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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 대량수확이 가능한 해양 생물인 불가사리의 산업적 활용의 일환으로 불가사리 체벽에 함유되어 있는 펩타이드가 가지는 면역 활성과 나노 입자화 기술을 접목해 탐색하고자 한다. 이에 생체활용성 증진효과 탐색을 위해 천연 면역 증진 효과가 기대되는 불가사리 유래 저분자 펩타이드 추출물을 기존의 피부에 바르는 소재 외에 식용 가능한 미용식품으로의 응용 가능성을 가지고 있는 젤라틴으로 나노입자로 제조하였다.
- 3과 같이 젤라틴으로 포집한 불가사리 저분자 펩타이드의 나노 입자 ALPG는 100-300 nm의 범위로 형성된 것을 알 수 있다. 본 논문에서는 나노 사이즈 시료의 세포 침투성 증진 효과를 가지는 것을 중점적으로 연구한 것이기 때문에 나노입자의 크기만을 측정하였으며, 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드 나노입자의 DLS 측정치가 균일한 분포를 가짐으로써 안정성이 있다고 평가할 수 있다. 평균 200 nm인 표피와 크기를 고려한다면 제조된 나노입자는 생체에 효과적으로 흡수 가능한 제형이라고 생각된다.
제안 방법
- 103-105 dalton의 분자량 부근을 용출할 수 있는 Sephadex G-75 (G-75-120, Sigma)로 여과하여 fraction 별로 구분한 불가사리 콜라겐 단백질은 MALDI-TOF MS(Voyager-DETM PRP, Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA)를 이용하여 분자량을 확인하였다(1).
- Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 0.25 µM에서부터 4 µM까지 DMEM 배지로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.
- PGE2 Express EIA Short kit를 이용하였으며, 항 PGE2 항체가 부착되어 있는 plate의 각 well에 회수한 상층액과 함께 PGE2-acetylcholinesterase tracer를 넣어 상온에서 18시간 배양하고, 각 well에 남아있는 용액을 말끔히 털어낸 후, 0.05% tween 20-phosphate buffer solution으로 각 well을 5회 세척하고 Ellman 시약 200 µL를 각 well에 넣은 후 7시간 배양하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 05% tween 20-phosphate buffer solution으로 각 well을 5회 세척하고 Ellman 시약 200 µL를 각 well에 넣은 후 7시간 배양하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. PGE2 를 표준품으로 검량선을 작성하여 각각의 시료를 처리한 배양액에서의 PGE2 생성량을 구하였다(14).
- TEM은 나노입자 한 개를 크게 확대하여 관찰하는 것도 가능하기 때문에 입자의 모양, 입자의 크기 등을 결정하는데 효과적으로 사용될 수 있다. TEM 사진을 찍기 위해서 phosphotungstic acid solution을 이용하여 negative staining을 하였다. 나노 입자가 충분히 염색이 된 후, formvar/carbon으로 코팅된 grid에 얇게 펴서 말린 뒤 EF-TEM(LEO 912AB OMEGA, Carl Zeiss, Jena, Germany), 120 kV에서 관찰 하였다.
- TEM 사진을 찍기 위해서 phosphotungstic acid solution을 이용하여 negative staining을 하였다. 나노 입자가 충분히 염색이 된 후, formvar/carbon으로 코팅된 grid에 얇게 펴서 말린 뒤 EF-TEM(LEO 912AB OMEGA, Carl Zeiss, Jena, Germany), 120 kV에서 관찰 하였다. 본 실험에서 불가사리 고유의 펩타이드는 A.
- 나노시료 첨가에 의한 면역세포 B cell(Raji)의 분포양상을 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scanning microscopy)을 통해 관찰하였다. 나노입자 제조를 위해 초음파 분산을 시작할 때, fluorescein isothiocyanate(FITC)를 넣어줌으로써 fluorescence tagging 염색을 하였다.
- 나노시료 첨가에 의한 면역세포 B cell(Raji)의 분포양상을 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scanning microscopy)을 통해 관찰하였다. 나노입자 제조를 위해 초음파 분산을 시작할 때, fluorescein isothiocyanate(FITC)를 넣어줌으로써 fluorescence tagging 염색을 하였다. 1 mL의 면역 B세포 2×108 cells/mL을 CO2농도 5%, 30°C의 incubator에서 배양한 후, FITC로 염색된 불가사리 젤라틴 나노시료(1 mg/mL) 100 µL와 1시간 동안 반응시켰다.
- 다음으로 세포 현탁액과 시료를 96 well 세포 배양관 각 well에 20 µL씩 첨가하고 37℃, 습도 5% CO2 배양기에서 UV filter(35W)를 이용하여 UVA(6.3 J/cm2)를 2시간 동안 조사하였다.
