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문제 정의
- 본 연구에서는 고삼의 열수, 메탄올, 에탄올 추출물과 고삼에서 분리한 kurarinone의 구강미생물에 대해 항균력을 paper diffusion method와 MIC로 평가하였고, 각 추출물에 대한 성분분석을 통하여 kurarinone의 함량 변화가 고삼의 항균력에 기여하는지 살펴보았다.
- 본 연구에서는 한약재를 준비함에 있어 일반적인 열수를 이용한 탕제 외에 修治의 방법으로 술이 輔料로 사용되어져 왔다는 점에 착안하여 고삼을 물, 메탄올, 에탄올로 추출하여 3종의 구강미생물에 대한 항균활성을 평가하였으며, 각 추출물의 항균능의 차이가 kurarinone의 함량 변화에 기인하는지 조사하여 보았다. 고삼 물추출물이 항균활성을 나타내지 않은 반면, 메탄올과 에탄올추출물에서는 3종의 구강 미생물에 대해 항균능이 관찰되었다.
제안 방법
- 3종의 고삼 추출물은 C18 column을 사용하여, 용매A (0.1% formic acid in D.DW)와 용매B (0.1% formic acid in acetonitrile)를 기울기 변화로 (98:2→90:10→50:50→20:80→0:100→98:2) 흘려보내면서 AcQUITY UPLCTM System (Waters, UK)으로 분석하였다.
- 3종의 고삼추출물이 구강미생물에 대해 가지는 항균력을 비교하기 위해 고삼의 메탄올, 에탄올, 물 추출물을 1, 2㎎/disc의 농도로 처리한 paper disc를 균이 도말된 plate 위에 놓고 혐기배양기 (5% H2, 95% N2; 37℃)에서 48시간 동안 배양하여 생긴 생육저해환을 측정하였다. 그 결과, 고삼물 추출물에서는 모든 균주에 대하여 생육저해효과가 전혀 나타나지 않았고, 메탄올 및 에탄올 ta추출물에서 항균능이 확인되었다 (Fig.
- 3종의 추출액을 여과지 (Whatman, No.2)로 여과한 후 55±2℃에서 회전 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하고 초저온냉동고 ((Nihon freezer, Japan)에서 동결한 후에 freezer dryer(Labconco, USA)에서 건조 하였다.
- viscosus: 호기)에 맞게 37℃에서 배양하였다. 48시간 배양 후에, 분광광도계로 620㎚에서 흡광도를 측정하였고 미생물의 생육이 억제된 최저의 농도를 최소저해농도로 결정하였다.
- Effects of SR extracts on the growth of oral microorganism. Dose response experiment was conducted with three kinds of SR extracts, ethanolic (E), methanolic (M) and aqueous extract (W). The number beside capital letter indicates a dose of SR extract, namely that 1 means 1㎎/25㎕/disc of SR extract.
- MIC는 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최소농도를 의미한다. MIC 측정을 위해 각각의 고삼추출물을 1000㎍/㎖부터 0.5㎍/㎖까지 2배씩 series로 희석하여 3종의 구강 세균 위에 올리고 37℃에서 배양하였고, 620㎚에서 흡광도를 측정하여 균의 생육이 억제된 최저의 농도를 최소저해농도로 결정하였다. 고삼물 추출물은 최소저해농도 결정 실험에 사용된 최고 농도 (1000㎍/㎖)에서도 3종의 구강 미생물 (S.
- 고삼 에탄올 추출물을 실리카겔 (70-230 mesh) 칼럼 (12 × 26 ㎝)에 로딩한 후 클로로포름/메탄올의 혼합용매에서 메탄올의 비율을 순차적으로 높여가며 (1/0→4/1) 칼럼크로마토그래피를 실시하였다.
- 배양된 균은 분광광도계 (TECAN, Crailsheim, Germany)를 사용하여 620㎚에서 흡광도를 측정하였고, 107 CFU/㎖의 농도로 준비하여 96well plate에 200㎕씩 분주하였다. 고삼 추출물은 최고농도를 1000㎍/㎖으로 하여 2배씩 series로 희석 (stepwise 2-fold dilution)하여 0.5㎍/㎖까지 희석하였다. Kurarinone은 250㎍/㎖부터 0.
