불가사리 골편의 콜라겐으로부터 활성 펩타이드를 분리하기 위하여 초음파를 처리하여 조직을 단편화 시키고 이후 collagnease를 처리하였다. 초음파를 처리할 경우 40kHz의 경우 38.89%의 수율을 나타내었다. 이후 펩타이드의 분자량을 측정하여 12, 20.6, 24, 43, 58a, 100, 116 kDa에서 특정 밴드를 보였다. 이후 Sephadex G-75 컬럼을 이용하여 fraction 별로 모아 사용하였다. 세포 독성을 측정하고 시료 처리 후 형태학적 관찰을 동반한 결과 24 kDa의 경우 최고 농도인 1.0 mg/mL에서 26.7%를 나타내었으며 4번의 계대 이후에도 형태학적 변화가 나타나지 않아 독성이 없다고 해석할 수 있다. 이후 UVA처리 후 MMP-1의 발현을 탐색한 결과 116 kDa부터 24 kDa까지 최고농도인 1.0 mg/mL에서 40, 46.3, 56.8, 57.9, 62.4%의 control 대비 저해율을 보였다. 외부적 스트레스인 UVA에 의한 AP-1의 활성도를 증가시키는 과정을 억제한 것으로 볼 수 있으며 결과적으로 MMP-1의 발현을 효과적으로 조절한 것이라 사료되어 향후 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드의 향장소재 활용 가능성이 높다고 할 수 있겠다.
불가사리 골편의 콜라겐으로부터 활성 펩타이드를 분리하기 위하여 초음파를 처리하여 조직을 단편화 시키고 이후 collagnease를 처리하였다. 초음파를 처리할 경우 40kHz의 경우 38.89%의 수율을 나타내었다. 이후 펩타이드의 분자량을 측정하여 12, 20.6, 24, 43, 58a, 100, 116 kDa에서 특정 밴드를 보였다. 이후 Sephadex G-75 컬럼을 이용하여 fraction 별로 모아 사용하였다. 세포 독성을 측정하고 시료 처리 후 형태학적 관찰을 동반한 결과 24 kDa의 경우 최고 농도인 1.0 mg/mL에서 26.7%를 나타내었으며 4번의 계대 이후에도 형태학적 변화가 나타나지 않아 독성이 없다고 해석할 수 있다. 이후 UVA처리 후 MMP-1의 발현을 탐색한 결과 116 kDa부터 24 kDa까지 최고농도인 1.0 mg/mL에서 40, 46.3, 56.8, 57.9, 62.4%의 control 대비 저해율을 보였다. 외부적 스트레스인 UVA에 의한 AP-1의 활성도를 증가시키는 과정을 억제한 것으로 볼 수 있으며 결과적으로 MMP-1의 발현을 효과적으로 조절한 것이라 사료되어 향후 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드의 향장소재 활용 가능성이 높다고 할 수 있겠다.
This study was carried out to investigate the anti-wrinkle effects of peptides derived from collagens isolated from Asterias amurensis, which was collected in the East Sea. The molecular weights of the peptides were between 10-50 kDa, as determined through sephadek G-75 gel. The cytotoxicities again...
This study was carried out to investigate the anti-wrinkle effects of peptides derived from collagens isolated from Asterias amurensis, which was collected in the East Sea. The molecular weights of the peptides were between 10-50 kDa, as determined through sephadek G-75 gel. The cytotoxicities against CCD-986sk cells and HEL-299 cells were measured using the MTT assay. The cytotoxicity of all the fractions(F1: Fraction No. 4-13, 116 kDa; F2: Fraction No. 25-30, 100 kDa; F3: Fraction No. 45-55, 58 kDa; F4: Fraction No. 59-63, 43 kDa; F5: Fraction No. 79-90, 24 kDa) was less than 25%, by the addition of 1.0 mg/mL. These peptides did not show any adverse effects on human skin cells. In the presence of F1 at 1.0 mg/mL, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) expression of UVA-induced human normal fibroblasts was reduced to 34.8%. Overall, the results seem to suggest that peptides of approximately 20 kDa have superior anti-wrinkle effects.
