Colorectal cancer is one of the most common alimentary malignancies. In this study, the antitumor activity of activated human natural killer (NK) cells against human colorectal cancer was evaluated in vivo. Human NK cells are the key contributors of innate immune response and the effective functions...
Colorectal cancer is one of the most common alimentary malignancies. In this study, the antitumor activity of activated human natural killer (NK) cells against human colorectal cancer was evaluated in vivo. Human NK cells are the key contributors of innate immune response and the effective functions of these cells are enhanced by cytokines. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured with interleukin-2 (IL-2)-containing medium for 14 days and resulted in enriched NK cell population. The resulting populations of the cells comprised 7% $CD3^+CD4^+$ cells, 25% $CD3^+CD8^+$ cells, 13% $CD3^-CD8^+$ cells, 4% $CD3^+$CD16/$CD56^+$ cells, 39% $CD3^+$CD16/$CD56^-$ cells, and 52% $CD3^-$CD16/$CD56^+$ cells. Tumor necrosis factor alpha (TNF-$\alpha$), interferon gamma (IFN-$\gamma$), IL-2, IL-4, and IL-5 transcripts of the activated NK cells were confirmed by RT-PCR. In addition, activated NK cells at doses of 2.5, 5 and 10 million cells per mouse inhibited 10%, 34% and 47% of SW620-induced tumor growth in nude mouse xenograft assays, respectively. This study suggests that NK cell-based immunotherapy may be used as an adoptive immunotherapy for colorectal cancer patients.
Colorectal cancer is one of the most common alimentary malignancies. In this study, the antitumor activity of activated human natural killer (NK) cells against human colorectal cancer was evaluated in vivo. Human NK cells are the key contributors of innate immune response and the effective functions of these cells are enhanced by cytokines. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured with interleukin-2 (IL-2)-containing medium for 14 days and resulted in enriched NK cell population. The resulting populations of the cells comprised 7% $CD3^+CD4^+$ cells, 25% $CD3^+CD8^+$ cells, 13% $CD3^-CD8^+$ cells, 4% $CD3^+$CD16/$CD56^+$ cells, 39% $CD3^+$CD16/$CD56^-$ cells, and 52% $CD3^-$CD16/$CD56^+$ cells. Tumor necrosis factor alpha (TNF-$\alpha$), interferon gamma (IFN-$\gamma$), IL-2, IL-4, and IL-5 transcripts of the activated NK cells were confirmed by RT-PCR. In addition, activated NK cells at doses of 2.5, 5 and 10 million cells per mouse inhibited 10%, 34% and 47% of SW620-induced tumor growth in nude mouse xenograft assays, respectively. This study suggests that NK cell-based immunotherapy may be used as an adoptive immunotherapy for colorectal cancer patients.
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문제 정의
이 연구를 통하여 인간 결장암에 대한 활성화된 자연살해세포의 항암능력을 시험하였다. 우리는 IL-2를 이용하여 human peripheral blood mononuclear cells 에서 ex vivo expansion을 통해 자연살해세포를 세포 수를 증가시키고, phenotype을 결정지었으며nude mouse xenograft model을 이용하여 NKM의 항암능력을 평가하였다.
RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)은 이 연구에서 사용하였던 활성화된 NKM의 cytokine 발현을 분석하기 위해 진행하였다. 세포는 phytohemagglutinin(PHA; 3 µg/ml)에 0, 0.
본 연구에서는 결장암 유발 nude mouse xenograft 모델에 활성화된 NK cell의 항암효과를 관찰하였으며, NK cell immunotherapy 가능성을 증명하였다. Human PBMC를 IL-2가 함유된 배지에서 14일 배양함으로써 CD3-CD56+ 표현형을 나타내는 NK cell을 증폭시켰다.
가설 설정
20) 셋째, 결장암에서 기존 종양과 전이 종양 세포에서의 FasL발현이 보다 더 빈번했다.21) T세포 표면에서 FasL이 Fas(Apo-1/CD95)이 결합하는 것은 활성화 된 T세포의 apoptotic cell death을 야기한다. 넷째, 결장암 환자에게서 peripheral blood lymphocyte와 T cell infiltrates(TIL)의 T 세포 수용체인 CD3 zeta chain의 발현 감소가 증명되었다.
