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문제 정의
- 특히 Choi S 등(2008b)은 산초 정유의 식중독균에 대한 항균활성도 일부 보고하였는데, 본 연구에서는 최근 몇 년간 우리나라에서 자주 발생한 식중독 원인균주(KFDA 2009)를 중심으로 더욱 다양한 식품부패의 원인 균주들로 범위를 확장하고, 항균력을 검증하는 분석법을 더욱 다양하게 이용하여 산초 정유성분의 항균활성을 보고하였다. 본 연구결과를 기초로 천연 식품 보존제의 탐색과 개발에 도움을 주고자 한다.
제안 방법
- 각 식중독균의 배양액(O.D.600=0.2～0.3) 100 μL을 멸균된 spreader로 Nutrient agar(NA, Difco, MI, USA) plate의 표면에 균질하게 도말한 후, 멸균된 cork-borer(5 mm dia meter)를 사용하여 agar표면에 well을 만들었다.
- 96-well plate(Falcon, USA)에 NB 100 μL, 산초 정유, 지표물질, 항생물질의 조제액 50 μL, 균 희석액 50 μL를 순차적으로 첨가한 뒤 4시간 마다 UV-spectrophotometer를 이용해 흡광도 값을 측정하면서 24시간 동안 37°C에서 배양하였다. 균의 생육 곡선 상에서 균의 생장 (turbidity)이 검출되지 않는 최소 농도를 MIC로 설정하였다.
- 값으로 탁도를 측정하여 실험 결과를 도출함에 있어 지표물질이나 항생제가 무색인 것에 비해 고유의 색을 지닌 정유가 MIC를 결정하는 탁도에 영향을 미쳤기 때문이라 판단된다. 따라서 항균 효과는 하나의 assay이 만으로 결정하기에 무리가 있어, 탁도에 영향을 미치지 않는 MBC를 측정하여 산초 정유와 그 주성분들의 항균활성의 근거를 확인하였다.
- 모든 실험은 3회 실시하였으며, agar well 주위로 미생물의 생장이 저해되는 clear zone의 크기(mm)를 caliper로 측정하여 항균력의 크기를 계산하였다(Fazeli MR 등 2007). 또한 정유시료의 희석에 사용된 dimethyl sulphoxide (DMSO) (St. Louis, MO, USA)를 음성 대조군으로 사용하였고, 항생제인 ampicillin과 streptomycin을 양성 대조군으로 사용하였다.
- 이 well에 산초 정유와 지표물질을 10 μL을 각각 가하고, agar내로 정유 또는 지표성분들이 확산되도록 30분간 상온에서 방치 후, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 모든 실험은 3회 실시하였으며, agar well 주위로 미생물의 생장이 저해되는 clear zone의 크기(mm)를 caliper로 측정하여 항균력의 크기를 계산하였다(Fazeli MR 등 2007). 또한 정유시료의 희석에 사용된 dimethyl sulphoxide (DMSO) (St.
- 3(대략 107 CFU/mL) 농도로 일정하게 조정한 후 실험 균액으로 사용하였다. 배지는 균주의 특성에 맞게 제조하여 121℃, 1.5 기압 하에서 15분간 멸균하였고, 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
- 산초 정유의 식중독균에 대한 항균력을 검증하기 위해 산초 정유와 정유의 주성분인 citronellal와 limonene, geranyl acetate를 10종 균주에 대하여 agar-well diffusion assay와 MIC, MBC를 조사하였다. 실험 결과 gram 양성, 음성균 모두에 대해서 탁월한 항균 효과가 나타났다.
- 그 기본원리는 항균활성을 지니는 물질이 agar속으로 확산되어 그로 인한 항균활성을 inhibition zone의 크기로 결정하는 방법이지만, disk 확산법을 이용하였을 경우는 disk에 투여한 대상물질이 쉽게 휘발되거나, disk내로 응축되어 agar내로 확산되기 어려워, 대상물질의 항균력의 정확한 측정이 어려운 단점이 있다. 이에 산초 정유에 대한 식중독균의 항균활성 조사를 위하여 disk법과 agar well법을 사용하여 그 항균력의 크기를 비교한 결과, agar well법이 산초 정유의 항균활성의 측정에 더욱 적합한 것으로 판단되어 agar well법에 의한 항균활성을 조사하였다.
