Objectives : We investigated genetic toxicity of HMCO5 using the Micronucleus Test in bone marrow cells of mice and Bacterial Reverse Mutation Assay in plate incorporation method according to OECD Guidelines and KFDA Guidelines. Methods : 1. Micronucleus test: The male rats were divided into 5 group...
Objectives : We investigated genetic toxicity of HMCO5 using the Micronucleus Test in bone marrow cells of mice and Bacterial Reverse Mutation Assay in plate incorporation method according to OECD Guidelines and KFDA Guidelines. Methods : 1. Micronucleus test: The male rats were divided into 5 groups, respectively; G(1), treated with distilled water: G(2), treated with 1250mg/kg HMC05: G(3), treated with 2500mg/kg HMC05, G(4), treated with 5,000mg/kg HMC05; G(5), treated with Cyclophosphamide $H_2O$. Sterilized distilled water and HMC05 were administered for two consecutive days. Cyclophosphamide $H_2O$ was administered once on the day of 2nd administration. 2. Bacterial Reverse Mutation Aassay: Experimental groups were divided into two groups: with S-9mix(+S) or without S-9mix(-S). Each group treated with sterilized distilled water only, HMCO5(62, 185, 556, 1,667, $5,000{\mu}g$/plate) and, positive vehicles(Sodium azide, 2-Aminoanthracene, 4-Nitroquinoline N-oxide, ICR 191), respectively. Results : HMC05 did not show any changes in the number of micronucleated polychromatic erythrocytes(MNPCE) among 200 polychromatic erythrocytes compare to negative control. However, there were significant (p<0.01) increase with CPA in MNPCE. In Bacterial Reverse Mutation Aassay, no significant increases in the number of revertant colonies compared to (삭제) negative control were detected in all concentrations of HMC05. Conclusions : These results indicate that HMC05 did not show any genotoxicity against in Micronucleus test and Bacterial Reverse Mutation Aassay.
Objectives : We investigated genetic toxicity of HMCO5 using the Micronucleus Test in bone marrow cells of mice and Bacterial Reverse Mutation Assay in plate incorporation method according to OECD Guidelines and KFDA Guidelines. Methods : 1. Micronucleus test: The male rats were divided into 5 groups, respectively; G(1), treated with distilled water: G(2), treated with 1250mg/kg HMC05: G(3), treated with 2500mg/kg HMC05, G(4), treated with 5,000mg/kg HMC05; G(5), treated with Cyclophosphamide $H_2O$. Sterilized distilled water and HMC05 were administered for two consecutive days. Cyclophosphamide $H_2O$ was administered once on the day of 2nd administration. 2. Bacterial Reverse Mutation Aassay: Experimental groups were divided into two groups: with S-9mix(+S) or without S-9mix(-S). Each group treated with sterilized distilled water only, HMCO5(62, 185, 556, 1,667, $5,000{\mu}g$/plate) and, positive vehicles(Sodium azide, 2-Aminoanthracene, 4-Nitroquinoline N-oxide, ICR 191), respectively. Results : HMC05 did not show any changes in the number of micronucleated polychromatic erythrocytes(MNPCE) among 200 polychromatic erythrocytes compare to negative control. However, there were significant (p<0.01) increase with CPA in MNPCE. In Bacterial Reverse Mutation Aassay, no significant increases in the number of revertant colonies compared to (삭제) negative control were detected in all concentrations of HMC05. Conclusions : These results indicate that HMC05 did not show any genotoxicity against in Micronucleus test and Bacterial Reverse Mutation Aassay.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구는 HMC05의 유전독성 평가를 위하여 세균에서의 복귀돌연변이 유발성 여부와 ICR 마우스 골수세포를 이용하여 소핵 유발성 여부를 관찰하여 유의한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
15-17) 따라서 본 시험에서는 시험물질 HMC05의 유전독성을 마우스 골수세포에 있어서 소핵 유발성여부와 시험과 세균에서의 복귀돌연변이 유발성 여부를 지표로 검색하였다.