23-28) 하지만, DC therapy는 이식된 대식 세포가 activate effector T cells로의 변화가 어렵고 화학요법에 의해서 보통 억제된다.29) CTL therapy는 MHC-restricted mechanism, tumor-associated antigen의 억제, tumor-specific CTL의 적은 수에 의해 저해된다.30) Solid tumors에 대한 NK와 LAK cell therapy의 효능은 cancer cell에 대해 제한된 세포독성 활성을 나타내었다.
제안 방법
세척 후, 5% human serum(Biowhittaker-Cambrex, Walkersville, MD)가 함유된 Lymphomedia로 1×106 cells/ml로 현탁하였으며, 고정화시킨 anti-CD3 antibody(OKT-3 10 ng/ml; BD Pharmingen, NJ, USA)와 recombinant human IL-2(Proleukin 500 U/ml, Chiron, Emeryville, CA, USA) 함께 5일 동안 배양하였다.
Human β-actin은 cDNA 합성의 대조군(control)으로써 PCR을 진행하였다.
세포는 phytohemagglutinin(PHA; 3 µg/ml)에 0, 0.3, 1, 5시간 노출시킨 뒤, TRIZOLTM reagent(Molecular Research Center, Cincinnaati, OH, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다.
이들 세포에 항체를 첨가한 후 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후, PBS로 2번 세척하고 400 µl의 PBS로 다시 현탁시켜 FACSCanto flow cytometer(BD Biosciences, CA, USA)로 측정하여 WinMDI statistical software(Scripps, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
이 연구를 통하여 인간 결장암에 대한 활성화된 자연살해세포의 항암능력을 시험하였다. 우리는 IL-2를 이용하여 human peripheral blood mononuclear cells 에서 ex vivo expansion을 통해 자연살해세포를 세포 수를 증가시키고, phenotype을 결정지었으며nude mouse xenograft model을 이용하여 NKM의 항암능력을 평가하였다.
NK세포의 증폭은 건강한 지원자의 말초혈액 단핵세포(peripheral mononuclear cells, PBMC)로 만들어졌다. 지원자에게는 사전의 충분한 설명과 자유의사에 의한 동의를 거친 후, heparin과 함께 40 ml의 혈액을 채취하였다. 말초혈액 단핵세포는 buffy coats를 포함하고 있기 때문에 Ficoll-Hypaque density centrifugation분리법과 PBS를 이용하여 세척하였다.
세척 후, 5% human serum(Biowhittaker-Cambrex, Walkersville, MD)가 함유된 Lymphomedia로 1×106 cells/ml로 현탁하였으며, 고정화시킨 anti-CD3 antibody(OKT-3 10 ng/ml; BD Pharmingen, NJ, USA)와 recombinant human IL-2(Proleukin 500 U/ml, Chiron, Emeryville, CA, USA) 함께 5일 동안 배양하였다. 5일 배양 후 OKT-3를 함유한 배지를 버리고, rhIL-2(500 U/ml)와 5% human serum이 함유된 새로운 배지로 교체한 뒤, rhIL-2가 함유된 배지로 매 배양주기 때마다 보충하여 준다. 배양 주기 동안 세포수는 약 1×106 cells/mm를 유지하도록 한다.
인간항체인 anti-CD3-FITC/CD16+CD56-PE, anti-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP(BD Biosciences, CA, USA)를 이용하여 enriched NK세포의 표현형을 분석하였다. 약 1×106 cells를 1% bovine serum albumin(BSA)를 첨가한 PBS/BSA buffer로 한번 세척한 후, PBS/BSA buffer 100 µl안에 현탁시켰다.
이들 세포에 항체를 첨가한 후 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후, PBS로 2번 세척하고 400 µl의 PBS로 다시 현탁시켜 FACSCanto flow cytometer(BD Biosciences, CA, USA)로 측정하여 WinMDI statistical software(Scripps, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. NKM의 생존률은 FACSCanto flow cytometer(BD Biosciences, CA, USA)을 통해 측정했다. Propidium iodide(PI, 1 µg/ml)를 이용하여 세포를 10분간 염색하였으며, PI positive 세포는 죽은 세포로 간주하였다.
