[논문]마우스대식세포주인 RAW 264.7에서 금령자산(金鈴子散)(金鈴子散)의 항염증 활성 연구

김도형; 이효승; 윤현정; 차창민; 박선동

doi:10.6116/kjh.2010.25.2.089

마우스대식세포주인 RAW 264.7에서 금령자산(金鈴子散)(金鈴子散)의 항염증 활성 연구
Anti-inflammatory effect of methanol extract of Keum-Ryung-Ja-San in mouse macrophages 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.25 no.2, 2010년, pp.89 - 98

김도형 (동국대학교 한의과대학 방제학교실) , 이효승 (동국대학교 한의과대학 방제학교실) , 윤현정 (동국대학교 한의과대학 방제학교실) , 차창민 (동국대학교 한의과대학 방제학교실) , 박선동 (동국대학교 한의과대학 방제학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : The aim of this study was to determine whether methanol extract of Keum-Ryung-Ja-San (KRJS) inhibit production of NO, $PGE_2$, iNOS, COX-2 and pro-inflammatory cytokines in lipopolysaccharide (LPS)-treated RAW 264.7 macrophages. Methods : Cytotoxic activity of extracts on RAW 264.7 cells was measured using 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt (MTS) assay. The nitric oxide (NO) production was measured by Griess reagent system. And proinflammatory cytokines and PGE2 were measured by ELISA kit. The levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), $I{\kappa}-B-\alpha$ and nuclear NF-${\kappa}B$ p65 expression were detected by western blot. Results : Our results indicated that methanol extract of KRJS significantly inhibited the LPS-induced NO, $PGE_2$ production and iNOS, COX-2 expression accompanied by an attenuation of TNF-$\alpha$, IL-$1{\beta}$ and IL-6 production in RAW 264.7 cells. Moreover, methanol extract of KRJS treatment also blocked LPS-induced NF-${\kappa}B$ activation. Conclusion : These findings indicate that methanol extract of KRJS inhibits the production of pro-inflammatory mediators and cytokines via suppression of NF-${\kappa}B$ activation. Take together, these results indicate that methanol extract of KRJS has the potential for use as an agent of anti-chronic inflammatory diseases.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그 지표로서 세포가 방출하는 NO, PGE2 생성량과 iNOS, COX-2 발현정도 뿐만 아니라 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량을 조사하였고 NF-κB 활성화에 미치는 영향을 알아 본 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
는 COX-2에 의해서 만들어진다. 그래서 RAW 264.7 세포에서 金鈴子散 추출물이 LPS로 유도된 iNOS 와 COX-2의 발현에 미치는 영향을 알아보기로 하였다. RAW 264.
염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines) 은 염증을 나타내는 중요한 지표이다. 따라서 RAW 264.7 세포에서 金鈴子散 추출물이 LPS로 유도된 염증성 사이토카인의 생성량에 미치는 영향을 알아보았다. RAW 264.
본 연구에서는 金鈴子散을 메탄올 추출하고, 그 추출물의 항염증 활성을 조사하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW 264.7에 농도 별로 1시간 전 처리한 후 LPS를 처리하여 염증반응을 유도시켜서, 약재가 이를 얼마나 효과적으로 저해할 수 있는 지 관찰하였다. 그 지표로서 세포가 방출하는 NO, PGE₂ 생성량과 iNOS, COX-2 발현정도 뿐만 아니라 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량을 조사하였고 NF-κB 활성화에 미치는 영향을 알아 본 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

가설 설정

최근에는 동맥경화의 발생이론이 크게 두 가지 측면에서 접근되고 있는데, 첫 번째로 ‘손상에 대한 반응가설 (reaction to injury hypothesis)'이 있다. 이가설은 죽상동맥경화증이 손상에 대한 반응으로 시작된다는 것으로 염증반응과 밀접한 관련이 있다. 동맥경화의 발생에 염증 반응이 관여한다는 기본적인 근거는 병리학적인 관찰에 기인하는데, 죽상동맥경화반 내에서 단핵구를 위시하여 대식세포와 T 림파구 등의 염증세포들의 침윤이 발견되기 때문이다³³⁾.