- 고삼에서 분리한 kurarinone이 실질적으로 구강미생물에 대해 항균효능을 발휘하는지를 조사하기 위해 생육저해환 측정과 MIC 값으로 항균활성을 조사하였다. Kurarinone을 50, 100㎍/25㎕/disc의 농도로 준비하고 3종의 구강 세균이 도말된 plate 위에 올려 48시간 동안 배양하였을 때, 실험에 사용한 모든 농도에서 항균효능이 관찰되었으며 농도의존적인 효과를 보였다 (Fig.
- 고삼은 3종의 용제 (물, 메탄올, 에탄올)로 추출하여 구강 미생물인 S. mutans, S. sobrinus, A.viscosus 균에 대한 항균활성을 조사하고, 각 추출물 속에 함유된 kurarinone 함량을 살펴본 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 균주는 24시간 동안 전 배양하여 108 CFU/㎖의 농도로 준비하여 45℃로 유지된 top agar 5㎖에 1㎖씩 가하여 잘 혼합한 후, BHI agar plate에 도말하였다. 고삼의 각 추출물은 1, 2㎎/25㎕의 농도로 준비하여 8㎜ 직경의 paper disc위에 25㎕씩 올리고 대조구 (control) disc 위에는 DMSO를 25㎕ 적셨다. Top agar가 마른 후에 BHI agar plate 위에 고삼 추출물이 적셔진 disc를 올리고 S.
- 디스크 확산법에 의한 생육저해환을 측정하기 위하여 BHI agar plate를 사용하였다. 균주는 24시간 동안 전 배양하여 108 CFU/㎖의 농도로 준비하여 45℃로 유지된 top agar 5㎖에 1㎖씩 가하여 잘 혼합한 후, BHI agar plate에 도말하였다.
- mutans에도 항균작용을 발휘함이 보고되었다. 따라서 각 고삼 추출물의 구강 미생물에 대한 항균력의 차이가 kurarinone의 함량변화에 기인한 것일 가능성을 고려하여, 각 추출물의 UPLC diagram 분석을 통해 kurarinone 성분분석을 실시하였다. 순물질 kurarinone (Fig.
- 6㎜로 나타났다. 또한, kurarinone을 250㎍/㎖를 최고농도로하여 1/2배씩 단계적으로 희석하여 (stepwise 2-fold dilution) 최소저해농도 (MIC) 값을 조사하였다. 48시간 동안 배양하여 분광광도계 (TECAN,Crailsheim, Germany)로 620㎚에서 흡광도를 측정한 결과, MIC는 S.
- 고삼 (Sophorae Radix, 대원약업사, 대구)은 마쇄한 후 3종 (물, 메탄올, 에탄올)의 용제를 사용하여 추출하였다. 물 추출물은 약재분말 200g을 1ℓ의 물로 3시간 동안 전탕하여 추출하였고, 메탄올과 에탄올 추출물은 약재분말 200g에 용제 1ℓ를 넣어 혼합 하여 72시간 동안 추출하였다. 3종의 추출액을 여과지 (Whatman, No.
- MIC 측정을 위해서 구강 미생물 3종을 24시간 동안 전 배양하였다. 배양된 균은 분광광도계 (TECAN, Crailsheim, Germany)를 사용하여 620㎚에서 흡광도를 측정하였고, 107 CFU/㎖의 농도로 준비하여 96well plate에 200㎕씩 분주하였다. 고삼 추출물은 최고농도를 1000㎍/㎖으로 하여 2배씩 series로 희석 (stepwise 2-fold dilution)하여 0.
- 고삼 에탄올 추출물을 실리카겔 (70-230 mesh) 칼럼 (12 × 26 ㎝)에 로딩한 후 클로로포름/메탄올의 혼합용매에서 메탄올의 비율을 순차적으로 높여가며 (1/0→4/1) 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 용출액을 250㎖씩 회수하여 얻어진 분획을 TLC pattern에 따라 9개의 분획물로 분획하였다. 이중에서 4번 분획은 TLC를 실시하였을 때 10% 황산에 의해 노란색으로 발색되고, UV 램프 (254㎚)에서 비교적 강한 형광을 나타내며 flavonoid의 특징을 보였으며, S.