계수시 세포직경의 1/5∼1/20의 크기로 주변 유핵세포의 핵과 동일한 염색상을 나타내는 원형 내지 타원형 소체를 소핵으로 계수하였다.
상등액을 제거한 후 침전된 골수세포를 slide glass에 도말, 실온에서 충분히 건조하고, methanol에 5분간 세포를 고정하였다. 고정 및 건조가 끝난 검체는 May-Grunwald 염색액 원액에 3분, May-Grunwald 염색액과 증류수를 1:1로 희석한 희석액에 2분, Giemsa 염색액(5% in PBS, pH 6.8)에 10분간 염색하여 검체를 제작하였다.
의 방법에 따라 골수세포를 수거하여 개체당 2매의 검체를 제작하였다. 골수세포는 각 동물로 부터 적출한 대퇴골을 23G 주사침을 사용하여 3㎖의 Fetal Bovine Serum(FBS, Gibco-BRL)으로 골수를 씻어내려 현탁한 다음 1,000rpm으로 5분간 원심분리 하여 얻었다. 상등액을 제거한 후 침전된 골수세포를 slide glass에 도말, 실온에서 충분히 건조하고, methanol에 5분간 세포를 고정하였다.
돌연변이 집락수(집락수)는 각 평판의 기본성장균층(background lawn)의 형성 여부를 검사하였으며 오염 혹은 기타 이상의 발생여부를 점검하였다. 무균성 확인을 위한 평판에서는 미생물의 오염으로 인한 집락생성 유무를 확인하였다.
먼저 경구투여 소핵시험을 위한 투여량 설정(Annex 2)은 예비시험에서 1,250, 2,500 및 5,000㎎/㎏/day의 용량으로 암수 각 3 마리에 1일 1회, 2일간 경구 투여하고 투여일 포함 4일간 관찰한 결과 특별한 육안적 이상소견이 관찰되지 않아 멸균주사 용수를 투여하는 음성대조군을 설정하고, 5,000㎎/㎏/day를 본시험의 고용량군으로 설정하여 공비를 2로 아래의 1,250, 2,500㎎/㎏/day의 용량으로 1일 1회,2일간 마우스에 경구투여하고, 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수세포를 수거하여 소핵과 세포독성을 관찰하였다. 적용한 용량범위 내에서 개체 당 2,000개의 PCE를 대상으로 소핵을 계수한 결과, 시험물질 HMC05는 투여한 모든 군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가는 없었다.
시험물질 HMC05는 순도에 보정하여 조제에 사용하였다. 먼저 시험물질은 멸균주사용수(G212F21, 대한약품공업주식회사)에 현탁한 후 단계별 희석 및 조제하였다. 경구투여 소핵시험을 위한 양성 대조물질은 투여 직전에 멸균주사용수에 용해하여 조제하였다.
돌연변이 집락수(집락수)는 각 평판의 기본성장균층(background lawn)의 형성 여부를 검사하였으며 오염 혹은 기타 이상의 발생여부를 점검하였다. 무균성 확인을 위한 평판에서는 미생물의 오염으로 인한 집락생성 유무를 확인하였다. 판정은 대사활성계 존재 유무에 관계없이 최소 1개 균주에서 평판 당 복귀된 집락수에 있어서 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판정하였다.
복귀돌연변이 시험은 대사활성계 적용 및 비적용하에 예비시험을 통하여 모든 균주에 대해 62, 185, 556, 1,667, 5,000㎍/plate의 HMC05를 투여한 5단계의 실험군과 음성대조군 및 양성대조군으로 구성하였다.
소핵시험에서의 동물의 군 분리는 순화기간 중 건강한 것으로 판정한 동물의 체중을 측정하고, 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 멸균주사용수(G212F21, 대한약품공업주식회사) 투여 음성대조군(G1), 1,250(G2), 2,500(G3) 및 5,000(G4)㎎/㎏/day의 HMC05 투여시험군, cyclophosphamide·H2O(CPA, Sigma-Aldrich Co) 투여 양성대조군(G5)으로 구분하고 각 군당 6마리씩 사용하였다(Table 1).