대상 데이터
- , Incheon, Korea)를 사용하여 추출한 후, 다시 24시간 동안 sodium sulfate anhydrous 중에서 건조시켰다. Agilent 6890 gas chromatography/5973 mass selective detector(Agilent Co., Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 성분분석을 실시한 결과 확인된 성분들 중에서 다량 함유되어 있으면서 항균성이 보고된 geranyl acetate, citronellel, limonene를 지표물질로 사용하였다(Lee J 등 2009, Lee M과 Chung M 2000).
- 산초 정유, 지표물질, 항생물질을 DMSO로 희석하여 0～20 μg/mL 농도로 희석하였다. 각각의 균주는 농도를 O.D.600=0.2로 조절한 후 본 실험에 사용하였다. 96-well plate(Falcon, USA)에 NB 100 μL, 산초 정유, 지표물질, 항생물질의 조제액 50 μL, 균 희석액 50 μL를 순차적으로 첨가한 뒤 4시간 마다 UV-spectrophotometer를 이용해 흡광도 값을 측정하면서 24시간 동안 37°C에서 배양하였다.
- 균주를 제외한 항균활성 실험에 사용된 모든 균주는 보관 균액 1 mL을 9 mL의 Nutrient Broth(NB, Difco, MI, USA)에, Vibrio sp. 균주는 3% NaCl을 첨가한 NB배지에 각각 접종하여 37℃에서 2회 계대배양하였고, UV-spectrophotometer(SpectraMax M2, Molecular Decives, USA)를 이용하여 O.D.=0.2～0.3(대략 107 CFU/mL) 농도로 일정하게 조정한 후 실험 균액으로 사용하였다. 배지는 균주의 특성에 맞게 제조하여 121℃, 1.
- 본 실험에 사용된 식중독 균주는 gram 양성균 4종(Bacillus cereus KCCM 11204, Bacillus subtilis KCCM 11316, Listeria monocytogenes KCCM 40307, Staphylococcus aureus KCCM 12214), gram 음성균 6종(Aeromonas hydrophila KCTC 2358, Salmonella choleaesuis KCCM 11806, Salmonella enterica KCTC 12400, Shigella sonnei KCTC 2009, Vibrio parahaemolyticus KCCM 11965, Vibrio vulnificus KCTC 2959)을 사용하였고, 각 균주는 Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM; Seoul, Korea)과 Korean Collection for Type Cultures(KCTC, Daejon, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 각 균주는 35% glycerol medium을 사용하여 -70°C에서 저장, 보관하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 모든 용매들은 특급으로 Wako Pure Chemical Industries(Japan)으로부터 구입하였다.
- 실험에 사용된 산초(Z. schinifolium)는 열매 부위를 경상남도 생약 농업 협동조합에서 2009년 9월에 구입 후 음건하여 실험 재료로 사용하였다. 산초 정유성분의 지표 물질로서(Lee J 등 2009, Lee M와 Chung M 2000) citronellal, geranyl acetate, limonene과 항생제 대조군으로 ampicillin, streptomycin을 Sigma-Aldrich Inc.
이론/모형
- 산초 열매로부터의 정유(essential oil)는 steam distillation method(G'omez NE와 Witte L 2001)를 사용하여 추출하였다.
- 산초 정유성분의 항균활성은 agar-well diffusion assay를 사용하여 분석하였다(Owen RJ와 Palombo EA 2007). 각 식중독균의 배양액(O.
- 산초 정유의 각 식중독 균주에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 분석은 brothdilution method를 사용하여 수행되었다(Mann CM과 Markham JL 1998, NCLLS 1999, Yu JQ 등 2004). 산초 정유, 지표물질, 항생물질을 DMSO로 희석하여 0～20 μg/mL 농도로 희석하였다.
