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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 이미 벨리데이션이 입증된 대한약전의 센노사이드 A 정량방법으로 센노사이드 A와 라폰티신을 동시에 분석하고자 다른 여러 연구 등에서 대황의 라폰티신 분석시 사용된 메탄올과 대한약전의 탄산수소나트륨 용액을 사용했을 때와 방법 타당성 검증 파라미터에 따라 비교·확인하였다.
- 우리나라 시판되는 대황이 함량미달 제품 및 종대황이 혼재되어 판매되고 있는바 건전한 유통 관리를 위하여 많은 시료를 짧은 시간과 적은 비용으로 품질관리를 할 수 있도록 대황의 기원종간 특이 지표성분인 센노사이드 A와 라폰티신의 동시분석방법 하고자 하였다. 방법으로 대한약전의 센노사이드 A 정량법으로 적용하고자 방법 타당성 검증을 통해 신뢰성을 확보하였다.
제안 방법
- 998 이상을 기준으로 적합한 분석가능범위를 결정하였다. 검출한계(Limit of detection) 및 정량한계(Limit of quantification)는 반응의 표준편차와 검량선 기울기에 근거하는 방법에 따라 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량 y를 작성하여 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 그러므로 본 연구에서는 이미 벨리데이션이 입증된 대한약전의 센노사이드 A 정량방법으로 센노사이드 A와 라폰티신을 동시에 분석하고자 다른 여러 연구 등에서 대황의 라폰티신 분석시 사용된 메탄올과 대한약전의 탄산수소나트륨 용액을 사용했을 때와 방법 타당성 검증 파라미터에 따라 비교·확인하였다. 그리고 실제 시중 유통되는 대황 중 센노사이드 A와 라폰티신을 분석하여 대황의 품질관리에 적용하였다.
- 우리나라 시판되는 대황이 함량미달 제품 및 종대황이 혼재되어 판매되고 있는바 건전한 유통 관리를 위하여 많은 시료를 짧은 시간과 적은 비용으로 품질관리를 할 수 있도록 대황의 기원종간 특이 지표성분인 센노사이드 A와 라폰티신의 동시분석방법 하고자 하였다. 방법으로 대한약전의 센노사이드 A 정량법으로 적용하고자 방법 타당성 검증을 통해 신뢰성을 확보하였다. 결과 분석법의 타당성이 검증된 대한약전의 대황 중 센노사이드 A 정량방법으로 라폰티신의 존재 여부와 정량까지 동시에 가능함에 따라 대황의 품질관리의 효율성을 높여 일선 시장의 제품관리에 유용한 자료로 활용될 것이라 기대되었다.
- 오산화인이 들어있는 데시케이터에서 12시간 이상 건조한 표준시약 센노사이드 A와 라폰티신을 각각 약 10 mg을 정확하게 칭량한 후 탄산수소나트륨용액(1→1000)과 메탄올에 각각 녹여 표준원액을 만들었고 단계 희석하여 각각 약 5, 10, 20, 40, 80 mg/l 농도로 표준용액으로 정밀히 조제하였다.
- 장엽대황, 약용대황, 당고특대황(티벳), 당고특대황(청해산) 및 시중에 유통되는 대황 6건의 센노사이드 A와 라폰티신을 대한 약전의 센노사이드 A 정량법인 탄산수소나트륨 용액으로 전처리한 후 HPLC로 정량하였다.
- 정밀성는 여러 가지 요인 중 실험일을 변동요인으로 정하여 실험일 내 정밀성(Repeatability)은 검량선을 그린 5단계 농도의 표준용액을 각각 실험일 내 3회 반복 측정하여 각 농도별 상대 표준편차(Relative standard deviation, R.S.D.(%)=(S.D./mean×100)를 구하였고 실험일 간 정밀성(Intermediate precision)은 7일 후 다시 5단계 농도의 표준용액을 측정하여 일간 피크면적의 상대표준편차 값을 구하였다.
- 직선성은 각 표준용액의 5단계 농도로 검량선을 작성하여 검 량선의 r2으로 직선성을 평가하였는데 0.998 이상을 기준으로 적합한 분석가능범위를 결정하였다. 검출한계(Limit of detection) 및 정량한계(Limit of quantification)는 반응의 표준편차와 검량선 기울기에 근거하는 방법에 따라 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량 y를 작성하여 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 특이성은 HPLC 기기 chamstation에서 표준물질 중 센노사이드 A 및 라폰티신의 자외선-스펙트럼과 표준물질을 첨가한 대황 시험용액에서 각각의 스펙트럼을 비교하여 일치도와 순도로 검증하였으며, 정확성은 시험용액에 3단계 농도의 표준용액을 첨가하여 직선성 분석범위 내에서 3회 측정하였고 표준용액의 이론적인 농도와 실제 측정한 값과의 비교하여 회수율(Recovery, %)을 구하였다.
대상 데이터
- 분석에 사용된 고속액체크로마토그래피는 Agilent 1100 series(USA)로 가스제거기(degasser, G1379A, Japan), 자동주입기(autosampler, G1313Am ALC, Germany), 펌프(pump, G1312A, Germany), 컬럼 온도조절기 (column temperature controller, G1336A, Germany) 및 검출기 (detector, G1314B, Germany)였고 컬럼은 Agilent eclipse XDB-C18, 4.6 mm×150 mm, 5 µm(PN 993967902, USA)을 사용하였다.