소핵의 빈도를 산출하기 위해 동물 당 2,000개의 다염성적혈구(polychromatic erythrocyte, PCE) 중 나타나는 소핵을 가진 다염성적혈구(micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)의 수를 1,000배의 배율로 소핵 유발성과 세포독성을 평가하였다. 계수시 세포직경의 1/5∼1/20의 크기로 주변 유핵세포의 핵과 동일한 염색상을 나타내는 원형 내지 타원형 소체를 소핵으로 계수하였다.
소핵 출현빈도는 개체 당 2,000개의 PCE에서 관찰되는 MNPCE 수의 평균±표준편차로 나타내었다. 소핵의 유무에 상관없이 합계 500개 이상의 PCE 및 정염성적혈구(normochromatic erythrocyte, NCE)를 계수하여 PCE/(PCE+NCE) 비율, 즉 총 적혈구 중 다염성적혈구의 비율을 산출해 세포독성의 지표로 하였다.
시험물질 HMC05는 동물을 경배부 피부고정법으로 고정하고 20㎖/㎏/day를 1일 1회, 2일간 경구투여하였고, 양성대조물질 CPA는 ‘의약품등의 독성시험기준’(제 2005-60호, 10월 21일)에 따른 경로로 10㎖/㎏/day를 시험물질의 2회 차 투여 일에 소독용 알코올을 이용하여 투여할 부위를 소독한 후 26G 주사침을 이용하여 복강에 투여하였다(Table 1).
1ml씩 처리하였다. 시험물질 HMC05의 처리는 모든 균주에 대해 대사활성계 적용 및 비적용 시 62, 185, 556, 1,667, 5,000㎍/plate의 5단계 농도를 투여하였다.
시험물질 및 S-9 mix의 무균성 확인을 위해 시험물질 최고 농도액 0.1ml와 S-9 mix 0.5ml를 각각 2ml의 top agar에 혼합하여 평판을 제작하였다. 처리가 끝난 후 top agar가 굳으면 평판을 뒤집어 37℃에서 약 48시간 배양 후 복귀돌연변이 집락수를 계수하였다.
시험물질 투여일 및 검체 제작시 1일 1회 사망동물 및 육안적 이상 징후의 발생 여부를 관찰하여 개체별로 기록하였다.
75g) ICR 계통 SPF(특정병원균 부재) 마우스(HsdKoat:ICR(CD-1®))를 ㈜켐온 전임상연구센터의 동물사육실에서 일정한 조건(온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수10∼20회/hr, 조명시간 12hr/12hr dark/light cycle, 조도 150∼300 Lux)하에서 1주일 동안 적응시킨 후 사용하였다. 실험기간 동안 고형사료(Harlan Co. Ltd, USA.TEKLADCERTIFIEDGLOBAL18%PROTEINR ODENTDIET,2918C)와 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 물을 자유롭게 섭취토록 하였다. 본 시험은 ㈜켐온의 동물실험윤리규정을 준수하여 실시하였다.
6, 8, 40, 200, 1,000, 2,500, 5,000㎍/plate와 음성 및 양성대조군으로 시험군을 구성하여 시험한 결과 집락수의 증가 및 감소가 관찰되지 않았다. 위 결과를 근거로 하여 시험물질 HMC05는 모든 균주에 대해 대사활성계 적용 및 비적용 시 62, 185, 556, 1,667, 5,000㎍/plate의 5단계 농도를 설정하였다. 시험 결과, 시험물질 최고농도 및 S-9 mix의 무균성을 확인하기 위한 플레이트에서 미생물 오염으로 인한 복귀돌연변이 집락은 나타나지 않았다.
1ml을 top agar에 혼합하고 즉시 vortex mixer로 2~3초간 진탕하여 minimal glucose agar plate에 부어 여러 방향으로 기울여 고루 퍼지게 하여 굳게 하였다. 음성대조군은 시험물질 용액 대신 멸균주사용수를, 양성대조군은 양성대조물질 용액을 0.1ml씩 처리하였다. 시험물질 HMC05의 처리는 모든 균주에 대해 대사활성계 적용 및 비적용 시 62, 185, 556, 1,667, 5,000㎍/plate의 5단계 농도를 투여하였다.
