를 통한 NK세포의 생육이 모두 비례관계에 있음을 확인할 수 있다.
- 0 ㎎/㎖에서 60℃ 에탄올 추출물이 32%로 가장 높은 값을 나타내었다. 용매조건별로는 큰 차이를 보이지 않았으나 초음파를 병행한 추출물의 독성이 병행하지 않은 것에 비해 5~9% 감소된 수치를 보임에 따라 초음파 병행을 통해 세포독성을 저감 시킬 수 있는 것으로 사료된다. 또한 이는 초음파 병행 공정을 통한 공동현상으로 추출물 내 독성성분의 변성 및 파괴가 일어나기 때문인 것으로 사료된다.
- 5 × 104 cells/㎖를 나타내며 측정기간 동안 대체적으로 높은 생육도를 나타내었다. 이는 면역증진 활성을 가지는 것으로 알려진 황칠나무 잎의 추출물 첨가를 통한 연구 (Lee et al., 2002)에서 나타난 22~27%의 생육 증진에는 미치지 못하는 결과이나 낮은 농도에서도 유의적인 수치를 나타내는 것으로 보아 고농도에서는 가시적인 면역증강 효과를 나타낼 것이 기대되며 낮은 세포독성을 가지는 것으로 고려하면 인간의 면역증진 측면에서 효과적임을 확인하였다.
- 이는 초음파 병행 공정을 통한 공동현상에 의한 높은 압력으로 세포 내부 조직이 파괴되어 지방질의 이동거리가 짧아지고 확산이 용이하게 일어나기 때문으로 사료된다 (Kim et al., 2001) 본 연구에서 수행된 결과들을 통해 병풀 추출물은 면역 활성을 나타내는 유용성분을 함유하고 있으며, 초음파 병행 공정을 통해 활성의 증진이 가능함을 확인하였다.
- 생육도 측정에서와 마찬가지로 대조구에 비해 시료첨가구가 높은 cytokine 분비량을 나타내었으며, 초음파 병행 60℃ 에탄올 추출물, 초음파병행 100℃ 물 추출물의 순으로 많은 cytokine의 분비를 나타내었다. 이는 해당화의 뿌리 추출물을 통한 연구(Lee et al., 2003) 등에서 보고된 면역세포 cytokine 분비와 유사한 수치로 병풀 추출물이 면역세포의 생육 증진 및 cytokine 분비량 증가를 통한 면역 활성 증진에 가능성이 있으며 나노입자화 공정을 통해 추가적인 증진 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 또한, 초음파 병행 에탄올 시료를 첨가한 면역 T세포의 분비물에 의한 NK 세포 활성에서도 10%의 생육증진효과를 나타내었다. 이를 통해 병풀의 에탄올 추출물이 면역 활성을 가지고 있으며 초음파 공정을 통해 활성의 증진이 나타날 수 있음을 확인하였다. 이는 에탄올 용매를 통해 병풀 유용성분의 용출이 증진되고, 초음파 공정을 통해 병풀 유용성분의 수율 향상 및 유용성분의 변화, 신규물질 용출 등이 일어나기 때문인 것으로 사료된다.
- 시료 첨가에 따른 T세포의 cytokine 분비량과 NK세포의 생육 모두 100℃ 물 추출물에 비해 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물이 높게 나타난 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 시료 첨가를 통한 면역세포의 생육 및 cytokine 분비와 이를 통한 NK세포의 생육이 모두 비례관계에 있음을 확인할 수 있다.
- 이상의 결과를 통해 병풀은 면역활성을 나타내는 성분을 함유하고 있으며 초음파병행 추출공정을 통해 유효성분의 면역활성 증진 효과를 기대할 수 있음을 확인하였다. 이는 초음파 병행 공정을 통한 공동현상에 의한 높은 압력으로 세포 내부 조직이 파괴되어 지방질의 이동거리가 짧아지고 확산이 용이하게 일어나기 때문으로 사료된다 (Kim et al.
- 인간 면역 B, T세포의 생육도 측정에서 초음파를 병행한 60℃ 에탄올 추출물이 무첨가 대조구에 비해 10%의 증진 효과를 나타내었으며, 면역세포의 cytokine 분비량 측정에서도 IL-6, TNF-α의 분비를 각각 4.86 × 10-4 pg/cell과 5.73 × 10-4 pg/cell로 나타내 증진 효과를 나타냈다.
- 이는 용매의 극성과 용출되는 병풀 내 성분의 극성에 기인하는 것으로 사료된다. 인간 정상 섬유아세포인 CCD-986sk를 이용한 세포독성 측정을 통해 모든 병풀 추출물이 32% 이하의 세포독성을 나타냈다. 인간 면역 B, T세포의 생육도 측정에서 초음파를 병행한 60℃ 에탄올 추출물이 무첨가 대조구에 비해 10%의 증진 효과를 나타내었으며, 면역세포의 cytokine 분비량 측정에서도 IL-6, TNF-α의 분비를 각각 4.
- 3으로 큰 차이는 아니지만 분자량 등 여러 가지 요인의 복합적인 결과가 나타난 것으로 보인다. 특히 초음파 공정을 병행한 (D) peak는 수율 측정에서와 마찬가지로 가장 높은 성분의 용출 및 다양한 성분 함량을 나타내었는데, 특징적으로 저분자 영역대의 용출이 증진된 것으로 확인할 수 있다. 이는 에탄올 용매에 따른 비극성 성분 용출 증진과 함께 초음파 공정을 통해 병풀의 수용성 성분이 변성 혹은 저분자로 잘라지기 때문인 것으로 사료된다(Kim et al.
- 또한 이는 초음파 병행 공정을 통한 공동현상으로 추출물 내 독성성분의 변성 및 파괴가 일어나기 때문인 것으로 사료된다. 특히, 결과를 통해 최대 투여농도인 1.0 ㎎/㎖에서도 모든 조건의 추출물이 정상세포의 생존율을 68% 이상으로 유지시키는 것으로 확인하였는데, 이는 식용으로도 널리 사용되는 사철쑥 추출물이 나타낸 세포독성 수치 (Kim et al., 2005)와 비슷한 결과로 병풀 추출물이 인간 정상 섬유아세포에 대하여 안전성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- , 2007). 따라서 추출공정에 따른 병풀의 유용활성 성분은 물보다는 에탄올을 용매로 이용하였을 때 보다 용이하게 용출되며 초음파 공정을 통해 수율 향상 및 신규물질의 용출을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- , 2001) 본 연구에서 수행된 결과들을 통해 병풀 추출물은 면역 활성을 나타내는 유용성분을 함유하고 있으며, 초음파 병행 공정을 통해 활성의 증진이 가능함을 확인하였다. 하지만 본 연구의 결과에서 피부재생 등 생체면역에 높은 활성을 나타내는 병풀 추출물이 면역세포를 통한 활성 측정에서 기대만큼의 높은 면역활성을 나타내지는 못한 만큼 병풀의 생체면역 기작을 확인할 수 있는 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.