국화 꽃 휘발성 향기성분의 식중독균에 대한 항균 작용 Antibacterial Action against Food-Borne Pathogens by the Volatile Flavor of Essential Oil from Chrysanthemum morifolium Flower원문보기
국화 정유의 식중독균에 대한 항균력을 검증하기 위해 국화 정유와 그 주성분인 camphor, chrysanthemyl alcohol, $\alpha$-pinene, $\gamma$-terpinene, ${\alpha}+{\beta}$-thujone를 10종 균주에 대하여 agar-well diffusion분석법으로 생육 여부를 분서하였다. 실험 결과 국화 정유와 그 지표물질은 Gram 양성균과 음성균 모두에 대해서 탁월한 항균 효과가 나타났다. Agar-well diffusion 분석법 결과 국화 정유와 그 지표물질은 Gram 음성균보다 Gram 양성균에 대해서 강력한 활성을 나타내었다. 국화 정유의 minimum inhibitory concentration은 모든 균주에 대하여 5 ${\mu}g/m{\ell}$에서 균의 생장을 저해하는 효과가 나타났고, minimum bacteriocidal concentration은 S. choleraesuis와 L. monocytogenes에 대해서는 시험농도 내에서 사멸효과가 관찰되지 않았으나, 다른 균주에 대해서는 5~20 ${\mu}g/m{\ell}$에서 살균력이 나타났다. 또한 액체 배양중의 항균효과를 조사한 결과, 국화 정유와 그 지표물질은 24시간 동안 꾸준히 항균력이 지속되었다. 따라서 camphor, chrysanthemyl alcohol, $\alpha$-pinene, $\gamma$-terpinene, ${\alpha}+{\beta}$-thujone를 조성분으로 함유한 국화 정유성분은 10종의 식중독균에 대한 항균활성이 입증되어, 천연 항균제재로서 식품보존료로의 이용이 가능하리라 생각된다.
국화 정유의 식중독균에 대한 항균력을 검증하기 위해 국화 정유와 그 주성분인 camphor, chrysanthemyl alcohol, $\alpha$-pinene, $\gamma$-terpinene, ${\alpha}+{\beta}$-thujone를 10종 균주에 대하여 agar-well diffusion 분석법으로 생육 여부를 분서하였다. 실험 결과 국화 정유와 그 지표물질은 Gram 양성균과 음성균 모두에 대해서 탁월한 항균 효과가 나타났다. Agar-well diffusion 분석법 결과 국화 정유와 그 지표물질은 Gram 음성균보다 Gram 양성균에 대해서 강력한 활성을 나타내었다. 국화 정유의 minimum inhibitory concentration은 모든 균주에 대하여 5 ${\mu}g/m{\ell}$에서 균의 생장을 저해하는 효과가 나타났고, minimum bacteriocidal concentration은 S. choleraesuis와 L. monocytogenes에 대해서는 시험농도 내에서 사멸효과가 관찰되지 않았으나, 다른 균주에 대해서는 5~20 ${\mu}g/m{\ell}$에서 살균력이 나타났다. 또한 액체 배양중의 항균효과를 조사한 결과, 국화 정유와 그 지표물질은 24시간 동안 꾸준히 항균력이 지속되었다. 따라서 camphor, chrysanthemyl alcohol, $\alpha$-pinene, $\gamma$-terpinene, ${\alpha}+{\beta}$-thujone를 조성분으로 함유한 국화 정유성분은 10종의 식중독균에 대한 항균활성이 입증되어, 천연 항균제재로서 식품보존료로의 이용이 가능하리라 생각된다.
The aim of this study was to investigate antibacterial activities of essential oil from C. morifolium against four Grampositive bacteria and six Gram-negative bacteria. The antibacterial activity of the oils was determined by agar-well diffusion assay, minimum inhibitory concentration(MIC), and mini...
