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문제 정의
- 본 실험에서는 穿心蓮 전탕 추출물이 폐암세포의 세포증식에 미치는 영향을 비교하였다. 폐암세포(A549)에 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별로 처리한 뒤 세포의 증식을 확인한 결과, Control에 비해 폐암세포에서는 穿心蓮 전탕 추출물을 10 ㎎/㎖의 농도로 처리한 경우 세포증식이 가장 낮았다.
- 의 보고에서와 같이 穿心蓮의 생리활성에 대한 여러 연구가 진행되었으나, 아직 穿心蓮의 폐암세포에 대한 항암효과를 비교한 연구는 보고된 바가 없었다. 이에 著者는 穿心蓮을 전탕 추출과 이로부터 분획별 추출물을 얻은 후, 폐암세포에 대한 영향을 측정하여 穿心蓮의 항암효과에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- A549에 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별로 처리하여 배양하고, IFN-γ를 분비하는 세포의 비율을 FACs를 이용하여 확인하였다.
- 1 ㎎/㎖의 농도로 희석하여 처리하고, 72시간 동안 배양한 후, cytokine의 변화를 ELISA로 확인하였다. A549에 약물을 처리하지 않은 것을 Control로 하여 비교하였다(Table Ⅰ).
- 穿心蓮 전탕 추출물 및 분획 추출물을 처리한 A549을 72시간 동안 배양을 실시한 후, 세포를 취합한다. Annexin V와 반응시켜 flow cytometry를 이용하여 cell population을 확인하였으며, FACs calibur의 software를 이용하여 분석하였다.
- IFN-γ kit를 사용하여, 약물을 처리한 A549의 세포에 FITC-mouse anti-human IFN-γ 표적 항체를 intracellular staining으로 실시하여 flow cytometry를 이용하여 확인하였다.
- 穿心蓮 전탕 추출물 및 분획 추출물들을 1 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 폐암세포에 처리한 후, 72시간 동안 배양하고 세포의 형태를 확인하였다. Control은 폐암세포인 A549에 약물을 처리 하지 않은 것이다.
- 전탕액 분말을 Fig 1과 같은 방법으로 분획하였다. 穿心蓮 전탕 추출물 분말과 증류수 400 ㎖를 넣고 극성이 다른 여러 가지 용매 (n-hexane, ethyl acetate, ethyl ether, n-butanol)를 이용하여 단계적으로 분획하였다. 극성에 의해 얻어진 분획 추출물들은 감압농축장치를 이용하여 용매를 완전히 제거한 후 실험에 사용하였다(Fig.
- 穿心蓮 전탕 추출물을 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 0.1 ㎎/㎖의 농도로 하여 폐암세포에 처리 한 후, 72시간 동안 배양을 하고 세포의 형태를 확인 하였다. Control은 폐암세포인 A549에 약물을 처리 하지 않은 것이다.
- 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별로 폐암세포 배양액에 처리한 후, 폐암세포에 나타나는 apoptosis의 정도를 FACs를 이용하여 확인하였다. 穿心蓮 전탕 추출물은 농도 의존적으로 폐암세포의 apoptosis를 증가시켰다(Fig.
- 穿心蓮 전탕 추출물의 total extract 및 분획물들을 폐암세포 배양액에 처리한 후 apoptosis의 정도를 FACs를 이용하여 확인하였다. 穿心蓮 전탕 추출물의 total extract 및 EtOEt 분획을 제외한 대부분의 분획 추출물들은 폐암세포의 apoptosis에 거의 영향을 미치지 않았다.
- 穿心蓮을 100 g 씩에 각각 1 ℓ의 증류수를 가하고 약탕기(웅진약탕기. 한국)를 이용하여 3시간 동안 끓인 다음 여과지로 여과한 후 감압농축장치를 이용하여 수분을 제거하여 분말로 만들었다.
- 穿心蓮을 전탕 추출하여 이로부터 분획별 추출물을 얻은 후, 폐암세포에 대한 영향과 정상 면역세포에 대한 영향을 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 다음으로, cocktail solution을 2 ㎖ 첨가 한 후, thymidine의 uptake를 β-counter로 확인하였다.