This study was carried out to investigate the anti-wrinkle effects of peptides derived from collagens isolated from Asterias amurensis, which was collected in the East Sea. The molecular weights of the peptides were between 10-50 kDa, as determined through sephadek G-75 gel. The cytotoxicities against CCD-986sk cells and HEL-299 cells were measured using the MTT assay. The cytotoxicity of all the fractions(F1: Fraction No. 4-13, 116 kDa; F2: Fraction No. 25-30, 100 kDa; F3: Fraction No. 45-55, 58 kDa; F4: Fraction No. 59-63, 43 kDa; F5: Fraction No. 79-90, 24 kDa) was less than 25%, by the addition of 1.0 mg/mL. These peptides did not show any adverse effects on human skin cells. In the presence of F1 at 1.0 mg/mL, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) expression of UVA-induced human normal fibroblasts was reduced to 34.8%. Overall, the results seem to suggest that peptides of approximately 20 kDa have superior anti-wrinkle effects.
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문제 정의
따라서 본 연구는 이러한 이점을 가진 초음파 병행 추출을 이용하여 불가사리로부터 처음으로 콜라겐 유래 활성 펩타이드를 정제하고 동시에 분자량별로 얻어진 분획물들의 피부주름 억제 활성을 탐색하여 산업적 가치를 부여하고 더 나아가 본 연구자료들이 향장소재와 관련된 분야에 활용을 위해서 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
처리하여 총 30일간 morphological test를하였다. 4일 간격으로 신선한 배지를 교환했으며 10일과 15일, 20일, 25일, 30일에 시료를 검경하여 비교하였다. FBS와 DMEM 의 양과 종류는 통일하여 오차가 없도록 하였다.
5x10, cells/mL의 농도로 35 mm dEh에 약 80%의 confluence] 도달할 때까지 배양하였다. UV 조사 전에 배지를 제거한 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 배지 내 serum 성분을 제거한 다음, LUX meter(DM-28, Takemura, Japan)을 이용하여 6.3J/cm2으로 맞추어 조사하였다. UVA 조사 후 배양 배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 분자량별로 모아진분획물을 lmg/mL의 농도로 투여하여 24시간 동안 배양하였다.
골편에 붙어있는 콜라겐의 저분자 펩타이드화를 위하여 colla-genase(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)를 중량대비 0.5% 첨가하여 상온에서 1시간 가수분해하여 펩타이드 용액을 얻어 감압 농죽 후, 동결 건조(Cleanvac8, Biotron, Bucheon, Korea; -70℃,0.1 torr)하여 불가사리 유래 펩타이드 분말을 제조하였다.
21947)으로 한국세포주은행(KCLB)로부터 동결 상태로 구입하였다. 구입한 HDFs를 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS; Hyclone, Texas, USA), 1% penicillin-streptomycin (Sigma Co.)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하여 사용하였다.
, M-2128) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정흐).는 Mosmann 방법(9)을 변형하여 실시하였다. 세포는 CCD-986sk와 인간 정상 폐세포인 HEL-299(KCLB No.
불가사리에서 분리된 펩타이드를 겔 여과를 이용하여 분자량별로 자동분주기로 받아낸 후 UV-spectrophotometer(UVIKON 922, Kontron Co, Korea)로 측정하였다. 이 때 Sephadex G-75 column을 사용하였고 유속은 0.
시료를 0.1 mg/mL에서 1.0mg/mL까지 다양한 농도로 처리하고, 48시간 동안 배양한 후 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. Fig.
5%의 구연산과 비타민 C를 가용화 하여 변성점 이하인 23℃에서 콜라겐만 붙어있는 골편을 얻었다(8). 얻은 골편을 초음파 추출기(Asia industry, Incheon, Korea)를 이용하여 콜라겐 변성점 이하의 온도에서 40, 60, 130kHz의 초음파로 1시간 동안 추출하였다. 이때 초음파 추출 시 발생되는 열로 인해 온도가 20℃ 이상 넘는 것을 방지하기 위하여 실시간으로 온도를 확인하였고, 온도 상승 시 얼음을 사용하여 온도를 유지하였다.