The aim of this study was to investigate antibacterial activities of essential oil from C. morifolium against four Grampositive bacteria and six Gram-negative bacteria. The antibacterial activity of the oils was determined by agar-well diffusion assay, minimum inhibitory concentration(MIC), and minimum bactericidal concentration(MBC). Essential oil of C. morifolium had a large inhibition zones especially against Salmonella enterica(21 mm) and Bacillus cereus(19 mm). Essential oil of C. morifolium generally showed higher antibacterial activity against Gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria. MIC of essential oil from C. morifolium was 5 ${\mu}g/m{\ell}$ against ten food-borne pathogens. MBC values were determined to be from 5 to 20 ${\mu}g/m{\ell}$ against eight bacteria except Salmonella choleraesuis and Listeria monocytogenes. Therefore, the essential oil of C. morifolium and its components have a potent antibacterial activity against food-borne pathogens, and is expected to be used as a novel food preservative.
The aim of this study was to investigate antibacterial activities of essential oil from C. morifolium against four Grampositive bacteria and six Gram-negative bacteria. The antibacterial activity of the oils was determined by agar-well diffusion assay, minimum inhibitory concentration(MIC), and minimum bactericidal concentration(MBC). Essential oil of C. morifolium had a large inhibition zones especially against Salmonella enterica(21 mm) and Bacillus cereus(19 mm). Essential oil of C. morifolium generally showed higher antibacterial activity against Gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria. MIC of essential oil from C. morifolium was 5 ${\mu}g/m{\ell}$ against ten food-borne pathogens. MBC values were determined to be from 5 to 20 ${\mu}g/m{\ell}$ against eight bacteria except Salmonella choleraesuis and Listeria monocytogenes. Therefore, the essential oil of C. morifolium and its components have a potent antibacterial activity against food-borne pathogens, and is expected to be used as a novel food preservative.
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문제 정의
본 연구에서는 최근 몇 년간 우리나라에서 자주 발생한 식중독의 원인 균주를 대상으로(KFDA 2009) 국화꽃 정유성분의 항균활성에 대한 보고를 하고자 하며, 본 연구결과를 기초로 새로운 천연 식품 보존료의 탐색과 개발에 도움을 주고자 한다.
제안 방법
Agilent 6890 gas chromatography/5973 mass selective detector(Agilent Co., Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 성분분석을 실시하였고, camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, γ-terpinene, α+β-thujone를 지표물질로 사용하여 본 연구를 진행하였다.
국화 정유성분의 항균활성은 agar-well diffusion 분석법을 사용하여 분석하였다(Owen & Palombo 2007). 각 식중독균의 배양액(O.D.600=0.2～0.3) 100 ㎕를 spreader로 Nutrient agar(NA, Difco, MI, USA) plate의 표면에 균질하게 도말한 후, 멸균된 cork-borer(5 ㎜ diameter)를 사용하여 agar 표면에 well를 만들었다. 이 well에 국화 정유와 정유의 지표물질을 20 ㎕을 각각 가한 후, agar내로 정유 또는 지표성분들이 확산되도록 30분간 상온에서 방치 후, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.
Agar diffusion 법에는 paper disk 법과 agar well 법이 있는데, 항균활성을 지니는 물질이 agar 속으로 확산되어 그로 인한 항균활성을 inhibition zone의 크기로 결정하는 방법이다. 국화 정유에 대한 식중독균의 항균활성에 대한 조사를 위하여 기본실험으로 paper disk 법과 agar well 법을 사용하여 그 항균력의 크기를 비교한 결과, agar well 법이 국화 정유의 항균활성의 측정에 적합한 것으로 조사되어, agar well 법에 의한 항균활성을 측정하였다. 대상물질의 항균활성뿐만 아니라 agar 내로 확산이 어렵다든가 확산의 속도가 다르면, 대상물질의 agar well diffusion 법으로 측정한 항균활성의 정도가 달라지기 때문에 추가적으로 최소저해농도(MIC)와 최소사멸농도(MBC)를 이용하여 항균활성을 확인하였다.