집락수의 ‘현저한 감소’에 대해서는 공통된 기준이 없으므로 본 시험에서는 편의상 집락수가 음성대조군에서 나타난 집락수 평균치의 50% 이하로 감소한 경우를 항균성으로 판단하였다.
2)에 접종해 shaking incubator(37℃, 200rpm)에서 12~14시간 전배양하였으며, 전배양을 마친 균주는 시험에 사용할 때까지 냉장 보관하였다. 최소배지(minimal glucose agar plate)는 1.5% Bacto agar(Difco)와 Vogel-Bonner medium E 및 2% glucose를 함유한 것을 페트리디쉬에 25ml씩 분주한 것을 사용하였으며, 대장균(E. coli)을 이용한 시험에는 위와 동일한 최소배지에 0.1% tryptophan액을 0.25ml/L로 첨가한 것을 사용하였다. Top agar는 0.
무균성 확인을 위한 평판에서는 미생물의 오염으로 인한 집락생성 유무를 확인하였다. 판정은 대사활성계 존재 유무에 관계없이 최소 1개 균주에서 평판 당 복귀된 집락수에 있어서 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판정하였다. 집락수의 용량 상관성 및 음성대조군에 비해 증가하는 정도 또한 고려하였다.
한편 HMC05의 Salmonella typhimurium의 히스티딘 요구성 균주인 TA100, TA1535, TA98 및 TA1537의 4개의 균주와 대장균 Escherichia coli의 트립토판 요구성 균주인 WP2 uvrA를 이용하여 대사활성계 적용(+S) 및 비적용(-S)하에 복귀돌연변이 시험을 실시하였다. 농도 결정을 위한 예비시험에서 시험물질 1.
대상 데이터
coli WP2 uvrA를, frame-shift형 돌연변이 검색을 위하여 TA98과 TA1537 등 모두 5개의 균주는 Molecular toxicology Inc.(P.O. BOX 1189 BOONE, NC 28607, USA)에서 구입 후 ㈜켐온 전 임상연구센터에서 형질확인 후 계대 배양하고, 파장 600nm에서의 흡광도 기준으로 생균수 측정 결과 0.64~4.70 x 109CFU/ml인 것을 시험에 사용하였다.
경구투여 소핵시험은 수컷 7주령(29.98g∼32.75g) ICR 계통 SPF(특정병원균 부재) 마우스(HsdKoat:ICR(CD-1®))를 ㈜켐온 전임상연구센터의 동물사육실에서 일정한 조건(온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수10∼20회/hr, 조명시간 12hr/12hr dark/light cycle, 조도 150∼300 Lux)하에서 1주일 동안 적응시킨 후 사용하였다.
배양한 균배양액은 1ml당 DMSO(Sigma-Aldrich Inc. D-2650) 90μl를 가하여 냉동 vial에 채워 Deep freezer 내에 냉동 보관하였으며, 형질이 확인된 균주의 master plate를 제작하여 시험에 사용하였다.
복귀돌연변이 시험에 사용된 양성 대조물질은 Sodium azide(SA, Sigma-Aldrich Co)는 멸균주사용수에 용해하였으며, 2-Aminoanthracene(2-AA, Sigma-Aldrich Co), 4-Nitroquinoline N-oxide(4NQO, Sigma-Aldrich Co) 및 ICR 191(ICR191, Sigma-Aldrich Co)은 DMSO (Sigma-Aldrich Co, 99.9 %)에 용해하여 조제하였다.
복귀돌연변이 시험을 위한 대사활성계 S-9 mix 1ml 중의 조성은 8μmol MgCl2ㆍ6H2O, 33μmol KCl, 5μmol G-6-P, 4μmol NADPH, 4μmol NADH, 100μmol sodium phosphate buffer(pH 7.4) 및 Aroclor-1254로 유도한 수컷 Sprague-Dawley 랫드의 간을 기원으로 하는 50μl S-9으로 하였으며, 조제한 S-9 mix는 얼음에 채워 사용하였다.