- 7 대식세포이며, 세포는 10% heat-inactivated bovine serum과 90% DMEM을 이용하여 24well plate에 4-5×104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가하거나 첨가하지 않고 5% CO2 incubator 안에서 37°C에서 48시간동안 배양하여 실험에 사용하였다. 대식세포에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitrite의 양을 microplate assay를 이용하여 정량함으로서 측정하였다. 먼저 시료를 처리하고 48시간 동안 세포를 배양하고 상등액 50 µL를 취하여 동일부피의 griess시약(1% sulfanilamide/0.
- 대식세포의 NOS(nitric oxide synthase)는 항상 존재하는 것이 아니라 TNF-α와 같은 여러 가지 cytokine과 lipopolysaccharide (LPS, derived from E. coli)와 같은 세균 내 독소의 영향을 받아 NOS 유전자의 발현이 유도되기 때문에 이번 실험에서는 시료를 LPS와 같이 투여하여 NO–의 생성능을 확인하였다.
- 면역 실험에서의 세포주는 면역세포 생육 증진 효과를 알 수 있는 인간 면역 세포인 B cell(Raji, ATTC, Rockville, MD, USA)을 이용하여 검증하였으며 RPMI 1640배지에 10% heat-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였다. 세포의 생육은 10% heat-inactivated FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37°C에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 6 well plate에 세포를 1.
- 배양이 완료 된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v) trichloroacetic acid(TCA)를 100 µL 가하여 4°C에서 1시간 동안 방치한 후 증류수로 4-5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1%(v/v) acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) SRB용액을 100 µL씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다.
- 나노 입자가 충분히 염색이 된 후, formvar/carbon으로 코팅된 grid에 얇게 펴서 말린 뒤 EF-TEM(LEO 912AB OMEGA, Carl Zeiss, Jena, Germany), 120 kV에서 관찰 하였다. 본 실험에서 불가사리 고유의 펩타이드는 A. amurensis peptide(AP)로, 초음파 공정을 통해 저분자화 한 불가사리 저분자 펩타이드는 low molecular AP(ALP)로, 젤라틴 제재로 포집한 불가사리 나노입자는 gelatine nano-encapsulated AP(ALPG)로 각각 표기하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)를 사용하였고, 그 밖에 배양에 필요한 시약으로 HEPES buffer(H4034, Sigma)와 fetal bovine serum(HYCLONE, SH30396, logan, UT, USA), gentamycin sulfate(Sigma, G1264), trypsinEDTA(GIBCO, 25200, Grand Island, NY, USA)를 사용하였다.
- 세포의 생육은 10% heat-inactivated FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37°C에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 6 well plate에 세포를 1.0×104 cells/mL의 농도로 조절한 후 시료를 투여하여 6일 동안 배양하면서 매일 각 well의 cell을 hemocytometer로 세포 수를 측정하여 생육도를 측정하는 방법을 사용하였다(13).
- 여과액의 부피를 줄이기 위하여 감압 농축 후, 동결건조기(Cleanvac 8B, Biotron, Bucheon, Korea)를 이용하여 −70°C, 0.1 torr에서 진공 동결건조하여 동해산 불가사리 유래 펩타이드 분말을 제조하였다(1).
- 둥근바닥플라스크에 정제된 젤라틴을 녹여 감압기를 사용해 multilayer를 형성시킨다. 완전히 건조되어 layer가 형성된 둥근바닥플라스크에 액상의 불가사리 추출시료를 넣고, 초음파 분산기를 이용하여 상온에서 2시간 동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다(10). 나노 입자의 확인을 위해 사용된 장치는 Transmission Electron Microscopy(TEM)이고, 나노 입자의 크기를 알아보기 위해서는 Dynamic Light Scattering(DLS, BENTHOS, USA) 장치를 사용하였다.
- 이 현탁액에 aspirin을 50 µM이 되도록 첨가하여 세포에 잔존하는 COX-2효소의 활성을 비가역적으로 억제시켜 PGE2 양을 동일하게 조절하였다.
- 5%의 구연산과 비타민 C를 가용화하여 변성점 이하인 20°C에서 골편과 골편에 붙은 콜라겐만 남도록 하였다(9). 이때 비 콜라겐 물질의 제거 및 콜라겐 수율 증진을 위해 골편을 초음파 추출기(Ultrasonic extraction system, Asia Industry, Incheon, Korea)에 넣어 콜라겐 변성점 이하의 온도에서 40 kHz의 초음파로 1시간 동안 초음파 공정을 병행하였다. 초음파 공정 시 초음파로 인한 열 발생을 방지하기 위하여 실시간으로 온도를 확인하고 20°C를 넘지 않도록 하였다.
- 이를 다시 증류수에 중량대비 0.5%의 구연산과 비타민 C를 가용화하여 변성점 이하인 20°C에서 골편과 골편에 붙은 콜라겐만 남도록 하였다(9).