얻은 골편을 초음파 추출기(Asia industry, Incheon, Korea)를 이용하여 콜라겐 변성점 이하의 온도에서 40, 60, 130kHz의 초음파로 1시간 동안 추출하였다. 이때 초음파 추출 시 발생되는 열로 인해 온도가 20℃ 이상 넘는 것을 방지하기 위하여 실시간으로 온도를 확인하였고, 온도 상승 시 얼음을 사용하여 온도를 유지하였다.
알려져 있다(15). 이러한 UVA에 의해 발현이 증가되는 M&1P-1 에 미치는 불가사리 peptides의 영향을 알아보고자 HDFs에 UVA를 조사하고 시료를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 MMP-1 발현 저해 효과를 ELISA로 측정하여 Fig. 5에 나타내었다. 그 결과 시료를 첨가하는 농도에 의존적으로 MMP-1 발현 저해율이 높아져 최고 농도인 1.
이는 콜라겐의 변성을 최대한 방지하고 향장활성을 유지한 펩타이드로 생각할 수 있다. 이후 이 peptides를 분리하기 위하여 컬럼을 통한 분리공정을 실시하였다. Sephadex G-75에 의한 분자량별 fraction 검줄 결과는 Fig.
2 mg/mLS. 처리하여 총 30일간 morphological test를하였다. 4일 간격으로 신선한 배지를 교환했으며 10일과 15일, 20일, 25일, 30일에 시료를 검경하여 비교하였다.
초음파 처리 시 펩타이드화 효율을 알아보기 위하여 단백질 정량을 실시하였다. 이는 BCA kit(Pierce Co, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였으며 bovine serum albumin(Sigma Co.
펩타이드의 분자량은 강원대학교 공동실험실 습관의 MALDI-TOF-Mass spectrometer(Voyager-DE™ PRP, Perseptives Biosys tems, Framingham, MA, USA)를 이용하였으며 peptide 분석 시주로 사용되는 a-cyano-4-hydroxycimamic acid(a-CHCA) matrix 와 sinapinic acid matrix# 이용하였다.
형태학적 관찰은 섬유아세포인 CCD-986sk에 대한 직접적 영향을 알아보고 선행된 세포독성 실험의 결과를 뒷받침하기 위하여 시료처리 후 광학현미경(C-mount, Olympus Co, Tokyo, Japan)을 이용하여 총 30일간의 형태학적 관찰을 실행하였다(10). 섬유아세포를 75 T flask에 working volume을 30mL으로 통일하여 DMEM(FBS 5%) 배지로 CQ incubator에서 37℃, 4&시간 배양한 후 시료를 0.
대상 데이터
Enzyme-linked immunosorvent assay(ELISA)를 위해 사용된 MMP-1 에 대한 1차 항체와 alkaline phosphatase가 결합된 2차 항체는 Sigma사(Sigma Co.)로부터 구입하여 사용하였다. Human dermal fibroblasts(HDFs)는 CCD-986sk(KCLB No.
)로부터 구입하여 사용하였다. Human dermal fibroblasts(HDFs)는 CCD-986sk(KCLB No. 21947)으로 한국세포주은행(KCLB)로부터 동결 상태로 구입하였다. 구입한 HDFs를 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS; Hyclone, Texas, USA), 1% penicillin-streptomycin (Sigma Co.
본 실험에 사용한 불가사리는 우리나라 해안에서 가장 대표적 종인 A. ansrensis로써 2006년 10월경 강릉시 연안에서 채취하여 수세 후 내피부위가 드러나도록 잘라 동결 건조하여 보관하며 사용하였다.
는 Mosmann 방법(9)을 변형하여 실시하였다. 세포는 CCD-986sk와 인간 정상 폐세포인 HEL-299(KCLB No. 10137)를사용하였다. 각 세포를 2 X 10, cells/well 농도로 96-well plate에 접종한 후 각 well에 시료를 투여하여 CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다.
UVA 조사에 의해 유도되는 MMP-1 발현량 측정은 Dunsmore 등(11)이 사용한 방법을 실시하였다. UVA를 조사 후 시료를 처리하여 24시간 배양한 배지를 96 well plate에 분주하여 4℃에서 24시간 동안 coating하였다.