)에 NB 100 ㎕, 국화 정유, 지표물질, 항생물질의 조제액 50 ㎕, 균 희석액 50 ㎕를 순차적으로 첨가한 뒤 4시간 마다 UV-spectrophotometer를 이용해 흡광도 값을 측정하면서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 균의 생육 곡선 상에서 균의 생장(turbidity)이 검출되지 않는 최소 농도를 MIC로 설정하였다.
국화 정유에 대한 식중독균의 항균활성에 대한 조사를 위하여 기본실험으로 paper disk 법과 agar well 법을 사용하여 그 항균력의 크기를 비교한 결과, agar well 법이 국화 정유의 항균활성의 측정에 적합한 것으로 조사되어, agar well 법에 의한 항균활성을 측정하였다. 대상물질의 항균활성뿐만 아니라 agar 내로 확산이 어렵다든가 확산의 속도가 다르면, 대상물질의 agar well diffusion 법으로 측정한 항균활성의 정도가 달라지기 때문에 추가적으로 최소저해농도(MIC)와 최소사멸농도(MBC)를 이용하여 항균활성을 확인하였다.
값으로 탁도를 측정하여 실험 결과를 도출함에 있어 지표물질이나 항생제가 무색인 것에 비해 고유의 색을 지닌 정유가 MIC를 결정하는 탁도에 영향을 미쳤기 때문이라 판단된다. 따라서 항균 효과는 하나의 분석법만으로 결정하기에 무리가 있어, 탁도에 영향을 미치지 않는 MBC를 측정하여 국화 정유와 그 주성분들의 항균활성의 근거를 확인하였다.
모든 실험은 3회 실시하였으며, agar well 주위로 미생물의 성장이 저해되는 clear zone의 크기(㎜)를 caliper로 측정하여 항균력의 크기를 계산하였다(Fazeli 등 2007). 또한 정유시료를 제조한 dimethyl sulphoxide(DMSO; St. Louis, MO, USA)를 음성 대조군으로 사용하였고, 항생제인 ampicillin, streptomycin을 양성 대조군으로 사용하였다.
이 well에 국화 정유와 정유의 지표물질을 20 ㎕을 각각 가한 후, agar내로 정유 또는 지표성분들이 확산되도록 30분간 상온에서 방치 후, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 모든 실험은 3회 실시하였으며, agar well 주위로 미생물의 성장이 저해되는 clear zone의 크기(㎜)를 caliper로 측정하여 항균력의 크기를 계산하였다(Fazeli 등 2007). 또한 정유시료를 제조한 dimethyl sulphoxide(DMSO; St.
3(대략 1×107 CFU/㎖) 되게 농도를 일정하게 조정한 후 사용하였다. 배지는 균주의 특성에 맞게 제조하여 121℃, 1.5기압 하에서 15분간 멸균하였고, 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
국화 시료로부터 정유(essential oil)는 steam distillation method(G'omez & Witte 2001)를 사용하여 추출하였다. 음건한 국화 시료를 24시간 동안 Clevenger-type apparatus(Hanil Labtech Ltd., Incheon, Korea)를 사용하여 추출한 후, 다시 24시간 동안 anhydrous sodium sulfate 중에서 건조시켰다. Agilent 6890 gas chromatography/5973 mass selective detector(Agilent Co.
대상 데이터
국화 정유, 지표물질, 항생물질을 DMSO로 희석하여 0～20 ㎍/㎖ 농도로 희석하였다. 각각의 균주는 농도를 O.D.600=0.2로 조절한 후 본 실험에 사용하였다. 96-well plate(Falcon, USA.
본 실험에 사용된 Gram 양성균 4종, Gram 음성균 6종과 각각의 배양 조건을 Table 1에 나타내었다. 각 균주는 35% glycerol medium을 사용하여 －70℃에서 저장, 보관하였다.
실험 균액은 UV-spectrophotometer(SpectraMax M2, Molecular Decives, USA)를 이용하여 600 ㎚에서의 O.D. 값이 0.2～0.3(대략 1×107 CFU/㎖) 되게 농도를 일정하게 조정한 후 사용하였다.