- 초음파 공정 시 초음파로 인한 열 발생을 방지하기 위하여 실시간으로 온도를 확인하고 20°C를 넘지 않도록 하였다.
대상 데이터
- NO−생성능의 음성 대조구 물질로는 LPS를 사용하였다(12).
- 1 mL의 면역 B세포 2×108 cells/mL을 CO2농도 5%, 30°C의 incubator에서 배양한 후, FITC로 염색된 불가사리 젤라틴 나노시료(1 mg/mL) 100 µL와 1시간 동안 반응시켰다. 공초점 레이저 주사 현미경 LSM510 META NLO(Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany)으로 세포들을 관찰하였다(15).
- 본 실험에 사용한 불가사리는 우리나라 해안에서 가장 대표적 종인 Asterias amurensis로서 2008년 10월 강릉시 연안에서 채취한 것을 수세 후 잘라 동결 건조한 것을 사용하였다. 시료를 5cm 크기로 나누어 내피부위가 잘 드러나도록 자른 뒤 찬물에 침지하였다가 3% H2O2, 0.
- 불가사리 저분자 펩타이드에 관한 연구는 기존의 불가사리가 우리나라 연안해수의 환경평가(16), 칼슘활용 기술 개발(17), 중금속 제거(18) 등 환경적인 면에서 연구되어 온 것과 비교해 불가사리의 향장 산업에서의 잠재적 부가 가치를 증진시킬 수 있는 의미 있는 연구라고 할 수 있다. 본 연구에서는 Sephadex G75를 이용하여 수득한 총 100개의 fraction 중에서 fraction No. 25-30을 선택하여 실험에 사용하였다. 선택된 불가사리 fraction은 기존 연구결과(3)에서 세포 독성이 가장 낮고 UVA 처리 시 주름 발현 저해 효과가 가장 우수하게 나타난 범위의 fraction이며, 젤라틴으로 나노 입자화하여 면역 증진을 분석하기에 적합한 소재라고 생각되어 선택하였다.
- 사용된 세포주는 마우스 유래 RAW 264.7 대식세포이며, 세포는 10% heat-inactivated bovine serum과 90% DMEM을 이용하여 24well plate에 4-5×104 cells/well의 농도로 넣은 다음, 시료를 첨가하거나 첨가하지 않고 5% CO2 incubator 안에서 37°C에서 48시간동안 배양하여 실험에 사용하였다.
- 7(mouse, macrophage, 40071, KCLB)이다. 세포는 모두 DMEM에서 10% heat-inactivated FBS(fetal bovine serum)로 적응시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)를 사용하였고, 그 밖에 배양에 필요한 시약으로 HEPES buffer(H4034, Sigma)와 fetal bovine serum(HYCLONE, SH30396, logan, UT, USA), gentamycin sulfate(Sigma, G1264), trypsinEDTA(GIBCO, 25200, Grand Island, NY, USA)를 사용하였다. 실험에 이용된 세포주는 인간 섬유아세포인 CCD986sk(human, skin fibroblast, 21947, KCLB, Daejeon, Korea)과 RAW264.7(mouse, macrophage, 40071, KCLB)이다. 세포는 모두 DMEM에서 10% heat-inactivated FBS(fetal bovine serum)로 적응시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 대량수확이 가능한 해양 생물인 불가사리의 산업적 활용의 일환으로 불가사리 체벽에 함유되어 있는 펩타이드가 가지는 면역 활성과 나노 입자화 기술을 접목해 탐색하고자 한다. 이에 생체활용성 증진효과 탐색을 위해 천연 면역 증진 효과가 기대되는 불가사리 유래 저분자 펩타이드 추출물을 기존의 피부에 바르는 소재 외에 식용 가능한 미용식품으로의 응용 가능성을 가지고 있는 젤라틴으로 나노입자로 제조하였다. 해양저서 생물류 유래 불가사리 골편의 저분자화와 나노입자화를 통한 기능성 소재화 연구는 거의 전무한 실정으로 해양생물 연구의 기반 연구로서 작용할 것으로 기대된다.
