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문제 정의
- 현재 척수손상의 급성기에 중강도 저체온법을 적용하여 병리생리학적인 손상을 최소화시키려는 연구가 진행되고 있으나, 급성기 이후 임상에서 적용하고 있는 수중운동과 비교한 연구가 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 실험적으로 척수손상을 유발한 백서에 중강도 저체온법과 수중운동을 적용하여 신경학적 운동 행동 검사와 면역조직화학적 방법을 통해 운동기능회복에 미치는 효과를 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 신경학적 운동행동검사와 함께 실질적으로 척수손상부위의 신경회복정도를 관찰하기 위해 면역조직학적인 방법을 통해 BDNF발현량을 관찰하였다. 신경학적 운동행동검사에서, BBB 척도 검사는 대조군에 대해 14일에 대조군과 비교하여 실험군 Ⅱ과 실험군 Ⅲ이 통계학적으로 유의한 차이를 보였으며, 21일에는 대조군과 비교하여 실험군 Ⅰ, 실험군 Ⅱ, 실험군 Ⅲ이 통계학적인 유의한 차이를 보였다.
- 본 연구에서는 척수손상 후 중강도 저체온법과 수중 운동이 운동기능회복에 미치는 영향을 알아보기 위하여 척수손상 백서를 대상으로 실험하였다. 척수손상은 교통사고와 산업재해, 스포츠 손상 등으로 해마다 증가하고 있으며[24], 5년 마다 실시하는 장애인 실태조사에서도 전체 장애인의 증가율보다 지체장애인의 증가율이 높게 나타나고 있다[2].
- 본 연구에서는 척수손상 후 중강도 저체온법과 수중 운동이 운동기능회복에 미치는 영향을 알아보기 위하여 척수손상 백서를 대상으로 실험하였다. 척수손상은 교통사고와 산업재해, 스포츠 손상 등으로 해마다 증가하고 있으며[24], 5년 마다 실시하는 장애인 실태조사에서도 전체 장애인의 증가율보다 지체장애인의 증가율이 높게 나타나고 있다[2].
제안 방법
- HRP(Streptavidin/peroxidase)를 실온에서 10분간 처리하고 털어낸 다음 tap water로 씻어냈다. DAB로 발색하고, DW로 10분씩 3회 수세한 다음 최종적 보존 조직검사를 위해 Hematoxylin으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에 수세하고 80%, 90%, 100% 에탄올에 각각 10분, xylene에 2회씩 10분을 거쳐 탈수하였다. 그 후 모든 슬라이드를 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 각 실험군의 BDNF 발현량을 관찰하기 위해 슬라이드에 놓여진 척수절편을 5분간 3번의 xylene을 적용하여 파라핀을 제거하고, 100%, 90%, 80% 알코올을 단계 적으로 적용시켜 재수화(rehydration)하였다. tap water 로 짧게 rinse 한 후 PBS로 씻어내고, 3% H2O2로 5분간 반응 후 PBS로 씻어낸 후 남아 있는 고정액 성분을 제거하기 위하여 Blocking serum을 37℃에서 60분간 반응 후 털어냈다.
- 격자걷기 검사는 백서 후지의 운동조절 능력을 알아보기 위하여 평가하였으며, 1 m 길이의 격자막대(grid bar)를 지면에서 30 cm 높게 설치하고 격자에서 10걸음을 보고 그 중에서 실수하는 횟수를 세는 방법으로, 5회 반복 실시하여 평균값을 산출하였다.
- 9% 생리식염수로 심장관류 후 4% paraformaldehyde로 전고정하고, 척수손상 유발 부위의 피부와 근육을 절개하였다. 골절단기(bone cutter)로 척추를 자르고 척수를 적출하여 10% formalin에 넣어 2일간 고정한 후, 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하고, 미세절단기(Model SM 2000 R, Leica, Germany)로 두께 5 ㎛두께로 박절하였다.