- 穿心蓮 전탕 추출물 및 분획 추출물을 1 ㎎/㎖의 농도로 희석하여 폐암세포에 처리한 후, 72시간 동안 36℃에서 배양한다. 배양이 끝난 후에 100배 혹은 200배율로 현미경에서 관찰을 하였으며, 사진 촬영을 실시하였다.
- 본 실험에서는 穿心蓮 전탕 추출물이 폐암세포의 IFN-γ 분비에 미치는 영향을 비교하였다.
- 본 실험에서는 穿心蓮 전탕 추출물이 폐암세포의 TGF-β 생성에 미치는 영향을 비교하였다.
- 본 실험에서는 穿心蓮 전탕 추출물이 폐암세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 비교하였다.
- . 본 실험에서는 穿心蓮전탕 추출물이 폐암세포의 apoptosis에 미치는 영향을 농도별, 분획별로 비교하였다. 폐암세포에서는 농도 의존적으로 apoptosis를 증가시켰으며, 또한 EtOEt의 분획 추출물을 처리하였을 때 폐암세포의 apoptosis가 현저하게 증가하였다.
- 본 실험에서는 전환성장인자(TGF-β), 종양괴사 인자(TNF-α)의 양을 측정하여 그 생성량으로 항암 효과를 확인하였다.
- 암세포의 증식 중에 나타나는 TGF-β와 TNF-α의 cytokine의 변화는 암세포의 배양액에서 ELISA kit를 사용하여, 각 cytokine level을 측정하였다.
- 항 cytokine 항체가 코팅된 96 well plate에 serum을 가하여 반응시킨 후 4번 세척하고, 다시 biotin이 표식된 항cytokine 항체를 가하여 반응시킨 후 4번 세척하였다. 여기에 streptavidin-HRP를 가하고 ELISA-reader를 이용하여 측정하였다.
- 이에 저자는 穿心蓮을 전탕 추출과 이로부터 분획별 추출물을 얻은 후, 폐암세포에서의 cell proliferation, apoptosis, morphology 및 cytokine level을 측정하였다.
- 폐암 세포주인 A549에 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별로 처리한 뒤에 72시간동안 37℃에서 배양한 후, 세포의 증식을 [3H]-thymidine을 이용하여 uptake 정도를 확인하였다. 穿心蓮을 10 ㎎/㎖의 농도로 처리한 경우에 폐암세포의 증식이 가장 낮았다(Fig.
- 폐암세포인 A549에 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별로 처리한 세포 배양액에서 tumor necrosis factor-α(TNF-α)의 양을 측정하였다.
- 폐암세포인 A549의 배양액에 穿心蓮 전탕 추출물을 10, 5, 1, 0.1 ㎎/㎖의 농도로 희석하여 처리하고, 72시간 동안 배양한 후, cytokine의 변화를 ELISA로 확인하였다. A549에 약물을 처리하지 않은 것을 Control로 하여 비교하였다(Table Ⅰ).
대상 데이터
- Absolute alcohol 은 Sigma(U.S.A) 제품, Fetal bovine serum(FBS), Antibiotics 등은 Hyclone(U.S.A) 제품, Phosphate buffer aline은 Gibco(U.S.A) 제품, oligo dt, pre-made primer 등은 Bioneer(U.S.A) 제품, methyl3 H (thymidine) 은 Amersham(U.S.A) 제품, Antibody-IFN-γ-FITC(fluorescein isothiocyanate)는 BD Pharmingen(U.S.A) 제품, IFN-γ ELISA kit, TNF-α ELISA kit, TGF-β ELISA kit 등은 Endogen(U.S.A) 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 穿心蓮(Andrographitis Herba , 이하 AH로 표기)은 2005년 8월 중국 안국시장에서 구입하여, 모든 약재는 추출하기 전에 초음파 세척기를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.