실험에 사용된 국화(Chrysanthemum morifolium)는 꽃 부위를 경상남도 생약농업협동조합에서 2009년 9월에 구입 후 음건하여 실험 재료로 사용하였다. 국화 정유성분의 지표물질로서 camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, γ-terpinene, α+β-thujone의 화합물과 항생제 대조군으로 ampicillin, streptomycin을 Sigma-Aldrich Inc.
Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 모든 용매들은 특급으로 Wako Pure Chemical Industries(Japan)으로부터 구입하였다.
국화 정유의 각 식중독 균주에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 분석은 broth-dilution method를 사용하여 수행되었다(Mann & Markham 1998; NCLLS 1999; Yu 등 2004).
항균활성을 측정할 때 일반적으로 agar diffusion 법을 사용한다. Agar diffusion 법에는 paper disk 법과 agar well 법이 있는데, 항균활성을 지니는 물질이 agar 속으로 확산되어 그로 인한 항균활성을 inhibition zone의 크기로 결정하는 방법이다.
성능/효과
Agar well diffusion 분석법에서 확인된 것과 동일하게 α-pinene과 α+β-thujone은 식중독균의 생장을 강력히 저해하는 것으로 나타났다.
국내산 국화 정유와 지표물질 camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, γ-terpinene, α+β-thujone과 항생제 대조군인 ampicillin, streptomycin의 Gram 양성 식중독균 4종과 Gram 음성 식중독균 6종을 대상으로 한 항균활성을 Table 2에 나타내었다. Bacillus cereus에 대한 국화 정유의 inhibition zone은 19 ㎜로 Gram 양성균주 중에서는 가장 큰 항균 활성을 나타내었고, 이는 대조군인 항생제 ampicillin과 streptomycin보다도 더 강하게 작용했다. 지표물질인 camphor(15.
7 ㎜) 또한 다른 균주들에 비해 더 큰 활성을 나타냈고, 특히 α-pinene(31 ㎜)과 α+β-thujone(29 ㎜)은 매우 큰 활성을 나타내었다. Bacillus subtilis에 대하여는 inhibition zone이 17.3 ㎜로 다른 Gram 양성균에 비해서 비교적 강한 항균활성을 보였고, 역시 항생제 대조군인 ampicillin(13.5 ㎜), streptomycin(11 ㎜)보다 큰 활성을 보였다. 지표물질인 camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, γ-terpinene, α+β-thujone은 각각 13 ㎜, 10 ㎜, 26.
국화 정유와 그 주성분의 식중독 균주에 대한 최소사멸농도를 Table 4에 나타내었다. Gram 양성균인 Bacillus cereus와 Bacillus subtilis에 대한 국화 정유의 최소사멸농도는 10 ㎍/㎖이었고, Staphylococcus aureus에 대해서는 20 ㎍/㎖의 최소사멸농도로 보였다. Listeria monocytogenes에 대해서는 MBC 시험 농도(0～20 ㎍/㎖) 내에서 최소사멸농도가 관찰되지 않았다.
Listeria monocytogenes에 대해서는 MBC 시험 농도(0～20 ㎍/㎖) 내에서 최소사멸농도가 관찰되지 않았다. Gram 음성균은 Aeromonas hydrophila와 Salmonella enterica, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus에 대해서 10 ㎍/㎖ 이상에서 최소사멸농도가 조사되었고, Shigella sonnei에 대해서는 20 ㎍/㎖ 이상에서 최소사멸농도가 조사되었다. 다만 Salmonella choleaesuis에 대해서는 시험 농도(0～20 ㎍/㎖) 내에서 최소사멸농도가 관찰되지 않았다.
Listeria monocytogenes에 대해서는 국화 정유성분과 지표물질인 camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, γ-terpinene, α+β-thujone의 활성이 각각 13.3 ㎜, 9 ㎜, 9.3 ㎜, 29 ㎜, 11 ㎜, 16.5 ㎜로 나타났다.