- DAB로 발색하고, DW로 10분씩 3회 수세한 다음 최종적 보존 조직검사를 위해 Hematoxylin으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에 수세하고 80%, 90%, 100% 에탄올에 각각 10분, xylene에 2회씩 10분을 거쳐 탈수하였다. 그 후 모든 슬라이드를 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 본 연구에서는 척수손상 유발 후 3일, 7일, 21일에 척수를 채취하여 BDNF 발현정도를 관찰하였다. 시간이 지날수록 모든 실험군에서 BDNF의 발현량이 증가하였으며, 실험군 Ⅲ, 실험군 Ⅱ, 실험군 Ⅰ, 대조군 순으로 많은 BDNF 발현량을 관찰할 수 있었다[그림 1][표 4].
- 수중운동은 실내 온도가 25℃, 수온이 30～35℃로 유지된 원통형 수조(80×50×50 ㎝)에서 척수손상 유발 후 4일부터 실시하였다.
- 신경학적 운동행동 검사는 척수손상 후 저체온법과 운동의 기능회복에 미치는 영향을 알아보기 위해 척수 손상 유발 후 3일, 7일, 14일, 21일에 실시하였다.
- 온도는 25±1℃, 습도는 55 ±10%, 사료와 물은 자유롭게 먹도록 하고, 명암주기를 12시간으로 하였다. 실험군은 척수손상 유발 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군, 척수손상 유발 직후 저체온법을 적용한 실험군 Ⅰ, 척수손상 유발 후 수중운동을 실시한 실험군 Ⅱ, 척수손상 유발 직후 저체온법 적용한 후 수중운동을 실시한 실험군 Ⅲ으로 나누었다[표 1].
- 척수 손상 후 3일, 7일, 21일에 각 실험군의 BDNF의 발현량을 관찰하기 위해 척수를 채취하였다. 실험동물의 척수를 채취하기 위해 흡입전신마취 후 가슴을 절개하고 0.9% 생리식염수로 심장관류 후 4% paraformaldehyde로 전고정하고, 척수손상 유발 부위의 피부와 근육을 절개하였다. 골절단기(bone cutter)로 척추를 자르고 척수를 적출하여 10% formalin에 넣어 2일간 고정한 후, 파라핀 포매(paraffin embedding)를 실시하고, 미세절단기(Model SM 2000 R, Leica, Germany)로 두께 5 ㎛두께로 박절하였다.
- 실험동물의 척수손상을 유발하기 위해 실험동물을 마취 챔버(Royal medical, 한국)에 넣고, 70% N2O와 28.5% O2 가스에 1.5% 엔플루란(enflurane)을 혼합한 마취가스로 흡입전신마취 후 흉추 부위를 제모하고 수술대 위에 고정시켜 흉추 11번의 위치를 찾아 피부와 근막을 절개하고 흉추 11번의 주변 근육과 인대를 절개하여 수술용 가위와 집게 및 Bone cutter를 이용하여 추궁을 분리하고 척수를 노출시킨 후 실험동물을 NYU-spinal cord impactor(New York University-weight drop device, NY, USA)의 지름 2 ㎜, 무게 10 g의 충격막대에 수직으로 고정하고, 높이 25 ㎜ 지점에서 충격막대를 1회 떨어 뜨려 혈흔을 확인하여 척수손상을 유발한 후에 근육, 근막, 피부 순으로 봉합한 후 포비돈 요오드액으로 소독하고, 감염을 예방하기 위해 생리식염수에 희석한 겐타마이신(황산 겐타마이신, Korea) 0.2 ㎖을 대퇴부위에 주사하였다.
- 온도는 25±1℃, 습도는 55 ±10%, 사료와 물은 자유롭게 먹도록 하고, 명암주기를 12시간으로 하였다.
- 3℃의 정상체온을 체크하고, 얼음이 채워진 20×21×21 cm 크기의 단열아크릴상자에 넣어 냉각된 공기로 체온을 하강시키는 전신적 체표면 냉각방식을 이용하여[22], 32～34℃사이의 저체온 법을 24시간 유지하였다[20]. 직장체온은 전자식체온계 (Digital clinical thermometer, MT-B162A, Taiwan)로체크하였으며 24시간 후에는 실온에서 사육하였다.
- 척수 손상 후 3일, 7일, 21일에 각 실험군의 BDNF의 발현량을 관찰하기 위해 척수를 채취하였다. 실험동물의 척수를 채취하기 위해 흡입전신마취 후 가슴을 절개하고 0.
