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문제 정의
- 동일한 양의 자연살해세포가 투여되었을때, 결장암(SW-620)이 이식된 nude mice에서 나타난 25%, 44%, 52%의 종양억제효과에 비해 상대적으로 낮은 효능을 나타냈으나, 자연살해세포의 투여양에 비례하며 항암효능이 증대되어 것으로 미루어 유의한 효능으로 판단된다. 본 연구를 통하여 활성화된 자연살해세포의 Human non-small lung cancer에 항암효능이 있음을 nude mouse xenograft model을 이용하여 규명하였고, 향후 lung cancer 치료를 위한 cell immunotherapeutics로 사용 가능성을 알 수 있었다.
제안 방법
- p>전체 암 발생의 4위에 해당하는 폐암은 여성보다 남성의 발병율이 더 높으며 세계적으로 점차 발생빈도가 증가하는 추세이다.1) 폐암은 병리학적으로 소세포성 폐암과 비소세포성 폐암으로 분류되며, 병기에 따라 수술적 제거, 방사선 치료, 항암 화학 요법의 세가지 방법으로 치료한다. 병기가 이르고 발병부위가 국소적인 경우 수술과 방사선치료를 병행하며, 전신에 해당할 경우 항암약물치료요법으로 진행한다.
- 30,31) 결장암(SW-620)에서의 종양억제효능을 검증하여 정립된 실험법을 인용하여, In vivo에서의 항암효과를 확인하기 위하여 비소세포성 폐암(NCI-H460)를 2×106 cells/mouse 피하이식하였다.
- 지원자에게 사전의 충분한 설명을 통한 자유의사에 의한 동의를 거친 후, heparin과 함께 40 ml의 혈액을 채취하였다. Ficoll-Hypaque density centrifugation을 통해 말초혈액 단핵세포가 포함하고 있는 buffy coats를 분리하고 PBS를 이용하여 세척하였다. 세척 후, 5% human serum(Biowhitrraker-Cambrex, Malkersville, MD)가 함유된 Lymphomedia로 1×106 cells/ml로 현탁하여, 고정화 한 anti-CD3 antibody(OKT-3 10 ng/ml; BD Pharmingen, NJ, USA)와 recombinant human IL-2(Proleukin 500 U/ml, Chiron, Emeryville, USA) 함께 배양하였다.
- IL-2와 함께 배양하여 활성화된 자연살해세포를 약 1×106 cells 를 1% Bovine serum albumin(BSA)을 첨가한 PBS(BSA/PBS)로 한번 세척한 후, 50µl의 PBS/BSA를 이용하여 세포를 현탁하였다.
- 또, 자연살해세포에 의하여 유발되는 독성을 확인하기 위하여 nude mouse의 체중 변화를 21일 동안 측정하였으며, 육안으로 행동 변화를 관찰하였다. Day 0 의 체중(100%)과 비교하였을 때, day 21에 대조군의 경우 106%, 저, 중, 고용량의 투여군에서 각각 104%, 103%, 103%으로 정상적인 체중변화를 나타내었으며 이상행동 역시 관찰되지 않았다.
- 최종일(21 day)에 종양을 분리한 후 종양의 무게를 측정하고 종양의 크기는 가로(mm)×세로(mm)×높이(mm)/2로 측정하였다. 또한, 자가활성 자연살해세포의 독성을 확인하기 위하여 매주 투여하기 전nude mouse의 체중변화를 측정하였다.
- 본 연구에서는 인간 폐암(non-small cell lung cancer, NCI-H460)에 대한 ex vivo에서 활성화된 자연살해세포의 종양 억제 효과를 nude mouse xenograft model을 이용하여 in vivo상에서 검증하였다. 폐암은 전체 암 사망률 29%를 차지하며 기존의 수술 및 보조적인 치료에도 불구하고 재발과 전이가 쉬워 2008년 미국 남성 암사망율 1위로 보고되었다.