3, 1, 5시간 노출시킨 뒤, TRIZOLTM reagent(Molecular Research Center, Cincinnaati, OH, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 얻어낸 total RNA는 AccuPower RT PreMix PCR kit(Bioneer, Daegeon, Korea)를 이용하여 semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)를 진행하였다. RT-PCR반응은 얻은 cDNA 1 µl를 template로 하여, 94℃에서 30초 변성(denaturation), 54℃에서(IL-2, IL-4, IL-5, and β-actin) 혹은 57℃(TNF-α and IFN-γ)에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 신장(extension)의 과정으로 이루어지는 1사이클을 30회 반복 수행하였다(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Human β-actin은 cDNA 합성의 대조군(control)으로써 PCR을 진행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동을 하여 분석하였다.
투여한 NKM의 human TNF-α, INF-γ, IL-2, IL-4, IL-5의 mRNA transcript level 의 분석을 위해 PHA-stimulated 혹은 unstimulated NK cells에서 추출한 total RNA를 이용하여 semiquantitative RT-PCR를 시행하였다.
5, 5, 10×106 cells/mouse로 정맥 투여하였다. 양성대조군인 Adriamycin(ADR; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)도 매주 1회씩 총 3회 투여하였다. Tumor volume은 가로(mm)×세로(mm)×높이(mm)/2로 측정하였다.
Tumor volume은 가로(mm)×세로(mm)×높이(mm)/2로 측정하였다. 최종일(16 day)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다. NKM의 독성을 확인하기 위하여 nude mouse의 체중변화를 측정하였다.
최종일(16 day)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다. NKM의 독성을 확인하기 위하여 nude mouse의 체중변화를 측정하였다.12)
하지만, IL-2를 함유하는 배지에서 14일 배양 후, 5배 이상의 면역세포의 증가가 나타났다. 배양한 세포를 fluorescence-activated cell sorting(FACS) 분석을 수행하여 NKM의 표현형을 확인하였다. NKM은 7% CD3+CD4+ cells, 25% CD3+CD8+ cells, 13% CD3-CD8+ cells, 4% CD3+CD16/CD56+ cells, 39% CD3+CD16/CD56- cells, 52% CD3-CD16/CD56+ cells로 구성되어 있었다(Fig.
1 − The phenotypic characterization of the activated NK cells, which was used in nude mouse xenograft assay. Human PBMCs were cultured in the presence of IL-2 for 14 days and the resulting NK cell populations were stained with human antibodies, such as anti-CD3-FITC/CD16+CD56- PE (A) and anti-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP (B, C, and D), followed with FACS analysis.
Nude mouse xenograft 분석을 통하여 NKM의 항암효과를 검증하였다. 예비실험을 통하여 3×108 cells(유효용량의 약 30배)의 NKM을 nude mice에 투여할 경우에도 탈모, 이상행동, 체중 감소의 유의한 독성은 관찰되지 않았다.
최종일(16일)에 nude mouse에서 종양을 분리한 후 무게를 측정하여 SW620 종양에 대한 NKM의 영향을 증명하였다(Fig. 3B and C). SW620 종양의 무게는 주입 16일 후 429 mg으로 무게가 증가하였다.
본 연구에서는 활성 자연살해세포의 인간 결장암(SW620)에 대한 항암효과를 nude mouse xenograft model을 이용하여 검증하였다. 활성 자연살해세포의 독성을 확인하기 위하여 16일 동안 nude mouse의 체중변화와 행동변화를 관찰하여 유효용량에서의 독성이 없음을 검증하였다. Nude mouse에 이식된 SW620 세포는 7일째부터 육안으로 관찰되기 시작하였으며 16일째까지 꾸준한 성장을 보였다.
33,34) NK cell infiltration은 gastric carcinoma, squamous cell lung carcinoma, colorectal cancer 같은 몇몇의 암 종류에서 positive prognostic parameter로 이용된다.35-37) 게다가, human malignant cells은 human NK cells 투여 후 약화되거나 전이가 억제되어진다는 것을 severe combined immunodeficiency(SCID) mouse model을 통한 실험으로 규명하였다.38,39) 이러한 결과가 tumor Immunosurveillance와 NK cell의 Immunotherapy strategies로의 가능성을 제시해준다.
본 연구에서는 결장암 유발 nude mouse xenograft 모델에 활성화된 NK cell의 항암효과를 관찰하였으며, NK cell immunotherapy 가능성을 증명하였다. Human PBMC를 IL-2가 함유된 배지에서 14일 배양함으로써 CD3-CD56+ 표현형을 나타내는 NK cell을 증폭시켰다. mouse xenograft model을 이용한 NKM의 결장암에 대한 항암효과는 향 후 결장암 치료를 위한 cell immunotherapy로 가능성을 증명하였다.