- 수중운동은 실내 온도가 25℃, 수온이 30～35℃로 유지된 원통형 수조(80×50×50 ㎝)에서 척수손상 유발 후 4일부터 실시하였다. 하루 10분씩 주 5회, 3주간 실시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 생후 8주령의 체중 250±20 g의 Sprague-Dawley계 백서(웅성, 중앙실험동물) 48마리를 사용하였으며.
데이터처리
- for windowsⓇ을 사용하였다. 각 측정항목들의 시간의 변화에 따른 효과, 그룹효과, 상호작용 효과의 유의성을 판정하기 위해 반복측정 분산분석(repeated measures ANOVA)을 이용하였다. 또한 반복측정 분산분석 결과를 보다 상세하게 해석하기 위하여 각 군별로 짝지은 표본의 t-검정을 이용하였다.
- 시간별 변화를 분석하였으며 이때, 결과의 해석은 Boferroni 보정을 통해 해석하였다(결과에 제시된 값은 보정 후의 값이다). 또 매 측정시점 마다 군간 차이를 알아보기 위해 일원배치 분산분석을 시행하였다. 통계학적 유의수준은 α= .
- 각 측정항목들의 시간의 변화에 따른 효과, 그룹효과, 상호작용 효과의 유의성을 판정하기 위해 반복측정 분산분석(repeated measures ANOVA)을 이용하였다. 또한 반복측정 분산분석 결과를 보다 상세하게 해석하기 위하여 각 군별로 짝지은 표본의 t-검정을 이용하였다. 시간별 변화를 분석하였으며 이때, 결과의 해석은 Boferroni 보정을 통해 해석하였다(결과에 제시된 값은 보정 후의 값이다).
- 또한 반복측정 분산분석 결과를 보다 상세하게 해석하기 위하여 각 군별로 짝지은 표본의 t-검정을 이용하였다. 시간별 변화를 분석하였으며 이때, 결과의 해석은 Boferroni 보정을 통해 해석하였다(결과에 제시된 값은 보정 후의 값이다). 또 매 측정시점 마다 군간 차이를 알아보기 위해 일원배치 분산분석을 시행하였다.
이론/모형
- 척수손상에 대한 약물효과가 명확하게 증명되지 못한 상황에서[26], 많은 연구자들이 척수손상 후 급성기의 체온상승이 사망률을 높이고 신경학적 기능장애를 증가시킨다는 사실을 알게 되면서, 척수의 병리생리학적 손상을 억제하기 위한 방법으로 중강도 저체온법에 대한 연구를 활발히 진행하고 있다[27]. 본 연구에서는 백서에 척수손상을 유발 시키기 위해 실험동물간의 오차를 줄여주고 일정하게 척수손상을 유발하는 NYU-spinal cord impactor를 이용한 외상성 척수손상모델을 사용하였다[28].
성능/효과
- 신경학적 운동행동 검사에서 BBB 척도 검사와 격자걷기 검사에서 14일과 21일에 중강도 저체온법과 수중운동을 복합시행한 군이 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이를 보였다. 면역조직화학적 평가에서도 BDNF의 발현량이 중강도 저체온법과 수중운동을 적용한 실험군에서 보다 많은 BDNF의 발현량을 관찰할 수 있어 척수 손상 후 중강도 저체온법과 수중운동은 2차 척수손상 기전을 억제하고 척수내의 자발적 손상조절능력의 촉진 및 BDNF 발현을 증가시켜 운동기능 회복에 효과적임을 알 수 있었다. 이상의 결과를 보아 중강도 저체온법과 수중운동이 척수손상 환자의 운동기능 회복에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과는 시간이 지나면서 모든 실험군에서 운동기능회복이 진행되고 있음을 알 수 있었다. 본 연구에서는 14일부터 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었는데, 손상 초기에는 손상 후 쇼크로 인하여 백서의 움직임이 제한적이고, 회복이 진행되었더라도 그 정도가 미약하여 신경학적 운동행동검사에서 유의한 차이를 관찰할 수 없었던 것으로 사료된다. 그러나 운동 기능회복이 계속적으로 진행되면서 손상 후 14일과 21일에 중강도 저체온법과 수중운동을 적용한 실험군에서 신경학적 운동행동검사와 면역조직학적 검사에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰된 것으로 생각된다.