- 10-12) 이와 같이 활성화된 자연살해세포를 이용한 항암치료법은 기존의 화학요법제인 항암제가 가졌던 문제를 해결하고 다양한 암에 대한 암 특이 항원에 대하여 세포반응을 유발할 수 있어 암세포에 특이적으로 작용하며, 전이된 암세포까지 치료가 가능하다는 장점이 있다. 본연구진은 결장암에 대한 자연살해세포의 항암능력을 검증하여 보고한바 있으며,13) 기 정립된 최적화된 시험법을 이용하여 인간 폐암(비소세포성)에 대해 활성화된 자연살해세포의 암세포 성장억제능력을 확인하였다. 인간말초혈액을 채취, IL-2와 함께 14일간 배양함으로써 활성화된 자연살해세포의 종양 억제 효능을nude mouse xenograft model을 이용하여 평가하였다.
- 세척 후, 5% human serum(Biowhitrraker-Cambrex, Malkersville, MD)가 함유된 Lymphomedia로 1×106 cells/ml로 현탁하여, 고정화 한 anti-CD3 antibody(OKT-3 10 ng/ml; BD Pharmingen, NJ, USA)와 recombinant human IL-2(Proleukin 500 U/ml, Chiron, Emeryville, USA) 함께 배양하였다.
- 세포에 인간 항체 anti-CD3-FITC/CD16+CD56-PE와 anti-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP(BD Biosciences, USA)를 첨가한 후 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후, PBS로 두 번 세척하고 400 µl의 PBS로 다시 현탁시켜 FACS Canto flow cytometer(BD Biosciences, USA)로 측정한 뒤, WinMDI statistical software(Scripps, La Jolla, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 세포의 생존율은 동일하게 PBS/BSA로 세척한 뒤, 50 µl의 PBS/BSA를 이용하여 세포를 현탁하여 propidium iodide(1 µg/ml)를 세포에 10분간 염색하여 FACS Canto flow cytometer(BD Biosciences, USA)를 측정, PI positive 세포는 죽은 것으로 간주하였다.
- 시험 당일(0 day) 비소세포성 폐암 세포주인 NCI-H460을 2×106 cells/mouse의 농도로 nude mice에 피하 이식하였다.
- In vivo에서 활성화된 자연살해세포의 항암능력을 판단하기 위하여 SLC Japan, Inc.에서 생산된Specific pathogen-free female BALB/c-nu/nu mice(nude mice)를 이용하여 tumor xenograft 시험을 진행하였다. Mice는(6~8 weeks old) 충북대학교 실험동물연구지원센터의 SPF시설에서 1주일 순화시킨 후 진행하였다.
- 본연구진은 결장암에 대한 자연살해세포의 항암능력을 검증하여 보고한바 있으며,13) 기 정립된 최적화된 시험법을 이용하여 인간 폐암(비소세포성)에 대해 활성화된 자연살해세포의 암세포 성장억제능력을 확인하였다. 인간말초혈액을 채취, IL-2와 함께 14일간 배양함으로써 활성화된 자연살해세포의 종양 억제 효능을nude mouse xenograft model을 이용하여 평가하였다.14)
- 인간말초혈액에서 5~10%를 차지하는 자연살해세포를 IL-2를 함유한 배지에서 2주간 배양하여, 약 7배 정도의 고동도로 배양됨을 확인했다. 인간항체를 이용하여 Fluorescence-activated cell sorting(FACS) 분석을 통해 활성화된 자연살해세포의 표현형을 분석하였다. 분석결과, 배양한 세포는 87%의 생존율을 나타냈다(Fig.
- 5~10×106 cells/mouse)의 자연살해세포를 정맥주사하여 in vivo에서의 항암효능을 확인하였다. 자연살해세포는 1주일 1회씩 투여하여 저, 중, 고용량하였을 때, 각 2%, 12%, 45%의 억제효과를 확인하였다. 동일한 양의 자연살해세포가 투여되었을때, 결장암(SW-620)이 이식된 nude mice에서 나타난 25%, 44%, 52%의 종양억제효과에 비해 상대적으로 낮은 효능을 나타냈으나, 자연살해세포의 투여양에 비례하며 항암효능이 증대되어 것으로 미루어 유의한 효능으로 판단된다.
- PBMC)로 만들어졌다. 지원자에게 사전의 충분한 설명을 통한 자유의사에 의한 동의를 거친 후, heparin과 함께 40 ml의 혈액을 채취하였다. Ficoll-Hypaque density centrifugation을 통해 말초혈액 단핵세포가 포함하고 있는 buffy coats를 분리하고 PBS를 이용하여 세척하였다.