본 연구의 시험물질인 HMC05 (半夏 1.5 : 白朮 2 : 天麻 1 : 陳皮 1 : 茯苓 1.5 : 山楂 1.5 : 豨薟 1.5 : 黃連 1.5 ; Table 1)는 (주) Bioland (충남, 한국)에 의뢰하여 제조하였다. 100℃에서 1시간 30분 전탕한 후 추출액을 여과지 (1µm)로 여과하고 진공농축기 (진공도 60-70 cmHg)로 감압 농축하여 멸균탱크(100'C)에서 1시간 가열하고 1일간 방치한 후 다시 1시간 가열하여 연조엑스를 실험에 사용하였다.
시험물질 HMC05는 순도에 보정하여 조제에 사용하였다. 먼저 시험물질은 멸균주사용수(G212F21, 대한약품공업주식회사)에 현탁한 후 단계별 희석 및 조제하였다.
데이터처리
대조군과 양성대조물질 투여군의 비교는 Mann-Whitney U test를 실시하였다.14) PCE/(PCE+NCE) 및 체중에 대하여 대조군과 시험물질 투여군은 ANOVA test를 실시하고 다중비교 검정하였다. 대조군과 양성대조물질투여군의 비교는 독립표본 T 검정을 실시하였다.
소핵유발 빈도와 세포독성의 지표가 되는 PCE/(PCE+NCE)에서 대조군과 시험물질 투여군의 비교는 비모수 방법인 Kruskal-Wallis’ H-test를 실시하고 다중 비교 검정하였다. 대조군과 양성대조물질 투여군의 비교는 Mann-Whitney U test를 실시하였다.14) PCE/(PCE+NCE) 및 체중에 대하여 대조군과 시험물질 투여군은 ANOVA test를 실시하고 다중비교 검정하였다.
14) PCE/(PCE+NCE) 및 체중에 대하여 대조군과 시험물질 투여군은 ANOVA test를 실시하고 다중비교 검정하였다. 대조군과 양성대조물질투여군의 비교는 독립표본 T 검정을 실시하였다.
소핵 출현빈도는 개체 당 2,000개의 PCE에서 관찰되는 MNPCE 수의 평균±표준편차로 나타내었다.
소핵유발 빈도와 세포독성의 지표가 되는 PCE/(PCE+NCE)에서 대조군과 시험물질 투여군의 비교는 비모수 방법인 Kruskal-Wallis’ H-test를 실시하고 다중 비교 검정하였다.
이론/모형
골수 검체제작은 최종 투여로부터 24시간 후에 Schmid13)의 방법에 따라 골수세포를 수거하여 개체당 2매의 검체를 제작하였다. 골수세포는 각 동물로 부터 적출한 대퇴골을 23G 주사침을 사용하여 3㎖의 Fetal Bovine Serum(FBS, Gibco-BRL)으로 골수를 씻어내려 현탁한 다음 1,000rpm으로 5분간 원심분리 하여 얻었다.
D-2650) 90μl를 가하여 냉동 vial에 채워 Deep freezer 내에 냉동 보관하였으며, 형질이 확인된 균주의 master plate를 제작하여 시험에 사용하였다. 또 균주 유전자 형질확인을 위해 Salmonella typhimurium TA 균주들의 경우는 histidine 요구성 여부, uvrB mutation 유지 여부, R-factor 유지 여부, rfa 돌연변이의 유지 여부 및 spontaneous revertant의 수 등을 검사하였고, E. coli WP2 uvrA 균주에서는 tryptophan 요구성 여부, uvrA mutation 유지 여부 및 spontaneous revertant의 수 등을 Maron and Ames의 방법12)에 준하여 확인하였다.