- 한국 세포주은행으로부터 분양받은 A549를 DME media에 20% FBS와 antibiotics(penicillin 100 U/㎖, streptomycin 100 ㎍/㎖)를 첨가하여 배양하였고, 12 well plate에 5×105 cell/well로 분주하였다.
- 한국 세포주은행으로부터 분양받은 폐암세포(A549)를 RPMI1640 media에 10% FBS와 antibiotics (penicillin 100 U/㎖, streptomycin 100 ㎍/㎖)를 첨가하여 배양을 실시하였다. 폐암세포를 12 well plate에 5×105 cell/well로 분주한 다음, 穿心蓮 전탕을 농도를 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 0.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 ANOVA multi t-test(JAVA, Bonferroni Ver II)로 분석하여 p값을 구했다. 각 Control과 비교하여 p값이 0.
이론/모형
- 암세포의 증식 중에 나타나는 IFN-γ의 cytokine의 변화는 flow cytometry를 이용하여 확인하였다.
성능/효과
- 1. 穿心蓮 전탕 추출물은 폐암세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 2. 穿心蓮 전탕 추출물은 폐암세포의 자연사멸을 농도 의존적으로 증가시켰다.
- 3. 穿心蓮 전탕 추출물의 분획 추출물 중 EtOEt의 분획 추출물이 자연사멸을 가장 많이 증가시켰다.
- 4. 穿心蓮 전탕 추출물은 폐암세포에서 농도 의존적으로 TGF-β 분비를 감소시키고, TNF-α 분비를 증가시켰으며, IFN-γ 분비 세포의 비율을 증가시켰다.
- 5 ㎎/㎖와 10 ㎎/㎖ 농도에서 Control에 비하여 TNF-α의 생성이 유의하게 증가하였다(Fig. 8).
- Control은 폐암세포인 A549에 약물을 처리 하지 않은 것이다. Control에 비해 穿心蓮 추출물을 처리한 경우 세포의 수가 현저히 감소하였으며, EtOEt 혹은 EtOAc 분획 추출물을 처리한 경우에는 폐암세포의 사멸이 현저히 증가하였음을 알 수 있었다(Fig. 6).
- A549는 배양그릇의 바닥에 붙어서 자라는 경향을 보였다. Control에 비해 穿心蓮 추출물을 처리한 경우 폐암세포의 수가 현저히 감소되었으며, 농도가 높을수록 세포가 더욱 많이 감소한 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 穿心蓮의 농도가 증가함에 따라 IFN-γ의 분비를 나타내는 세포의 비율이 증가하였다(Fig. 9).
- 이상의 결과를 종합하면, 穿心蓮의 전탕 추출물과 분획 추출물이 농도와 분획에 따라 약간의 차이는 있으나 전반적으로 폐암세포에 대한 증식 억제효과가 있다고 사료된다.
- 본 실험에서는 穿心蓮 전탕 추출물이 폐암세포의 세포증식에 미치는 영향을 비교하였다. 폐암세포(A549)에 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별로 처리한 뒤 세포의 증식을 확인한 결과, Control에 비해 폐암세포에서는 穿心蓮 전탕 추출물을 10 ㎎/㎖의 농도로 처리한 경우 세포증식이 가장 낮았다. 암세포의 증식이 감소되었다는 것은 항암효과를 나타내는 것으로 볼 수 있다.
- 폐암세포에 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별, 분획별로 처리한 후 세포의 형태를 확인한 결과, 폐암세포에서는 Control에 비해 세포의 수가 현저히 감소하였고, 농도가 높을수록 세포가 더욱 많이 감소하였으며, 분획 추출물들을 처리한 경우는 Control에 비해 세포의 수가 현저히 감소되었고, 특히 EtOEt 혹은 EtOAc 분획 추출물을 처리한 경우 폐암세포의 사멸이 현저히 증가하였다.
- 폐암세포에 穿心蓮 전탕 추출물을 농도별로 처리한 경우, 5 ㎎/㎖와 10 ㎎/㎖ 농도에서 TNF-α의 생성이 유의하게 증가하였다.
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