성능/효과
- 실험 결과 gram 양성, 음성균 모두에 대해서 탁월한 항균 효과가 나타났다. Agar-well diffusion assay결과 산초 정유와 그 지표물질은 특히 gram 양성균에 대해서 강력한 활성을 보였다. MIC는 1.
- 국내산 산초 정유와 그 지표물질인 geranyl acetate, citronellal, limonene과 항생제 대조군인 ampicillin과 streptomycin의 gram 양성 식중독균 4종과 gram 음성 식중독균 6종을 대상으로 한 항균활성을 Table 1에 나타내었다. Bacillus cereus에 대하여 산초 정유의 inhibition zone은 31 mm로 실험 균주들 중에 가장 큰 항균활성을 보였고 이는 대조군인 항생제 ampicillin과 streptomycin보다도 더 강하게 작용했다. 또한 지표물질인 geranyl acetate(26 mm)와 limonene(19 mm), citronellal(18.
- 5 mm) 또한 다른 균주들에 비해 더 큰 항균활성을 나타냈다. Bacillus subtilis에 대하여는 inhibition zone이 16.5 mm으로 다른 gram 양성균에 비해서 비교적 작은 항균활성을 보였으나 역시 항생제 대조군인 ampicillin(14.5 mm), streptomycin(11.5 mm)보다는 큰 활성을 보였다. 지표물질인 limonene와 citronellal, geranyl acetate은 각각 14.
- Gram 양성균인 Bacillus cereus와 Bacillus subtilis에 대한 산초 정유의 최소사멸농도는 2.5 μg/mL이었고, Listeria monocytogenes와 Staphylococcus aureus에 대해서는 10 μg/mL의 최소사멸농도로 보였다.
- Gram 음성균은 gram 양성균에 비하여 산초 정유 성분에 대한 내성이 강하여 Aeromonas hydrophila와 Vibrio parahaemolyticus에 대해서는 10 μg/mL 이상에서, Salmonella choleaesuis와 Salmonella enterica, Vibrio vulnificus에 대해서는 20 μg/mL 이상에서 최소사멸농도가 조사되었다.
- 또한 우리나라의 대표적인 식중독균인 Staphylococcus aureus에 대해서는 산초 정유가 20 mm, 지표물질인 limonene과 citronellal, geranyl acetate가 각각 30 mm, 12 mm, 9 mm로 나타났다. Limonene은 Staphylococcus aureus에 대하여 정유성분과 다른 지표물질에 비해 강력한 항균활성을 갖는 것이 확인되었다.
- Listeria monocytogenes는 열과 산성 환경에 안정하고, 낮은 온도에서도 생육이 가능하여 육가공을 비롯하여 냉장, 냉동식품의 소비가 급증하면서 새로운 식중독세균으로 인식되고 있으며(Datta AR 2003), 특히 치사율이 높은 식중독균으로 알려져 있다(Kim HJ 2005). Listeria monocytogenes에 대해서는 산초 정유성분과 limonene, geranyl acetate, citronellal의 활성이 각각 19 mm, 21.5 mm, 12 mm, 8 mm으로 나타났고, 대조군인 항생제 ampicillin(18 mm)과 streptomycin(8 mm)보다 더 큰 활성을 보였다. 또한 우리나라의 대표적인 식중독균인 Staphylococcus aureus에 대해서는 산초 정유가 20 mm, 지표물질인 limonene과 citronellal, geranyl acetate가 각각 30 mm, 12 mm, 9 mm로 나타났다.
- MIC는 1.25 μg/mL에서 5 μg/mL 사이에서 균의 생장을 저해하는 효과가 나타났고, MBC는 2.5 μg/mL에서 20 μg/mL 사이에서 균이 완전히 사멸하는 살균력이 나타났다.