복귀돌연변이 시험에서의 시험물질의 처리는 direct plate incorporation 방법으로 하였다. 즉 고압증기 멸균한 top agar를 dry bath에서 45℃로 예열한 tube에 2ml씩 분주한 다음 시험물질 용액 0.
TEKLADCERTIFIEDGLOBAL18%PROTEINR ODENTDIET,2918C)와 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 물을 자유롭게 섭취토록 하였다. 본 시험은 ㈜켐온의 동물실험윤리규정을 준수하여 실시하였다.
성능/효과
Salmonella typhimurium의 히스티딘 요구성 균주 TA100, TA1535, TA98 및 TA1537의 4개의 균주는 대사활성계 적용 및 비적용 시 시험물질 농도의 증가에 따른 집락수의 증가는 나타나지 않았으며, 항균성 또한 나타나지 않았다. E. coli WP2 uvrA도 대사활성계 적용 및 비적용 시 모두 시험물질 농도의 증가에 따른 집락수의 증가는 나타나지 않았으며, 항균성 또한 나타나지 않았다. 한편 모든 양성대조군에서는 음성대조군에 비하여 집락수가 현저히 증가하였다(Table 4).
Salmonella typhimurium의 히스티딘 요구성 균주 TA100, TA1535, TA98 및 TA1537의 4개의 균주는 대사활성계 적용 및 비적용 시 시험물질 농도의 증가에 따른 집락수의 증가는 나타나지 않았으며, 항균성 또한 나타나지 않았다. E.
각 군간의 체중을 비교한 결과, 모든 시험물질 투여군에서 통계학적으로 유의한 변화는 나타나지 않았다(Table 3).
개체 당 2,000개의 PCE에서 관찰된 소핵을 가진 PCE(MNPCE) 빈도는 음성대조군, 시험물질 1,250㎎/㎏/day 투여군, 2,500㎎/㎏/day 투여군, 5,000㎎/㎏/day 투여군 및 양성대조군의 순으로 평균 1.00, 0.83, 0.17, 2.33 및 95.67이었다. 시험물질 투여군의 소핵 빈도에 대하여 음성대조군과의 차이를 조사한 결과, 시험물질을 투여한 모든 군에서 통계학적으로 유의한 증가는 나타나지 않았다.
결과의 판정은 생존한 동물의 총 적혈구 중 다염성적혈구의 비율이 모두 0.1 이상일 때 시험은 유효한 것으로 간주하였으며, 투여군에서의 MNPCE의 빈도가 대조군과 비교하여 용량 상관성 있게 증가하거나 통계학적으로 P<0.05 인 경우에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
한편 HMC05의 Salmonella typhimurium의 히스티딘 요구성 균주인 TA100, TA1535, TA98 및 TA1537의 4개의 균주와 대장균 Escherichia coli의 트립토판 요구성 균주인 WP2 uvrA를 이용하여 대사활성계 적용(+S) 및 비적용(-S)하에 복귀돌연변이 시험을 실시하였다. 농도 결정을 위한 예비시험에서 시험물질 1.6, 8, 40, 200, 1,000, 2,500, 5,000㎍/plate와 음성 및 양성대조군으로 시험군을 구성하여 시험한 결과 집락수의 증가 및 감소가 관찰되지 않았다. 위 결과를 근거로 하여 시험물질 HMC05는 모든 균주에 대해 대사활성계 적용 및 비적용 시 62, 185, 556, 1,667, 5,000㎍/plate의 5단계 농도를 설정하였다.
시험 결과, 시험물질 최고농도 및 S-9 mix의 무균성을 확인하기 위한 플레이트에서 미생물 오염으로 인한 복귀돌연변이 집락은 나타나지 않았다. 동시에 모든 양성대조군에서는 음성대조군에 비하여 현저한 집락수의 증가를 보였으나, 시험물질 투여군에서는 최고 농도에 이르기까지 음성대조군에 비해 집락수의 유의한 증가가 나타나지 않았다. 따라서 본 시험 조건에서 HMC05는 복귀돌연변이를 일으키지 않는 것으로 확인되었다.