제안 방법

1. 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대한 추출물의 독성을 조사하여 생존율에 영향을 미치지 않는 농도 (200, 400 μg/ml)에서 실험을 진행하였다.
2. 약재를 1시간 전 처리한 후, 100 ng/ml의 LPS를 처리하여 염증을 유발하였다. 그 결과, 추출물이 LPS로 유도되는 NO, PGE₂의 생성량과 iNOS, COX-2의 발현을 크게 저해하였고, 또한 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량도 현저히 감소시켰다.
96 well plate에 1×104 cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주하고 약재를 농도별 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000 μg/ml)로 18시간 동안 처리하였다.
RAW 264.7 세포에 약재를 200, 400 μg/ml의 농도로 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/ml LPS를 18시간 동안 처리한 후 얻은 세포를 핵과 세포질로 분리한 후 NF-κB pathway에 미치는 영향을 조사 하였다.
RAW 264.7 세포에 추출물을 처리하고, 1시간이 지난 후에 LPS를 처리하여 염증을 유발하였다. 그리고 염증인자인 NO, PGE₂의 production, iNOS, COX-2 expression, proinflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량 을 측정하였다.
배양액 50 μl와 같은 양의 Griess Reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.
Well당 20 μl의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.
00을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다. Western blot을 통해 얻은 band의 density 분석은 GelDoc-It BioImaging System (UVP, USA)을 사용하여 측정하였다.
Well당 20 μl의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교해서 보정하였다.
이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
그래서 金鈴子散의 추출물이 RAW 264.7의 세포 생존율에 영향을 주지 않는 200 μg/ml과 400 μg/ml의 농도로 다음 실험을 진행하였다.
그리고 염증인자인 NO, PGE2의 production, iNOS, COX-2 expression, proinflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량 을 측정하였다.
메탄올 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 MTS assay를 실행하여 세포독성이 없는 약재의 농도를 선정하였다 (Fig. 1).
분리한 sample은 각각의 항체를 사용하여 western blotting을 수행하여 핵으로 이동한 NF-κB p65의 양과 세포질 내의 p-I-κB-α의 발현양상을 조사하였다.
세포에 200, 400 μg/ml의 金鈴子散 추출물을 전처리하고 100 ng/ml의 LPS를 처리하였다.
세포에 200, 400 μg/ml의 金鈴子散추출물을 처리하고 1시간 후 100 ng/ml의 LPS를 처리하였다.
세포질에서 핵으로 이동하는 NF-κB p65의 양을 측정하기 위해 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Thermo Scientific ; IL, USA)를 사용하여 핵과 세포질을 분리하였다.
1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 40분간 세척한 다음, secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.

대상 데이터

실험에 사용된 1차 항체인 iNOS monoclonal antibody (mAb)는 Santa Cruz Biotechnology사 (CA, USA)에서, COX-2 polyclonal antibody (pAb), NF-κB p65 mAb, phospho-I-κB-α (p-I-κB-α) mAb, poly-ADP ribose polymerase(PARP) pAb, β-actin mAb는 Cell Signaling Technology사 (Beverly, MA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, USA)에서 구입하였다. Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit와 Griess Reagent System은 Promega사 (Madison, USA)에서 구입하였고, 각종 cytokine 측정을 위한 ELISA kit는 Pierce Biotechnology사 (Rockford, USA)에서 구입하였으며, PGE₂ assay kit는 R&D사 (Minneapolis, USA)에서 구입하였다.
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit와 Griess Reagent System은 Promega사 (Madison, USA)에서 구입하였고, 각종 cytokine 측정을 위한 ELISA kit는 Pierce Biotechnology사 (Rockford, USA)에서 구입하였으며, PGE2 assay kit는 R&D사 (Minneapolis, USA)에서 구입하였다.
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit와 Griess Reagent System은 Promega사 (Madison, USA)에서 구입하였고, 각종 cytokine 측정을 위한 ELISA kit는 Pierce Biotechnology사 (Rockford, USA)에서 구입하였으며, PGE₂ assay kit는 R&D사 (Minneapolis, USA)에서 구입하였다. Protein assay reagent는 Bio-Rad사 (Hercules, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.
마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하였다.
본 실험에 사용한 약재는 동국대학교 한의과대학 방제학 교실에서 선별된 것을 정선하여 사용하였다. 金鈴子散 추출물은 金鈴子 150 g과 玄胡索 150 g에, 2000 ml의 100% methanol을 가한 다음 37℃에서 48시간 동안 추출하고, 이 과정을 2회 더 반복하여 얻어진 용액을 여과한 후 농축하고 동결 건조하여 19.
세포 배양액 내의 PGE2 양을 측정하기 위해 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 R&D systems (Minneapolis, MN)에서 구입하여 실험하였다.
세포 배양액인 Dulbecco's Modifide Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin-penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 1차 항체인 iNOS monoclonal antibody (mAb)는 Santa Cruz Biotechnology사 (CA, USA)에서, COX-2 polyclonal antibody (pAb), NF-κB p65 mAb, phospho-I-κB-α (p-I-κB-α) mAb, poly-ADP ribose polymerase(PARP) pAb, β-actin mAb는 Cell Signaling Technology사 (Beverly, MA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, Bis는 Bio-Rad사 (Hercules, USA)에서 구입하였고, hydrogen peroxide (H2O2), 6-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), CAPS, tween 20, protease inhibitors 등은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