RT-PCR반응은 얻은 cDNA 1 µl를 template로 하여, 94℃에서 30초 변성(denaturation), 54℃에서(IL-2, IL-4, IL-5, and β-actin) 혹은 57℃(TNF-α and IFN-γ)에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 신장(extension)의 과정으로 이루어지는 1사이클을 30회 반복 수행하였다(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
대상 데이터
Human tumor xenograft 실험을 위해 SLC Japan, Inc에서 생산된 Specific pathogen-free female BALB/c-nu/nu mice(nude mice)를 사용하였다. Mice는 (6~8 weeks old) 충북대학교 실험동물연구지원센터의 SPF시설에서 1주일 동안 순화시킨 후 진행하였다.
Human tumor xenograft 실험을 위해 SLC Japan, Inc에서 생산된 Specific pathogen-free female BALB/c-nu/nu mice(nude mice)를 사용하였다. Mice는 (6~8 weeks old) 충북대학교 실험동물연구지원센터의 SPF시설에서 1주일 동안 순화시킨 후 진행하였다. 시험 당일(0 day) SW620을 2×106 cells/mouse의 농도로 nude mice에 피하 이식하였다.
3 − Inhibition of SW620-induced tumor growth by activated NK cells in nude mouse xenograft models. Nude mice (n=9) were implanted subcutaneously with two million SW620 cancer cells. The activated NK cells at doses from 2.
SW620(ATCC # CCL-227)세포는 51세의 코카시안 남성으로부터 분리되어 확립된 colorectal adenocarcinoma cell로, 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin(Invitrogen, CA, USA)를 함유한 RPMI-1640 medium에서 배양하였다. NK세포의 증폭은 건강한 지원자의 말초혈액 단핵세포(peripheral mononuclear cells, PBMC)로 만들어졌다.
데이터처리
표준편차(SD)와 p-values는 Student's t-test 및 ANOVA(GraphPad Prism, GraphPad Software, CA, USA)를 사용하여 산출하였다.
이론/모형
지원자에게는 사전의 충분한 설명과 자유의사에 의한 동의를 거친 후, heparin과 함께 40 ml의 혈액을 채취하였다. 말초혈액 단핵세포는 buffy coats를 포함하고 있기 때문에 Ficoll-Hypaque density centrifugation분리법과 PBS를 이용하여 세척하였다. 세척 후, 5% human serum(Biowhittaker-Cambrex, Walkersville, MD)가 함유된 Lymphomedia로 1×106 cells/ml로 현탁하였으며, 고정화시킨 anti-CD3 antibody(OKT-3 10 ng/ml; BD Pharmingen, NJ, USA)와 recombinant human IL-2(Proleukin 500 U/ml, Chiron, Emeryville, CA, USA) 함께 5일 동안 배양하였다.
본 연구에서는 활성 자연살해세포의 인간 결장암(SW620)에 대한 항암효과를 nude mouse xenograft model을 이용하여 검증하였다. 활성 자연살해세포의 독성을 확인하기 위하여 16일 동안 nude mouse의 체중변화와 행동변화를 관찰하여 유효용량에서의 독성이 없음을 검증하였다.
성능/효과
p>결장암(Colon cancer)은 남녀 모두에게 흔히 발병하는 악성종양으로써 암 사망률3위에 해당된다.1,2) 결장암의 발생은 개발도상국과 선진국 모두 과거에 비해 증가하는 추세이며, 소화계에 새로이 진단되는 암 중 40%를 차지한다고 보고되었다.2) 결장암은 수술 및 보조 화학 요법으로 치료한다.
2) 결장암은 수술 및 보조 화학 요법으로 치료한다.3) 이러한 치료법이 확실히 암 치료의 향상에 도움을 주지만, 2기 혹은 3기의 결장암 환자의 경우 치료 3년 내에 재발하거나 전이가 발생한다.4) 사망자의 대부분이 간과 같은 기관으로의 전이가 발생하였으며, 이는 암환자 사망 원인 중 50%에 해당된다.