동시에 모든 양성대조군에서는 음성대조군에 비하여 현저한 집락수의 증가를 보였으나, 시험물질 투여군에서는 최고 농도에 이르기까지 음성대조군에 비해 집락수의 유의한 증가가 나타나지 않았다. 따라서 본 시험 조건에서 HMC05는 복귀돌연변이를 일으키지 않는 것으로 확인되었다.
복귀돌연변이 시험의 결과는 각 농도군 당 3개의 평판으로부터 얻은 집락수의 평균±S.D. 및 음성대조군에 대한 증가 배수로 나타내었으며, 집락 수의 실측치도 아울러 나타내었다.
세포독성의 지표인 PCE/(PCE+NCE) 비율은 1,250과 2,500㎎/㎏/day의 투여군에서 통계적으로 유의한 감소가 나타나지 않았으나, 5,000㎎/㎏/day 투여군(P<0.01)과 CPA를 처리한 양성대조군에서는 음성대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 감소가 나타나 골수세포에서 세포독성을 나타내었다.
위 결과를 근거로 하여 시험물질 HMC05는 모든 균주에 대해 대사활성계 적용 및 비적용 시 62, 185, 556, 1,667, 5,000㎍/plate의 5단계 농도를 설정하였다. 시험 결과, 시험물질 최고농도 및 S-9 mix의 무균성을 확인하기 위한 플레이트에서 미생물 오염으로 인한 복귀돌연변이 집락은 나타나지 않았다. 동시에 모든 양성대조군에서는 음성대조군에 비하여 현저한 집락수의 증가를 보였으나, 시험물질 투여군에서는 최고 농도에 이르기까지 음성대조군에 비해 집락수의 유의한 증가가 나타나지 않았다.
67이었다. 시험물질 투여군의 소핵 빈도에 대하여 음성대조군과의 차이를 조사한 결과, 시험물질을 투여한 모든 군에서 통계학적으로 유의한 증가는 나타나지 않았다. 한편 소핵 빈도에서 양성대조군은 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의하며 현저한 증가가 나타났다(P<0.
이상의 마우스 골수세포에서의 소핵시험과 세균을 이용한 복귀돌연변이 시험을 통하여 시험물질 HMC05는 유전독성을 유발하지 않는 것으로 사료된다.
먼저 경구투여 소핵시험을 위한 투여량 설정(Annex 2)은 예비시험에서 1,250, 2,500 및 5,000㎎/㎏/day의 용량으로 암수 각 3 마리에 1일 1회, 2일간 경구 투여하고 투여일 포함 4일간 관찰한 결과 특별한 육안적 이상소견이 관찰되지 않아 멸균주사 용수를 투여하는 음성대조군을 설정하고, 5,000㎎/㎏/day를 본시험의 고용량군으로 설정하여 공비를 2로 아래의 1,250, 2,500㎎/㎏/day의 용량으로 1일 1회,2일간 마우스에 경구투여하고, 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수세포를 수거하여 소핵과 세포독성을 관찰하였다. 적용한 용량범위 내에서 개체 당 2,000개의 PCE를 대상으로 소핵을 계수한 결과, 시험물질 HMC05는 투여한 모든 군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가는 없었다. 그러나 CPA를 처리한 양성대조군에서도 음성대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 증가를 나타내었다(P<0.
한편 소핵 빈도에서 양성대조군은 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의하며 현저한 증가가 나타났다(P<0.01).
01)과 CPA를 처리한 양성대조군에서는 음성대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 감소가 나타나 골수세포에서 세포독성을 나타내었다. 한편 시험물질 투여로 인한 일반증상에서 특별한 육안적 이상소견은 관찰되지 않았으며, 체중변화에 있어서도 각 군간의 체중을 비교한 결과 모든 시험물질 투여군에서 통계학적으로 유의한 변화는 나타나지 않았다. 따라서 시험물질 HMC05는 식품의약청 안전청 고시 제 2005-60 “ 의약품등의 독성시험기준”에 명시된 마우스 최대 투여용량인 2,000㎎/㎏/day의 범위내에서 마우스 골수세포에 소핵을 유발하지 않는 것으로 생각된다.