- 최종일(21 day)에 종양을 분리한 후 종양의 무게를 측정하고 종양의 크기는 가로(mm)×세로(mm)×높이(mm)/2로 측정하였다.
- 항암효과를 검증하기 위하여 Specific pathogen-free female BALB/c-nu/nu mice(nude mice)에 비소세포성 폐암 세포주인 NCI-H460을 2×106 cells/mouse로 피하 이식하여 21일 후 500±160 mm3(n=6) 크기로 성장을 확인했다.
- 활성화된 자연살해세포은 1주일에 한번씩(day 0, 7, 14) 2.5, 5, 10×106 cells/mouse로 정맥 투여하였으며, 양성대조군인 Adriamycin(ADR; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)도 매주 1회(2 mg/kg)씩 총 3회 투여하였다.
- 활성화된 자연살해세포의 암세포 성장 억제 효능을 확인하기 위하여 nude mouse xenograft 분석을 시행하였다. 예비시험에서 3×108 cells(유효용량의 약 30배)의 활성자연살해세포를 nude mouse에 투여한 결과 사망, 탈모, 이상행동, 체중 감소의 유의한 독성은 관찰되지 않았다.
대상 데이터
- 에서 생산된Specific pathogen-free female BALB/c-nu/nu mice(nude mice)를 이용하여 tumor xenograft 시험을 진행하였다. Mice는(6~8 weeks old) 충북대학교 실험동물연구지원센터의 SPF시설에서 1주일 순화시킨 후 진행하였다. 시험 당일(0 day) 비소세포성 폐암 세포주인 NCI-H460을 2×106 cells/mouse의 농도로 nude mice에 피하 이식하였다.
- 30,31) 결장암(SW-620)에서의 종양억제효능을 검증하여 정립된 실험법을 인용하여, In vivo에서의 항암효과를 확인하기 위하여 비소세포성 폐암(NCI-H460)를 2×106 cells/mouse 피하이식하였다. 시험기간인 21일 이내에 통계적으로 유의한 크기의 고형암을 형성하였으며, 시험기간 동안 자연살해세포에 의한 체중변화 및 육안적 이상행동은 관찰되지 않았다. 또한, 유효용량의 30배에 달하는 3×108 cells/mouse를 이식하여 관찰해봄으로써 활성화된 자연살해세포의 독성이 없음을 검증하였다.
데이터처리
- Statistical significance was determined using the Student’s t-test versus PBS-treated control group (**p<0.01).
- 표준편차(SD)와 p-values는 Student’s t-test 및 ANOVA(GraphPad Prism, GraphPad Software, USA)를 사용하여 산출하였다.
성능/효과
- 2) 하지만, 현재의 치료법은 암세포뿐 아니라 인근의 정상 세포까지 파괴하며 다른 질병에 쉽게 노출되는 등의 부작용을 야기하며 수술 및 보조요법에도 불구하고 재발이나 전이 가능성이 높아 진단 5년 후 생존율이 14%로 나타난다.
- 대조군의 평균 종양 무게는 802±199 mg이었으며, 자연살해세포를 2.5×106 cells/mouse로 투여한 경우에는 788±184 mg으로 2%의 종양 성장 억제를, 5×106 cells/mouse 투여군에서는 706±156 mg으로 12%의 종양 성장 억제를, 10×106 cells/mouse 투여군에서는 445±193 mg (p<0.05)으로 45%의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다.
- 자연살해세포는 1주일 1회씩 투여하여 저, 중, 고용량하였을 때, 각 2%, 12%, 45%의 억제효과를 확인하였다. 동일한 양의 자연살해세포가 투여되었을때, 결장암(SW-620)이 이식된 nude mice에서 나타난 25%, 44%, 52%의 종양억제효과에 비해 상대적으로 낮은 효능을 나타냈으나, 자연살해세포의 투여양에 비례하며 항암효능이 증대되어 것으로 미루어 유의한 효능으로 판단된다. 본 연구를 통하여 활성화된 자연살해세포의 Human non-small lung cancer에 항암효능이 있음을 nude mouse xenograft model을 이용하여 규명하였고, 향후 lung cancer 치료를 위한 cell immunotherapeutics로 사용 가능성을 알 수 있었다.