3) 이러한 치료법이 확실히 암 치료의 향상에 도움을 주지만, 2기 혹은 3기의 결장암 환자의 경우 치료 3년 내에 재발하거나 전이가 발생한다.4) 사망자의 대부분이 간과 같은 기관으로의 전이가 발생하였으며, 이는 암환자 사망 원인 중 50%에 해당된다.5-7) 결장암 환자의 생존율을 높이기 위해서는 효과적인 대체 보조 요법에 대한 개발이 절실하다.
예비실험을 통하여 3×108 cells(유효용량의 약 30배)의 NKM을 nude mice에 투여할 경우에도 탈모, 이상행동, 체중 감소의 유의한 독성은 관찰되지 않았다.
최종일에 종양을 분리한 후 무게를 측정한 결과 NKM을 2.5, 5, 10×106 cells/mouse 투여에 의해10%, 34%, 47%의 종양성장 억제를 확인하였다.
NKM을 5×106 cells/mouse 투여군에서는 25%의 종양 성장 억제를, NKM을 10×106 cells/mouse 투여군에서는 44%의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다. 양성대조군으로 사용한 ADR 투여군에서는 52%의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다.
전반적으로, NKM 투여군에서 109~112%의 체중증가를 보였으며, 이는 NKM이 체중에 미치는 영향이 없고 독성이 없음을 시사한다(Fig. 3D).
5, 5, 10×106 cells/mouse 투여에 의해10%, 34%, 47%의 종양성장 억제를 확인하였다. 이러한 결과로부터 활성 자연살해세포는 인간 결장암(SW620)에 대한 항암효과가 있음을 확인하였으며, 유효용량에서 독성이 없음을 검증하여 세포면역치료법으로의 가능성을 제시하였다.
14) 5-flurouracil-based regimens 나 irinotecan 같은 새로운 물질을 이용하여 진행하는 Adjuvant systemic chemotherapy는 고 위험 질병의 환자들의 생존율을 향상시켰다.15-18) 그럼에도 불구하고 결장암으로 진단받은 환자의 10년 후 생존율은 60%에 불과하다.
19) 둘째, 결장암에서 peptide transporting molecules(TAP)의 변성이 관찰되었으며, 이는 T cell epitope과 억제된cellular immunity의 결과로 초래되었다고 보여진다.20) 셋째, 결장암에서 기존 종양과 전이 종양 세포에서의 FasL발현이 보다 더 빈번했다.21) T세포 표면에서 FasL이 Fas(Apo-1/CD95)이 결합하는 것은 활성화 된 T세포의 apoptotic cell death을 야기한다.
21) T세포 표면에서 FasL이 Fas(Apo-1/CD95)이 결합하는 것은 활성화 된 T세포의 apoptotic cell death을 야기한다. 넷째, 결장암 환자에게서 peripheral blood lymphocyte와 T cell infiltrates(TIL)의 T 세포 수용체인 CD3 zeta chain의 발현 감소가 증명되었다.22)
NKM은 2.5, 5, 10×106 cells/mouse의 농도로 정맥주사하였으며, in vivo 종양성장의 각각 10%, 34%, 47%를 억제하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
결장암은 암사망률 몇 위인가?
결장암(Colon cancer)은 남녀 모두에게 흔히 발병하는 악성종양으로써 암 사망률3위에 해당된다.1,2) 결장암의 발생은 개발도상국과 선진국 모두 과거에 비해 증가하는 추세이며, 소화계에 새로이 진단되는 암 중 40%를 차지한다고 보고되었다.
결장암을 치료하기 위한 수술 및 보조 화학 요법의 한계점은 무엇인가?
2) 결장암은 수술 및 보조 화학 요법으로 치료한다.3) 이러한 치료법이 확실히 암 치료의 향상에 도움을 주지만, 2기 혹은 3기의 결장암 환자의 경우 치료 3년 내에 재발하거나 전이가 발생한다.4) 사망자의 대부분이 간과 같은 기관으로의 전이가 발생하였으며, 이는 암환자 사망 원인 중 50%에 해당된다.
면역요법이 새로운 치료 요법으로 부각되는 이유는 무엇인가?
5-7) 결장암 환자의 생존율을 높이기 위해서는 효과적인 대체 보조 요법에 대한 개발이 절실하다. 면역요법은 기존의 화학요법제인 항암제가 가졌던 독성 문제를 해결하고 암세포에 특이적으로 작용하며, 전이된 암세포까지의 치료가 가능하다는 장점을 갖고 있어 새로운 치료 요법으로 부각되고 있다.
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