- 각각의 실험은 모두 3회 반복 실시하였으며, 그 평균과 표준편차를 나타내었다. 모든 통계처리는 SPSS ver.
- 나머지 gram 음성균에 대한 산초 정유 항균활성의 세기는 Salmonella enterica(13.5 mm) > Vibrio parahaemolyticus(12.5 mm) > Vibrio vulnificus(12 mm) > Salmonella choleaesuis(11 mm) > Shigella sonnei(11 mm)의 순서로 감소되는 양상을 보였다.
- 반면, 항생제 대조군인 ampicillin과 streptomycin은 4시간째까지는 균의 생장이 약간 증가하다가 이 후 균의 생장이 없거나 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 산초 정유와 그 주성분은 식품에 천연 보존제로서 첨가되었을 때 균의 생장을 강력하게 저해하고, 24시간 이상 항균력을 지속하여 식품의 저장성을 증가시킬 것으로 기대된다.
- 산초 정유와 산초 정유의 주성분인 citronellal과 geranyl acetate, limonene은 모든 균주에 대하여 매우 강한 생육저해 효과를 갖는 반면 Shigella sonnei에 대해서는 다소 약한 저해 효과를 나타냈다. 또한 다른 균에서 보여 지는 것과 달리 정유가 그 지표물질보다 균의 생장을 더욱 억제하는 것으로 나타났다. 식중독균의 생장곡선의 형태는 배양한지 4시간째 균의 생장이 급격히 억제되다가 24시간까지 꾸준히 억제시키는 경향을 보였다.
- 5 μg/mL에서 20 μg/mL 사이에서 균이 완전히 사멸하는 살균력이 나타났다. 또한 액체 배양 중의 항균효과를 조사한 결과 산초 정유와 그 지표물질은 배양시간에 따라 항균 효과가 관찰되었다. 따라서 citronellal와 limonene, geranyl acetate를 조성분으로 함유한 산초 정유성분은 10종의 식중독균에 대해 항균활성을 나타내어, 천연 항균제재로서 식품보존제로의 이용이 가능하리라 생각된다.
- 5 mm, 12 mm, 8 mm으로 나타났고, 대조군인 항생제 ampicillin(18 mm)과 streptomycin(8 mm)보다 더 큰 활성을 보였다. 또한 우리나라의 대표적인 식중독균인 Staphylococcus aureus에 대해서는 산초 정유가 20 mm, 지표물질인 limonene과 citronellal, geranyl acetate가 각각 30 mm, 12 mm, 9 mm로 나타났다. Limonene은 Staphylococcus aureus에 대하여 정유성분과 다른 지표물질에 비해 강력한 항균활성을 갖는 것이 확인되었다.
- 식중독균의 생장곡선의 형태는 배양한지 4시간째 균의 생장이 급격히 억제되다가 24시간까지 꾸준히 억제시키는 경향을 보였다. 반면, 항생제 대조군인 ampicillin과 streptomycin은 4시간째까지는 균의 생장이 약간 증가하다가 이 후 균의 생장이 없거나 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 산초 정유와 그 주성분은 식품에 천연 보존제로서 첨가되었을 때 균의 생장을 강력하게 저해하고, 24시간 이상 항균력을 지속하여 식품의 저장성을 증가시킬 것으로 기대된다.
- 1). 산초 정유와 산초 정유의 주성분인 citronellal과 geranyl acetate, limonene은 모든 균주에 대하여 매우 강한 생육저해 효과를 갖는 반면 Shigella sonnei에 대해서는 다소 약한 저해 효과를 나타냈다. 또한 다른 균에서 보여 지는 것과 달리 정유가 그 지표물질보다 균의 생장을 더욱 억제하는 것으로 나타났다.
- 시험 용액 중 2.5 μg/mL 농도의 조제액을 24시간 동안 배양하면서 4시간 간격으로 산초 정유가 식중독 균의 생장에 미치는 영향을 검토한 결과 모든 균주에 대해서 균의 생장을 저해하는 효과를 볼 수 있었다(Fig. 1).