- 용출액을 250㎖씩 회수하여 얻어진 분획을 TLC pattern에 따라 9개의 분획물로 분획하였다. 이중에서 4번 분획은 TLC를 실시하였을 때 10% 황산에 의해 노란색으로 발색되고, UV 램프 (254㎚)에서 비교적 강한 형광을 나타내며 flavonoid의 특징을 보였으며, S. mutans 균에 대해 16.5㎜의 생육저해환을 형성하였다 (data not shown). 4번 분획은 recycling HPLC (JAI 9104, Japan)에 loading하여 GS-310 칼럼과 메탄올 단일 용매를 사용하여 순물질 kurarinone을 분리하였다.
대상 데이터
- S. mutans KCCM 40105, S. sobrinus KCCM 11898, A. viscosus KCCM 12074는 한국미생물보존센터로부터 분양받아 BHI broth (Difco, USA)에 배양하였고 배양된 균은 glycerol과 3:7의 비율로 잘 혼합하여 -70℃에 보관하였다. 냉동고에 보관된 균주는 실험시작 3일 전에 활성화 시킨 후 BHI agar plate에 접종하여 S.
- 고삼 (Sophorae Radix, 대원약업사, 대구)은 마쇄한 후 3종 (물, 메탄올, 에탄올)의 용제를 사용하여 추출하였다. 물 추출물은 약재분말 200g을 1ℓ의 물로 3시간 동안 전탕하여 추출하였고, 메탄올과 에탄올 추출물은 약재분말 200g에 용제 1ℓ를 넣어 혼합 하여 72시간 동안 추출하였다.
- 2)로 여과한 후 55±2℃에서 회전 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하고 초저온냉동고 ((Nihon freezer, Japan)에서 동결한 후에 freezer dryer(Labconco, USA)에서 건조 하였다. 고삼의 물, 메탄올, 에탄올 추출물의 최종 수율은 각각 9.8%, 14.6%, 8.6%이었으며 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다.
- viscosus KCCM 12074는 한국미생물보존센터로부터 분양받아 BHI broth (Difco, USA)에 배양하였고 배양된 균은 glycerol과 3:7의 비율로 잘 혼합하여 -70℃에 보관하였다. 냉동고에 보관된 균주는 실험시작 3일 전에 활성화 시킨 후 BHI agar plate에 접종하여 S. mutans는 5% H2와 95% N2가 공급되는 혐기성 배양기 (Vision Scientific CO., LTD, Korea)에서, S. sobrinus와 A. viscosus는 호기조건에서 배양하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 윈도우용 SPSS 17.0을 사용하여 oneway ANOVA, Turkey test (multiplecomparison)방식으로 분석하였으며, P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
- 2. UPLC 성분분석 결과, kurarinone의 함량도 에탄올 추출물에서 7296.7±432.6ppm으로 가장 많이 존재하였다.
- 3. 에탄올 추출물에서 분리 정제한 kurarinone으로부터 3종의 구강 미생물에 대한 항균활성을 확인 하였다.
- 또한, kurarinone을 250㎍/㎖를 최고농도로하여 1/2배씩 단계적으로 희석하여 (stepwise 2-fold dilution) 최소저해농도 (MIC) 값을 조사하였다. 48시간 동안 배양하여 분광광도계 (TECAN,Crailsheim, Germany)로 620㎚에서 흡광도를 측정한 결과, MIC는 S. mutans, S. sobrinus, A.viscosus 균에 대하여 각각 3.9, 3.9, 7.8㎍/㎖으로 확인되었다 (Table 5).
- sobrinus 균에 대하여 메탄올 추출물보다 낮은 농도의 MIC 값을 보여, 생육저해환 형성에서와 마찬가지로 더 강한 항균효과를 보였다. A. viscosus 균은 에탄올 추출물과 메탄올 추출물에서 동일한 MIC값을 보였으나, Fig.1과 Table 1에서 제시한 바와 같이 에탄올 추출물이 유의적으로 더 큰 생육저해환을 형성하였기 때문에 이상의 결과를 종합하여 에탄올 추출물이 메탄올 추출물보다 더 강한 항균력을 지니는 것으로 판단되었다.