실험결과는 평균과 표준 편차로 표시하고 유의성 검증은 Prism 4.00을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다. Western blot을 통해 얻은 band의 density 분석은 GelDoc-It BioImaging System (UVP, USA)을 사용하여 측정하였다.

이론/모형

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System³¹⁾을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
金鈴子散 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetrazolium inner salt (MTS) assay 방법²⁸⁾으로 분석하였다. 이는 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTS가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것이다.
마우스 대식세포인 RAW 264.7에 대한 약재의 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 金鈴子散 추출물을 농도별 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000 μg/ml)로 18시간 동안 처리한 결과, 400 μg/ml의 농도까지는 추출물 자체의 세포독성이 전혀 나타나지 않았지만, 그 이상의 농도에서는 독성이 나타났다 (Fig.
세포 배양액 내의 cytokines의 양을 측정하기 위해 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)를 수행하였다. 세포에 200, 400 μg/ml의 金鈴子散추출물을 처리하고 1시간 후 100 ng/ml의 LPS를 처리하였다.

성능/효과

3. 세포에 약재를 200, 400 μg/ml의 농도로 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/ml LPS를 18시간 동안 처리한 후 얻은 세포를 핵과 세포질로 분리한 후 NF-κB pathway에 미치는 영향을 조사한 결과, 추출물은 LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화를 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
LPS에 의해 유도되는 IL-1β의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 200, 400 μg/ml의 농도에서 각각 83.1%, 89.3% 감소시켰다 (Fig. 4B).
LPS에 의해 유도되는 PGE2의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 200 μ g/ml의 농도에서는 21.5% 감소시켰고, 400 μg/ml 의 농도에서는 52.5% 감소시켰다 (Fig. 2B).
RAW 264.7 세포에 약재를 200, 400 μg/ml의 농도로 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/ml LPS를 18시간 동안 처리하여 LPS 에 의해 유도되는 iNOS의 발현에 미치는 영향을 같은 방법으로 조사한 결과, 농도 의존적으로 우수한 억제 효과가 나타났다 (Fig. 3A).
RAW 264.7 세포에 약재를 200, 400 μg/ml의 농도로 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/ml LPS를 18시간 동안 처리하여 LPS에 의해 유도되는 TNFα의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 200, 400μg/ml의 농도에서 각각 85.7%, 99.1% 감소시켰다 (Fig. 4A).
金鈴子散 추출물을 농도별 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000 μg/ml)로 18시간 동안 처리한 결과, 400 μg/ml의 농도까지는 추출물 자체의 세포독성이 전혀 나타나지 않았지만, 그 이상의 농도에서는 독성이 나타났다 (Fig. 1).
그 결과, 세포질 내에서는 LPS에 의해 Iκ B-α의 인산화가 증가되었고, 이는 추출물에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5A).
그 결과, 추출물은 모두 LPS로 유도된 염증 인자들을 농도 의존적으로 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화를 저해함을 확인하였다.
그 결과, 추출물이 LPS로 유도되는 NO, PGE2의 생성량과 iNOS, COX-2의 발현을 크게 저해하였고, 또한 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량도 현저히 감소시켰다.
2B). 따라서, 金鈴子散 추출물 모두 농도 의존적으로 LPS로 유도된 NO와 PGE₂를 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다.
또한 LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화를 저해함을 확인하였다.
3A). 또한, LPS에 의해 유도되는 COX-2 발현에 미치는 영향을 조사한 결과, 역시 농도 의존적인 감소 효과가 관찰되었다(Fig. 3B).
또한, LPS에 의해 유도되는 IL-6의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 200 μg/ml의 농도에서 각각 94.5%, 400 μg/ml의 농도에서 99.2% 감소시켰다 (Fig. 4C).
또한, LPS에 의해 핵 내로 이동하는 NF-κB p65의 양이 증가하였고 이는 추출물에 의해 효과적으로 감소됨을 알 수 있었다 (Fig. 5B).
약재의 항염증활성을 알아보기 위하여 RAW 264.7세포에 金鈴子散 추출물 200, 400 μg/ml을 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/ml LPS를 18시간 동안 처리하여 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 200 μg/ml의 농도에서는 92.7% 감소시켰고, 400 μg/ml의 농도에서는 95.7% 감소시켰다 (Fig. 2A).
이러한 실험 결과들로 보아, 의 추출물은 탁월한 항염증 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 따라서 동맥경화를 비롯한 고혈압, 암, 당뇨, 관절염 등의 만성 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 생각된다.