성능/효과
4%의 저해율을 보였다. 0.2mg/mL의 농도에서도 대조군 대비 75.8, 78.8, 81.6, 87.2, 89.1%< 보임으로써 확실한 UVA에 대한 효과가 있음을 나타내었다. 이는 외부적 스트레스인 UVA에 의해 발생된 JNK/p38 에서 AP-1 의 활성도를 증가시키는 과정을 억제한 것으로 볼 수 있으며 결과적으로 MMIM의 발현을 효과적으로 조절한 것이라사료된다.
10 kDa 이하의 분자량을 검출하는 a-CHCA matrix를 이용한 결과에서는 특정 피크가 나타나지 않았으며 위의 결과는 모두sinapinic acidS 이용한 것으로써 기존의 10 kDa 이하의 분자량을 보이는 일반적인 펩타이드의 분자량보다 높은 수치이다. 콜라겐은 단백질임에도 불구하고 단백질 가수분해 효소인 pepsin 등의 작용을 받기 힘들며 산 .
5에 나타내었다. 그 결과 시료를 첨가하는 농도에 의존적으로 MMP-1 발현 저해율이 높아져 최고 농도인 1.0mg/mL에서 F1 부터 F5까지 대조군과 비교하여 각각 40, 46.3, 56.8, 57.9, 62.4%의 저해율을 보였다. 0.
불가사리의 골편에 존재하는 콜라겐을 초음파와 collagenase로 가수분해하여 제조한 가수분해물 중 가장 높은 수율을 보인 40 kHz 초음파 병행 추출제조 펩타이드의 분자량을 MALDI-TOF- MS로 측정한 결과 12.3, 20.6, 24.6, 43.5, 58.9, 100, 116 kDa 부근에서 총 7곳에서 특정. intensity를 보였다.
1%< 보임으로써 확실한 UVA에 대한 효과가 있음을 나타내었다. 이는 외부적 스트레스인 UVA에 의해 발생된 JNK/p38 에서 AP-1 의 활성도를 증가시키는 과정을 억제한 것으로 볼 수 있으며 결과적으로 MMIM의 발현을 효과적으로 조절한 것이라사료된다. 또한, UVA 광조 시 발생하는 유리 라디컬의 제거도 MMP-1 의 발현에 영향을 주었으리라 사료된다.
형태학적 결과는 총 4 번의 계대 이후 관찰된 것이다. 일반적으로 물질이 세포에 부정적 영향을 미칠 경우 형태학적 변화가 수반되는 특징을 가지나(14), 본 실험에서는 유의적인 차이점이 발견되지 않아 형태학적 이상이 없음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 세포 수준에서 불가사리에서 초음파와 collagenase를 이용하여 추출한 peptides가 전혀 독성을 나타내지 않는 것으로 해석할 수 있다.
42%를 나타내었다. 초음파 비처리군과 비교하여 수율이 3-12% 정도가 증가하여 초음파 처리의 효소 작용에 긍정적 영향을 보여주었다. 이는 초음파 진동에 의한 공동현상(cavitation)에 의한 것으로 초음파로 인한 분자의 진동 에너지가 발생하여 콜라겐 조직에 연질화 효과를 준 것으로 사료된다.
초음파를 처리하지 않았을 때 26.10%, 40kHz의 초음파를 처리했을 때 최대 수율이 38.89%를 나타내었고 60kHz일 때 32.44%, 130kHz일 때 29.42%를 나타내었다. 초음파 비처리군과 비교하여 수율이 3-12% 정도가 증가하여 초음파 처리의 효소 작용에 긍정적 영향을 보여주었다.
후속연구
이는 외부적 스트레스인 UVA에 의해 발생된 JNK/p38 에서 AP-1 의 활성도를 증가시키는 과정을 억제한 것으로 볼 수 있으며 결과적으로 MMIM의 발현을 효과적으로 조절한 것이라사료된다. 또한, UVA 광조 시 발생하는 유리 라디컬의 제거도 MMP-1 의 발현에 영향을 주었으리라 사료된다. 따라서 각 peptides 에 관한 항산화 효과에 관한 연구 검토가 필요하다고 사료된다.
참고문헌 (15)
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