- Kurarinone을 100㎍/25㎕/disc으로 처리했을 때 생긴 clear zone의 크기는 S. mutans, S. sobrinus, A. viscosus 균에 대하여 각각 18.5±0.5, 19.0±0.5, 16.3±0.6㎜로 나타났다.
- 고삼에서 분리한 kurarinone이 실질적으로 구강미생물에 대해 항균효능을 발휘하는지를 조사하기 위해 생육저해환 측정과 MIC 값으로 항균활성을 조사하였다. Kurarinone을 50, 100㎍/25㎕/disc의 농도로 준비하고 3종의 구강 세균이 도말된 plate 위에 올려 48시간 동안 배양하였을 때, 실험에 사용한 모든 농도에서 항균효능이 관찰되었으며 농도의존적인 효과를 보였다 (Fig. 3, Table 5). Kurarinone을 100㎍/25㎕/disc으로 처리했을 때 생긴 clear zone의 크기는 S.
- sobrinus,A. viscosus 균에 대하여 각각 62.5, 62.5, 125 ㎍/㎖의 MIC 값을 보이며 가장 우수한 항균능을 나타내었다.
- 5㎍/㎖까지 2배씩 series로 희석하여 3종의 구강 세균 위에 올리고 37℃에서 배양하였고, 620㎚에서 흡광도를 측정하여 균의 생육이 억제된 최저의 농도를 최소저해농도로 결정하였다. 고삼물 추출물은 최소저해농도 결정 실험에 사용된 최고 농도 (1000㎍/㎖)에서도 3종의 구강 미생물 (S. mutans, S. sobrinus, A. viscosus)에 대해 항균효과를 보이지 않았고, 고삼의 메탄올 추출물은 125㎍/㎖, 에탄올추출물은 S. mutans, S. sobrinus, A. viscosus 균에 대하여 각각 62.5, 62.5, 125㎍/㎖의 최소저해농도를 나타내었다(Table 2). 고삼 에탄올 추출물은 S.
- 본 연구에서는 한약재를 준비함에 있어 일반적인 열수를 이용한 탕제 외에 修治의 방법으로 술이 輔料로 사용되어져 왔다는 점에 착안하여 고삼을 물, 메탄올, 에탄올로 추출하여 3종의 구강미생물에 대한 항균활성을 평가하였으며, 각 추출물의 항균능의 차이가 kurarinone의 함량 변화에 기인하는지 조사하여 보았다. 고삼 물추출물이 항균활성을 나타내지 않은 반면, 메탄올과 에탄올추출물에서는 3종의 구강 미생물에 대해 항균능이 관찰되었다. 에탄올추출물의 항균능은 메탄올추출물보다 유의하게 우수하였으며,kurarinone의 함량도 에탄올추출물에서 높게 확인되었다.
- 5, 125㎍/㎖의 최소저해농도를 나타내었다(Table 2). 고삼 에탄올 추출물은 S. mutans, S. sobrinus 균에 대하여 메탄올 추출물보다 낮은 농도의 MIC 값을 보여, 생육저해환 형성에서와 마찬가지로 더 강한 항균효과를 보였다. A.
- 3종의 고삼추출물이 구강미생물에 대해 가지는 항균력을 비교하기 위해 고삼의 메탄올, 에탄올, 물 추출물을 1, 2㎎/disc의 농도로 처리한 paper disc를 균이 도말된 plate 위에 놓고 혐기배양기 (5% H2, 95% N2; 37℃)에서 48시간 동안 배양하여 생긴 생육저해환을 측정하였다. 그 결과, 고삼물 추출물에서는 모든 균주에 대하여 생육저해효과가 전혀 나타나지 않았고, 메탄올 및 에탄올 ta추출물에서 항균능이 확인되었다 (Fig. 1). 하지만 메탄올보다 에탄올 추출물에 의한 항균효과가 더 우수하였으며, 이러한 효과는 실험에 사용된 모든 균에서 동일하게 확인되었다.