후속연구

한방에서는 오랜 역사에 걸쳐서 다양한 천연 자원의 치료효과를 연구해 왔으며, 이런 천연 자원들을 한의학적인 이론에 따라서 조합을 해서 실제 치료제로서 사용해 왔다. 그러므로 항산화 및 항염증 효과를 지닌 천연물이나 그 천연물의 조합을 찾아내면, 만성 염증성 질환에 사용할 수 있는 치료물질로 개발하는데 크게 이바지할 수 있을 것이다.
이러한 실험 결과들로 보아, 의 추출물은 탁월한 항염증 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 따라서 동맥경화를 비롯한 고혈압, 암, 당뇨, 관절염 등의 만성 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 생각된다.
특히 동맥경화의 경우에서 Kunsch와 Medford 등의 연구에 의하면³⁶⁾, 여러 가지 죽상동맥경화의 위험 인자들이 공통적으로 혈관세포 내 산화스트레스 (oxidative stress)를 증가시키고, 이에 따라 2차적으로 redox-sensitive signaling pathway와 transcription factor를 활성화함으로써 혈관세포와 면역세포의 상호작용에 의한 염증을 유발하고, 혈관기능의 장애를 초래하여 죽상동맥경화를 유발한다고 밝혔다. 따라서, 항염증 효과를 동반한 천연물은 동맥경화와 같은 만성 염증성 질환 (chronic inflammatory disease)의 예방 및 치료제 개발에 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.
이러한 실험 결과들로 보아, 추출물은 뛰어난 항염증 효과를 가지고 있었으며, 이는 동맥경화를 비롯한 고혈압, 암, 당뇨나 관절염 등 만성 염증성 질환 (chronic inflammatory disease)의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	金鈴子散은 어떤 질환에 응용되어 왔는가?	金鈴子散 (Keum-Ryung-Ja-San, KRJS)은 金鈴子 (=川楝子)와 玄胡索이 각각 동량으로 구성된 처방으로, 한방에서는 이를 肝鬱有熱로 心腹脇肋이 疼痛하고 口苦, 舌紅苔黃하며, 脈象이 弦數한 증상을 치료한다 하여, 위․십이지장궤양, 만성위염, 담낭염 등의 질환에 응용하여 왔다1).
	金鈴子散은 어떠한 처방인가?	金鈴子散 (Keum-Ryung-Ja-San, KRJS)은 金鈴子 (=川楝子)와 玄胡索이 각각 동량으로 구성된 처방으로, 한방에서는 이를 肝鬱有熱로 心腹脇肋이 疼痛하고 口苦, 舌紅苔黃하며, 脈象이 弦數한 증상을 치료한다 하여, 위․십이지장궤양, 만성위염, 담낭염 등의 질환에 응용하여 왔다1).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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