- 인간 섬유아세포인 CCD-986sk 세포를 10% heat-inactivated FBS와 DMEM에 현탁하여 1×106 cells/mL로 조정한 뒤 37°C, 습도 5%의 CO2 incubator에서 24시간 배양하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 triplicate determinations에 의한 mean±SD로 표시했으며, 각 평균치 간의 차이는 ANOVA test에 의해 α=0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 완전히 건조되어 layer가 형성된 둥근바닥플라스크에 액상의 불가사리 추출시료를 넣고, 초음파 분산기를 이용하여 상온에서 2시간 동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다(10). 나노 입자의 확인을 위해 사용된 장치는 Transmission Electron Microscopy(TEM)이고, 나노 입자의 크기를 알아보기 위해서는 Dynamic Light Scattering(DLS, BENTHOS, USA) 장치를 사용하였다. TEM은 나노입자 한 개를 크게 확대하여 관찰하는 것도 가능하기 때문에 입자의 모양, 입자의 크기 등을 결정하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
- 세포독성 측정을 위해서 SRB assay를 이용하였다. Sulfor-hodamine B(SRB) assay는 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험 대상 세포인 CCD986sk의 농도를 10% heat-inactivated FBS media에서 4-5×104 cells/mL로96 well plate의 각 well에 100 µL씩 첨가하여 24시간 배양(37°C, 5% CO2)한 후, 불가사리 각각의 시료를 최종농도 0.
성능/효과
- 0 mg/mL까지 다섯 가지 농도로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, SRB 방법으로 측정한 세포독성이다. 결과에 나타낸 바와 같이 대부분의 시료가 농도 의존적으로 세포독성이 증가되는 양상을 나타냈으며, 최대 농도인 1.0 mg/mL에서 AP가 13.28%의 값을 나타내며 가장 높은 세포독성을 보였다. 반면 ALPG는 1.
- 결과에서 알 수 있듯 LPS와 RAW 264.7 세포주에 시료를 처리하여 배양한 후배양액 중에 NO– 농도를 측정한 결과 아무처리도 하지 않은 대조군과 비교했을 때 각 시료의 NO– 생산량에는 큰 변화를 관찰할 수 없었으나, 시료처리 후 높은 생성능을 확인하였다.
- 8은 confocal 현미경을 이용해 찍은 면역세포(Raji)의 사진으로서, 나타난 면역세포에서 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드 나노 입자의 침투효과를 확인할 수 있다. 둥근 형태의 면역 B 세포가 형광으로 염색한 나노 시료 처리 1시간 후 나노 시료의 침투로 세포 내의 전반적인 변화가 생겼음을 확인하였다. 따라서 제조한 나노 시료의 경우 입자의 크기가 50-200 nm로 분산됨에 따라 세포의 침투의 용이성이 일반 불가사리 펩타이드에 비해 뛰어난 것을 확인 할 수 있다.
- 54×104 cells/mL로 나타났다. 따라서 불가사리에는 면역세포의 생육을 증진 시키는 성분이 함유되어 있으며 콜라겐 펩타이드 상태에서는 비교적 낮은 생육을 보이지만 나노 제조 공정이 병행되면서 세포내의 침투가 용이해져 생육촉진을 높이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 세포내 투과 경로의 이점으로 인해 면역 세포 생육촉진이 가능해지는 것으로 사료된다.
- 둥근 형태의 면역 B 세포가 형광으로 염색한 나노 시료 처리 1시간 후 나노 시료의 침투로 세포 내의 전반적인 변화가 생겼음을 확인하였다. 따라서 제조한 나노 시료의 경우 입자의 크기가 50-200 nm로 분산됨에 따라 세포의 침투의 용이성이 일반 불가사리 펩타이드에 비해 뛰어난 것을 확인 할 수 있다. 100 nm 이하의 소수성 표면을 갖는 리포솜은 추출물의 분자성 약물의 운반을 용이하게 하여 세포에 대한 친화성이 증가하게 된다.
- 모든 추출물에서 높은 NO– 생성율이 보여지고 있으며 특히 ALPG에서 가장 높은 40 µM을 보여 주었다.
후속연구
- 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드를 젤라틴으로 나노입자화 했을 때 나노입자화하지 않은 경우보다 높은 NO− 생성율이 나타났으며 이는 나노 입자화를 통해 불가사리 유래 면역생리 활성성분이 대식세포의 활성을 높인 것으로 생각된다. 또한 저온 추출의 경우 나노 입자 제조 공정이 병행된다면 일반의 추출공정보다 추가적인 면역 활성의 증진가능성이 있다고 사료된다. Nitric oxide의 분비량은 곧 면역 물질의 분비량이므로, 불가사리 나노 입자 첨가군에서 NO–의 농도가 높게 나타남은 염증을 억제시키는 물질이 세포에서 효과적으로 작용함을 의미한다.
- 이에 생체활용성 증진효과 탐색을 위해 천연 면역 증진 효과가 기대되는 불가사리 유래 저분자 펩타이드 추출물을 기존의 피부에 바르는 소재 외에 식용 가능한 미용식품으로의 응용 가능성을 가지고 있는 젤라틴으로 나노입자로 제조하였다. 해양저서 생물류 유래 불가사리 골편의 저분자화와 나노입자화를 통한 기능성 소재화 연구는 거의 전무한 실정으로 해양생물 연구의 기반 연구로서 작용할 것으로 기대된다.
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