- 6ppm의 kurarinone이 존재하였다 (Table 3). 따라서 kurarinone이 고삼의 구강 미생물에 대한 항균능에 기여하는 유용 성분화합물일 것으로 사료된다.
- 따라서 각 고삼 추출물의 구강 미생물에 대한 항균력의 차이가 kurarinone의 함량변화에 기인한 것일 가능성을 고려하여, 각 추출물의 UPLC diagram 분석을 통해 kurarinone 성분분석을 실시하였다. 순물질 kurarinone (Fig. 2A)을 이용하여 만든 standard curve (Fig. 2B)에 의존하여 각 추출물의 kurarinone의 함량변화를 살펴본 결과, 항균력이 증가된 메탄올, 에탄올 추출물의 순서대로 flavonoid 성분인 kurarinone의 함량도 증가함을 확인할 수 있었다 (Fig. 2C). 항균력이 관찰되지 않은 물 추출물에서 kurarinone은 검출되지 않았으며, 메탄올 추출물에서는 6413.
- 에탄올 추출물은 2㎎/disc의 농도에서 S. mutans, S. sobrinus, A. viscosus 균에 대하여 각각 15.7±0.3㎜, 15.0±0.5㎜, 13.3±0.3㎜의 생육 저해환을 형성하여, 13.7±0.6㎜, 12.8±0.8㎜, 12.2±0.3㎜의 생육저해환을 형성한 메탄올 추출물보다 유의하게 (p>0.01) 우수한 항균력을 보였다(Table.1).
- 고삼 물추출물이 항균활성을 나타내지 않은 반면, 메탄올과 에탄올추출물에서는 3종의 구강 미생물에 대해 항균능이 관찰되었다. 에탄올추출물의 항균능은 메탄올추출물보다 유의하게 우수하였으며,kurarinone의 함량도 에탄올추출물에서 높게 확인되었다.
- 이상의 결과로 보아 고삼 에탄올 추출물은 구강 미생물에 대해 우수한 항균능을 지니며, kurarinone이 고삼의 항균능에 기여하는 구성화합물임을 알 수 있다. 따라서 고삼 에탄올 추출물 및 kurarinone은 구강 질환에 대한 예방 및 치료제로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과에서 고삼은 구강 미생물에 대해 우수한 항균력을 지니며, kurarinone이 고삼의 항균력에 관여하는 구성화합물 중의 하나임을 알 수 있다.
- 1). 하지만 메탄올보다 에탄올 추출물에 의한 항균효과가 더 우수하였으며, 이러한 효과는 실험에 사용된 모든 균에서 동일하게 확인되었다. 에탄올 추출물은 2㎎/disc의 농도에서 S.
- 항균력이 관찰되지 않은 물 추출물에서 kurarinone은 검출되지 않았으며, 메탄올 추출물에서는 6413.3±119.8ppm가 확인되었고, 항균활성이 가장 우수했던 에탄올 추출물에서는 7296.7±432.6ppm의 kurarinone이 존재하였다 (Table 3).
- 항균실험의 결과로 3종의 고삼 추출물 중에서 에탄올 추출물의 항균효능이 가장 우수함을 확인하였다. 고삼에서 분리된 kurarinone은 다종의 균주에 대한 antimicrobial activity가 알려져 있고, 특히 S.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 고삼 에탄올 추출물은 구강 미생물에 대해 우수한 항균능을 지니며, kurarinone이 고삼의 항균능에 기여하는 구성화합물임을 알 수 있다. 따라서 고삼 에탄올 추출물 및 kurarinone은 구강 질환에 대한 예방 및 치료제로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이것은 한방에서 輔料를 사용하여 修治를 하는 이유를 설명해 줄 수 있는 간접적인 결과라 사료되며, 고삼이나 kurarinone이 S. mutans 균주뿐만 아니라 항균활성이 규명되어져 있지 않던 S. sobrinus나 A.viscosus에 대해 우수한 항균력을 발휘함을 확인함으로써 치아우식증 및 치주염을 포함한 구강 질환 치료제로서 개발가능성을 보여준다 하겠다.
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