항균성은 기본성장균층이 엷어지거나 없어질 때 혹은 집락수가 음성대조군에 비해 현저히 감소하는 것으로 판단하였다. 집락수의 ‘현저한 감소’에 대해서는 공통된 기준이 없으므로 본 시험에서는 편의상 집락수가 음성대조군에서 나타난 집락수 평균치의 50% 이하로 감소한 경우를 항균성으로 판단하였다.
후속연구
또 후속 연구로서 식품의약품안전청고시 제2009-19호(2009년 05월 1일) ‘비임상시험 관리기준’9) 및 OECD Principles of Good Laboratory Practice(1997)10)에 따라 실시한 대사활성계 적용 및 비적용하에서 배양한 포유동물세포인 Chinese Hamster Lung(CHL) 세포의 유전독성 시험에서 HMC05에 의한 염색체 이상은 발견되지 않았다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
HMC05은 어떻게 희석 및 조제하였는가?
시험물질 HMC05는 순도에 보정하여 조제에 사용하였다. 먼저 시험물질은 멸균주사용수(G212F21, 대한약품공업주식회사)에 현탁한 후 단계별 희석 및 조제하였다. 경구투여 소핵시험을 위한 양성 대조물질은 투여 직전에 멸균주사용수에 용해하여 조제하였다.
천연물 한의약제제의 개발에 있어서 유전독성의 연구는 어떤 부분인가?
천연물 한의약제제의 개발에 있어서 유전독성의 연구는 제제의 안전성 평가를 위한 중요한 부분이다. 한방치료기술연구개발사업(B030007, B050042) 프로젝트의 일환으로 개발된 HMC05는 고혈압과 동맥경화의 예방 및 치료를 목표로 개발된 복합제제이다.
HMC05의 개발목적은 무엇인가?
천연물 한의약제제의 개발에 있어서 유전독성의 연구는 제제의 안전성 평가를 위한 중요한 부분이다. 한방치료기술연구개발사업(B030007, B050042) 프로젝트의 일환으로 개발된 HMC05는 고혈압과 동맥경화의 예방 및 치료를 목표로 개발된 복합제제이다.
참고문헌 (17)
Moon KJ, Jang HO, Kim GW, Shin HM. Signaling mechanism on the vascular relaxation of HMC05. Korean J Oriental Physiology & Pathology. 2008 ; 22(2) : 315-320.
Kim KM, Choi JY, Yoo SE, Park MY, Lee BS, Ko YH, et al. HMCO5, Herbal Extract, Inhibits NF- $\kappa$ B Expression in Lipopolysaccharide Treated Macrophages and Reduces Atherosclerotic Lesions in Cholesterol Fed Mice. Journal of Ethnopharmacology. 2007 ; 114 : 316-324.
Lee JS, Park SY, Thapa D, Kim AR, Shin HM, Kim JA. HMC05, Herbal Formula, Inhibits TNF-{alpha}-induced Inflammatory Response in Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Evid Based Complent Alternat Med. 2009 ; Sep 7(in publish).
Kim SH, Choi EJ, Lee KY, Sung SH, Shin HM. Simultaneous determination of alkaloids and flavonoids in HMC05 prreparaation by HPLC-DAD. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. (삭제) 2008 ; 31 : 2917-2926.
Lovell DP, Anderson DR, Albanese GE, Amphlett G, Clare R,. Ferguson M et al. Statistical analysis on in vivo cytogenetic assays, In: Statistical evaluation of mutagenicity test data (Kirkland DJ. ed), Cambridge, Cambridge University Press. 1989 ; 184-232.
Heddle JA, Stuart E, Salamone MF. The bone marrow micronucleus test, In: Handbook of mutagenicity test procedures, 2nd edition (edited by Kilbey BJ, Legator M, Nichols W, Ramel C), Elsevier Science Publishers BV. 1984 : 441-457.
OECD. OECD guidelines for the testing of chemicals, TG 473. In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test. 1997.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.