나머지 Gram 음성균에 대한 국화정유 항균활성의 세기는 Aeromonas hydrophila(16.3 ㎜)>Vibrio parahaemolyticus(15 ㎜)>Vibrio vulnificus(14 ㎜)>Shigella sonnei(10.0 ㎜)의 순서였고, Salmonella choleaesuis에 대해서는 inhibition zone이 관찰되지 않았다.
반면, 항생제 대조군인 ampicillin과 streptomycin은 4시간째까지는 균의 생장이 약간 증가하다가 이 후 균의 생장이 없거나 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 국화 정유와 그 주성분은 식품에 천연 보존료로서 첨가되었을 때 균의 생장을 강력하게 저해하고, 24시간 이상 항균력을 지속하여 식품의 저장성을 증가시킬 것으로 기대된다.
또한 우리나라의 대표적인 식중독균인 Staphylococcus aureus에 대해서는 국화 정유성분이 13.7 ㎜, 지표물질인 camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, α+β-thujone가 각각 9.5 ㎜, 10 ㎜, 33.5 ㎜, 20.5 ㎜로 나타났으며, γ-terpinene에 대해서는 inhibition zone을 형성하지 않았다.
반면에 γ-terpinene은 agar well diffusion 분석법에서 미약한 항균력을 나타냈으나, MIC를 조사한 결과 식중독균의 생장을 강력히 저해하는 것으로 나타났다. 또한, 국화 정유의 식중독균에 대한 최소저해농도는 Gram 양성균과 Gram 음성균의 항균 활성 차이가 크게 나타나지 않았다. 이처럼 agar well diffusion 분석법과 MIC 결과의 차이로 시료물질의 항균활성뿐만 아니라 agar well diffusion에 있어 시료물질의 확산정도에 따라 항균활성의 차이가 생기기 때문이라고 판단되며, 지표물질이나 항생제의 항균력이 높게 나타난 것은 O.
모든 실험을 종합해 봤을 때, α-pinene과 α+β-thujone은 모든 균주에 대하여 다른 지표물질들에 비해서 탁월한 항균활성을 나타내었고, 이는 국화 정유성분의 항균활성에 가장 큰 영향을 미치는 물질이라고 판단된다.
식중독균의 생장곡선의 형태는 8시간까지 균의 생장이 급격히 감소되었다가 24시간까지 꾸준히 감소하는 경향을 보였다. 반면, 항생제 대조군인 ampicillin과 streptomycin은 4시간째까지는 균의 생장이 약간 증가하다가 이 후 균의 생장이 없거나 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 국화 정유와 그 주성분은 식품에 천연 보존료로서 첨가되었을 때 균의 생장을 강력하게 저해하고, 24시간 이상 항균력을 지속하여 식품의 저장성을 증가시킬 것으로 기대된다.
반면에 γ-terpinene은 agar well diffusion 분석법에서 미약한 항균력을 나타냈으나, MIC를 조사한 결과 식중독균의 생장을 강력히 저해하는 것으로 나타났다.
시험 용액 중 2.5 ㎍/㎖ 농도의 조제액을 24시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 국화 정유가 식중독 균의 생장에 미치는 영향을 검토한 결과, 모든 균주에 대해서 균의 생장을 저해하는 효과를 볼 수 있었다(Fig. 1). 국화 정유와 국화 정유의 주성분인 camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, γ-terpinene, α+β-thujone은 모든 균주에 대하여 생육저해 효과를 나타내었다.
모든 실험을 종합해 봤을 때, α-pinene과 α+β-thujone은 모든 균주에 대하여 다른 지표물질들에 비해서 탁월한 항균활성을 나타내었고, 이는 국화 정유성분의 항균활성에 가장 큰 영향을 미치는 물질이라고 판단된다. 식중독균의 생장곡선의 형태는 8시간까지 균의 생장이 급격히 감소되었다가 24시간까지 꾸준히 감소하는 경향을 보였다. 반면, 항생제 대조군인 ampicillin과 streptomycin은 4시간째까지는 균의 생장이 약간 증가하다가 이 후 균의 생장이 없거나 감소되는 것으로 나타났다.