- 1A). 또한, 26% CD3+ T cells, 9% CD3+CD4+ T cells, 16% CD3+CD8+ T cells, 76% CD56+ cells, 6% CD3+CD56+ cells, 그리고 70% CD3-CD56+ 자연살해세포가 포함되어 있음을 분석을 통하여 확인하였다(Fig. 1B~G).
- 또한, 유효용량의 30배에 달하는 3×108 cells/mouse를 이식하여 관찰해봄으로써 활성화된 자연살해세포의 독성이 없음을 검증하였다.
- 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 159±80 mm3(p<0.001)으로 68%의 강력한 종양 성장 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(Fig. 2A).
- 예비시험에서 3×108 cells(유효용량의 약 30배)의 활성자연살해세포를 nude mouse에 투여한 결과 사망, 탈모, 이상행동, 체중 감소의 유의한 독성은 관찰되지 않았다.
- 2B). 이 같은 결과는 활성화된 자연살해세포가 농도의존적으로 비소세포성 폐암종양의 성장을 억제한다는 사실을 말해준다.
- 5일 배양 후 rhIL-2(500 U/ml)와 5% human serum가 함유된 배지로 교체한 뒤, 매 배양주기마다 1×106 cells/mm의 세포수를 유지하며 rhIL-2가 포함된 배지로 보충하며 배양하여준다. 이와 같은 세포 배양 방법을 통하여 얻은 자연살해세포에서 87%의 생존율을 확인하였다.
- 인간말초혈액에서 5~10%를 차지하는 자연살해세포를 IL-2를 함유한 배지에서 2주간 배양하여, 약 7배 정도의 고동도로 배양됨을 확인했다. 인간항체를 이용하여 Fluorescence-activated cell sorting(FACS) 분석을 통해 활성화된 자연살해세포의 표현형을 분석하였다.
- 25-29) 기존의 연구보고에 의하면 동물시험에서 자연살해세포의 투여용량은 1×105 cells/mouse에서 1×108 cells/mouse로 다양한데, 이는 암세포주의 종류, 이식되는 암세포의 수, 암세포의 이식부의, 면역세포의 투여횟수, 사용되는 실험동물의 종류 및 실험기간에 따라서 설정되는 것으로 판단된다. 자연살해세포의 항암능력에 대한 차이는 있으나 통계적으로 유의한 항암효과를 나타내었다.30,31) 결장암(SW-620)에서의 종양억제효능을 검증하여 정립된 실험법을 인용하여, In vivo에서의 항암효과를 확인하기 위하여 비소세포성 폐암(NCI-H460)를 2×106 cells/mouse 피하이식하였다.
- 즉, 형성된 종양의 부피를 기준으로, 각 실험군에서 자연살해세포를 2.5×106 cells/mouse로 저용량 투여한 경우에는 413±59 mm3 종양크기를 나타내어 17%의 성장 억제를, 5×106 cells/mouse 중용량 투여군에서는 347±98 mm3으로 31%의 성장 억제를, 10×106 cells/mouse 고용량 투여군에서는 249±132 mm3(p<0.05)으로 50%의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다.
- 2A). 최종일(21 day)에 nude mouse에서 종양을 분리하여 무게를 측청함으로써 NCI-H460에 대한 자연살해세포의 종양억제능력을 증명하였다. 대조군의 평균 종양 무게는 802±199 mg이었으며, 자연살해세포를 2.
후속연구
- 2) 하지만, 현재의 치료법은 암세포뿐 아니라 인근의 정상 세포까지 파괴하며 다른 질병에 쉽게 노출되는 등의 부작용을 야기하며 수술 및 보조요법에도 불구하고 재발이나 전이 가능성이 높아 진단 5년 후 생존율이 14%로 나타난다. 환자의 생존율을 향상시키기 위해서는 보다 선택적이며 효과적인 새로운 치료요법이 대한 개발이 필요하다. 면역세포를 이용한 항암치료는 암세포에 특이적으로 작용하여 독성이 적다는 장점을 갖고 있다.
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