- Neeper 등[34]은 운동이 BDNF의 발현량을 증가시켜준다고 하였으며, Oliff 등[19]은 규칙적이고 자발적인 운동이 생체 내의 BDNF를 증가시켜준다고 보고하였다. 본 연구에서는 중강도 저체온법과 수중운동을 적용한 실험군에서 높은 운동기능회복이 관찰되었고 이는 척수손상 후 급성기에 중강도 저체온법의 적용이 병리생리학적 손상을 감소시켜, 손상부위의 신경세포의 생존률을 증가시켜주고, 급성기 이후 적용한 수중운동이 손상부위의 혈액순환을 증진시켜 영양공급을 원활히 하여 신경회복과 신경연접의 재구성을 활성화한 것으로 생각된다.
- 김봉옥 등[30]은 척수손상 후 수중운동을 실시한 실험동물이 실시하지 않은 실험동물보다 빠른 운동기능회복을 보였다고 하였다. 본 연구에서도 신경학적 운동행동검사에서 중강도 저체온법과 수중운동을 적용한 실험군에서 통계적으로 유의한 운동기능회복을 보였으며, 중강도 저체온법보다 수중운동을 실시한 실험군에서 빠른 운동기능회복을 보였고, 중강도 저체온법과 수중운동을 함께 적용한 실험군에서는 보다 빠른 운동기능회복이 관찰되었다.
- 본 연구의 결과는 시간이 지나면서 모든 실험군에서 운동기능회복이 진행되고 있음을 알 수 있었다. 본 연구에서는 14일부터 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었는데, 손상 초기에는 손상 후 쇼크로 인하여 백서의 움직임이 제한적이고, 회복이 진행되었더라도 그 정도가 미약하여 신경학적 운동행동검사에서 유의한 차이를 관찰할 수 없었던 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 척수손상 유발 후 3일, 7일, 21일에 척수를 채취하여 BDNF 발현정도를 관찰하였다. 시간이 지날수록 모든 실험군에서 BDNF의 발현량이 증가하였으며, 실험군 Ⅲ, 실험군 Ⅱ, 실험군 Ⅰ, 대조군 순으로 많은 BDNF 발현량을 관찰할 수 있었다[그림 1][표 4].
- 본 연구에서는 척수손상 후 중강도 저체온법과 수중 운동이 운동기능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 척수손상 백서를 대상으로 실험하였다. 신경학적 운동행동 검사에서 BBB 척도 검사와 격자걷기 검사에서 14일과 21일에 중강도 저체온법과 수중운동을 복합시행한 군이 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이를 보였다. 면역조직화학적 평가에서도 BDNF의 발현량이 중강도 저체온법과 수중운동을 적용한 실험군에서 보다 많은 BDNF의 발현량을 관찰할 수 있어 척수 손상 후 중강도 저체온법과 수중운동은 2차 척수손상 기전을 억제하고 척수내의 자발적 손상조절능력의 촉진 및 BDNF 발현을 증가시켜 운동기능 회복에 효과적임을 알 수 있었다.
후속연구
- 면역조직화학적 평가에서도 BDNF의 발현량이 중강도 저체온법과 수중운동을 적용한 실험군에서 보다 많은 BDNF의 발현량을 관찰할 수 있어 척수 손상 후 중강도 저체온법과 수중운동은 2차 척수손상 기전을 억제하고 척수내의 자발적 손상조절능력의 촉진 및 BDNF 발현을 증가시켜 운동기능 회복에 효과적임을 알 수 있었다. 이상의 결과를 보아 중강도 저체온법과 수중운동이 척수손상 환자의 운동기능 회복에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 통해 척수손상 초기에 효과적이나 장기간 사용할 수 없는 중강도 저체온법과 급성기 이후에 실시할 수 있는 수중운동을 연결한 척수손상의 치료방법은 임상에서 척수손상 환자를 치료하는데 임상적 근거자료가 될 수 있을 것으로 생각되며, 향후 정확히 밝혀지지 않은 병태생리학적 손상기전과 저체온법의 대한 연구의 기초자료로 활용될 것으로 사료된다.
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