이러한 국화 정유의 최소저해농도는 그 주성분인 camphor, chrysanthemyl alcohol, α-pinene, γ-terpinene, α+β-thujone의 경우 시험에 사용된 모든 식중독 균주에 대해 1.5~10 ㎍/㎖로 관찰되었고, 대조군인 항생제는 1.25 ㎍/㎖에서 최소저해농도를 보여 국화 정유의 성분이 식중독균의 최소저해농도에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
지표물질인 α-pinene, α+β-thujone은 Gram 음성균에서도 비교적 큰 활성을 나타내었으나 camphor, chrysanthemyl alcohol은 미약한 항균활성을 나타내었고, γ-terpinene은 항균활성을 나타내지 않았다.
지표물질인 camphor(15.2 ㎜), chrysanthemyl alcohol(12.5 ㎜), γ-terpinene(8.7 ㎜) 또한 다른 균주들에 비해 더 큰 활성을 나타냈고, 특히 α-pinene(31 ㎜)과 α+β-thujone(29 ㎜)은 매우 큰 활성을 나타내었다.
특히 국화 정유와 α-pinene과 α+β-thujone은 균의 생장을 탁월하게 저해하는 것으로 나타났다.
후속연구
본 연구 결과를 보충하기 위하여 좀 더 광범위한 식중독 유발 세균에 대한 검증이 필요할 것으로 사료되며, 여러 가지 식품의 형태에 적용하여 식품의 저장기간 동안에 생물, 물리, 화학적으로 어떤 효과를 발휘하는지도 연구되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국화 정유의 주요 휘발성 화합물에는 무엇이 있는가?
다만, 동종에 속하는 감국(Chrysanthemum indicum)은 면역계 질병, 고혈압 등의 질환의 개선에 대한 활성이 보고되었다(Cheng 등 2005; Shunying 등 2005). 국화 정유의 주요 휘발성 화합물로는 1,8-cineole, germacrene D, camphor, α-pinene, α-cadinol, camphene, pinocarvone, β-caryophyllene, 3-cyclohexen-1-ol, γ-curcumene 등이 보고된 바 있다(Jiang 등 2005; Wang 등 2008; Wang & Yang 2006).
감국의 활성 기능은?
국화과(Compositae family)의 대표적 식물인 국화(Chrysanthemum morifolium)는 많은 나라에서 다년생 정원수로 재배되는 식물로서, 정원의 식수나 식재료로 이용되고 있으나, 그 생리활성에 대한 연구는 미미한 실정이다. 다만, 동종에 속하는 감국(Chrysanthemum indicum)은 면역계 질병, 고혈압 등의 질환의 개선에 대한 활성이 보고되었다(Cheng 등 2005; Shunying 등 2005). 국화 정유의 주요 휘발성 화합물로는 1,8-cineole, germacrene D, camphor, α-pinene, α-cadinol, camphene, pinocarvone, β-caryophyllene, 3-cyclohexen-1-ol, γ-curcumene 등이 보고된 바 있다(Jiang 등 2005; Wang 등 2008; Wang & Yang 2006).
개발도상국뿐만 아니라 미국과 유럽 등에서도 발견되는 식중독균은?
최근 국민소득의 증가와 더불어 식생활 수준의 향상으로 식품의 안전성 및 식품첨가물에 대한 소비자의 관심이 크게 증가하였지만, 외식 및 급식의 이용이 증가하면서 이들 식중독균에 의한 발병이 증가하고 있는 실정이다(KFDA 2009). 개발도상국뿐만 아니라 미국과 유럽 등에서도 Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botulinum은 달걀, 쇠고기, 가금류 등의 낙농제품에서 발견되고 있다(Greig & Rave 2009; Tauxe 2002). 또한 식중독은 식중독균주의 직접적인 감염에 따른 위해성 외에도 식중독균과 부패미생물들이 과일, 야채, 곡물과 그 가공 식품 내에 배출하는 위험한 독성대사물질에 의해 질병을 유발하기도 한다.
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