- 또한 다른 균에서 보여 지는 것과 달리 정유가 그 지표물질보다 균의 생장을 더욱 억제하는 것으로 나타났다. 식중독균의 생장곡선의 형태는 배양한지 4시간째 균의 생장이 급격히 억제되다가 24시간까지 꾸준히 억제시키는 경향을 보였다. 반면, 항생제 대조군인 ampicillin과 streptomycin은 4시간째까지는 균의 생장이 약간 증가하다가 이 후 균의 생장이 없거나 억제되는 것으로 나타났다.
- 산초 정유의 식중독균에 대한 항균력을 검증하기 위해 산초 정유와 정유의 주성분인 citronellal와 limonene, geranyl acetate를 10종 균주에 대하여 agar-well diffusion assay와 MIC, MBC를 조사하였다. 실험 결과 gram 양성, 음성균 모두에 대해서 탁월한 항균 효과가 나타났다. Agar-well diffusion assay결과 산초 정유와 그 지표물질은 특히 gram 양성균에 대해서 강력한 활성을 보였다.
- 이러한 산초 정유의 최소저해농도는 그 주성분인 citronellal과 limonene, geranyl acetate의 경우, 시험에 사용된 모든 식중독 균주에 대해 1.25～2.5 μg/mL로 관찰되었고, 대조군인 항생제는 1.25 μg/mL에서 최소저해농도가 입증되었다.
- Gram 음성균에 대한 항균활성은 비교적 미약하였다. 지표물질인 citronellal과 limonene, geranyl acetate도 미약한 항균활성을 나타내었고, 특히, geranyl acetate는 Aeromonas hydrophila(7.5 mm)를 제외한 다른 gram 음성균에 대해서 agar plate 상에서는 항균활성을 나타내지 않았으며, limonene은 Aeromonas hydrophila(8.5 mm), Shigella sonnei(7.5 mm)를 제외한 다른 gram 음성균에 대해서는 inhibition zone을 나타내지 않았다. 또한 citronellal은 Salmonella choleaesuis에 대해서는 활성을 나타내지 않았다.
후속연구
- 본 연구 결과를 보충하기 위하여 좀 더 광범위한 식중독 유발 세균에 대한 검증이 필요할 것으로 사료되며, 여러 식품의 형태에 적용이 되었을 때 식품의 저장기간 동안에 생물, 물리, 화학적으로 어떤 효과를 발휘하는지도 연구되어야 할 것이다. 또한 식물의 정유 추출물과 그 지표물질 각각의 생리활성에 대한보고는 많이 되어있으나 성분들이 복합적으로 작용하였을 때 미치는 항균력의 크기를 비교하는 연구는 부족한 실정이므로, 각각의 지표 정유 성분들이 복합적으로 식중독균에 처리하였을 때, 항균효과가 더욱 강력하게 나타나는지를 검증하기 위한 연구도 계속 되어야 할 것이다.
- 산초는 식중독 균에 대하여 직접적으로 항균작용을 나타낼 뿐만 아니라 식품에 적용되었을 때 식품의 저장성을 증대시킨다고 판단된다. 본 연구 결과를 보충하기 위하여 좀 더 광범위한 식중독 유발 세균에 대한 검증이 필요할 것으로 사료되며, 여러 식품의 형태에 적용이 되었을 때 식품의 저장기간 동안에 생물, 물리, 화학적으로 어떤 효과를 발휘하는지도 연구되어야 할 것이다. 또한 식물의 정유 추출물과 그 지표물질 각각의 생리활성에 대한보고는 많이 되어있으나 성분들이 복합적으로 작용하였을 때 미치는 항균력의 크기를 비교하는 연구는 부족한 실정이므로, 각각의 지표 정유 성분들이 복합적으로 식중독균에 처리하였을 때, 항균효과가 더욱 강력하게 나타나는지를 검증하기 위한 연구도 계속 되어야 할 것이다.
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