- 2%의 Chromadex Inc(CA, USA)제품을 사용하였다. 시약은 HPLC grade로 아세토니트릴(Acetonitrile, Merck, Darmstadt, Germany)과 아세트산(Acetic acid, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Germany)을 사용하였고 표준품 건조시 데시케이터에 들어간 오산화인(Phosphorus pentoxide, Wako, Japan)과 표준품 제조 시 사용된 시약은 탄산수소나트륨(Sodium Hydrogen Carbonate, Kanto chemical, Kyoto, Japan)과 메탄올 (Methanol, Merck, Darmstadt, Germany)이었다.
- 실험재료인 대황은 전문 감별위원으로부터 확인한 장엽대황, 약용대황, 당고특대황(티벳), 당고특대황(청해산)과 시중에서 유통되는 대황 6건을 준비하였다. 분석에 사용된 고속액체크로마토그래피는 Agilent 1100 series(USA)로 가스제거기(degasser, G1379A, Japan), 자동주입기(autosampler, G1313Am ALC, Germany), 펌프(pump, G1312A, Germany), 컬럼 온도조절기 (column temperature controller, G1336A, Germany) 및 검출기 (detector, G1314B, Germany)였고 컬럼은 Agilent eclipse XDB-C18, 4.
- 8 ml/min였다. 자외부 흡광광도계(Diode-array detector) 측정파장은 340 nm였고 자외선 스펙트럼은 190~400 nm 범위로 정하였다.
- 6 mm×150 mm, 5 µm(PN 993967902, USA)을 사용하였다. 증류수는 초순수제조장치(Milipore, USA)를 이용하여 18 MΩ 이상인 것으로 사용하였고 추출시 사용된 진탕기는 strong shaker(SR-20W, Japan)였다. 표준품으로 센노사이드 A(Sennoside A)는 순도 99.
- 증류수는 초순수제조장치(Milipore, USA)를 이용하여 18 MΩ 이상인 것으로 사용하였고 추출시 사용된 진탕기는 strong shaker(SR-20W, Japan)였다. 표준품으로 센노사이드 A(Sennoside A)는 순도 99.8%의 Wako제품(Japan)이었고 라폰티신(Rhaponticin) 은 순도 99.2%의 Chromadex Inc(CA, USA)제품을 사용하였다. 시약은 HPLC grade로 아세토니트릴(Acetonitrile, Merck, Darmstadt, Germany)과 아세트산(Acetic acid, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Germany)을 사용하였고 표준품 건조시 데시케이터에 들어간 오산화인(Phosphorus pentoxide, Wako, Japan)과 표준품 제조 시 사용된 시약은 탄산수소나트륨(Sodium Hydrogen Carbonate, Kanto chemical, Kyoto, Japan)과 메탄올 (Methanol, Merck, Darmstadt, Germany)이었다.
이론/모형
- 동시 기기분석 조건은 대한약전 방법20)에 따라 센노사이드 A가 약 15분에 나오도록 하기 위한 액체크로마토그래피 이동상용매조성을 희석시킨 아세트산(1→80)과 아세토니트릴을 84:16비율로 분석하였으며, 컬럼온도는 40℃, 유량은 0.8 ml/min였다.
- 분석법의 타당성은 의약품 등 분석법 밸리데이션에 대한 지침 및 ICH(International Communitee of Harmonization)의 가이드라인에 따라 각 성분의 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정밀성, 특이성, 정확성을 검증하였다.
성능/효과
- p>대황은 마디풀과(Polygonaceae)에 속하였으며 약리학적으로 크게 금문계(Palmatum) 대황과 토대황계(Rhaponticum) 대황으로, 금문계 대황에는 장엽대황(Rheum palmatum), 당고특대황 (Rheum tanguticum), 약용대황(Rheum officinale), 장군풀 (Rheum corearum) 등이 포함되었고 토대황계 대황에는 종대황 (Rheum undulatum), 인도대황(Rheum emodi), 파엽대황(Rheum franzebachii) 등이 있다.1) 대한약전에 수재된 세 가지 식물인 금 문계 대황의 장엽대황, 당고특대황, 약용대황은 중국의 사천성, 청해성, 감숙성의 해발 2000~3000 m 고지에서 자생하였으며 뿌리의 횡단면에 금문이 있는 것이 특징이었고,2,3) 효능은 사하활성으로4) 한방에서 소염, 해열, 진정, 발열성 감염질환, 상반신의 혈열, 구내염, 화농성질환, 변비 등의 치료에 사용되었다.5) 종대 황은 우리나라 충청, 강원, 경북 등의 저지대에서 재배되었고,2)구어혈작용으로 혈소판응집을 강력히 억제하였으며,2,6) 항알러지 작용7)을 나타내는 등 기원종에 따라 재배지나 약리학적으로 인체에 대한 작용 및 활성이 달라 생약으로 사용될 때 반드시 구분되어 사용되어야 한다.
- 10) 최근 연구에서는 액체크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 종류별로 대황의 주요 성분의 함량을 비교하였고,16,19) 한국, 중국, 일본 등 각 나라별로 다르게 설정되어 있는 법적 규제 성분들인 센노사이드 A, 센노사이드 B, 알로에-이모딘, 레인, 이모딘, 크리소파놀에 대한 분석 연구8) 등을 토대로 기원별로 대황을 분류할 수 있는 성분들을 선별하고자 하는 노력이 계속되었다.10) 결과 금문 대황류와 종대황을 구별할 수 있는 성분은 센노사이드 A와 라폰티신으로, 금문대황류에 속한 대황들은 센노사이드 A가 함량의 차이를 보이기는하였으나 모두 검출되었고, 종대황에서는 검출되지 않았다.11,12) 또한 라폰티신은 금문대황에서는 검출되지 않았으나 종대황에서는 다량 함유되어 두 물질의 존재여부에 따라 종간의 구분이 가능 하였다고 보고되었다.
- 27) 대황 시험용액 중 센노사이드 A와 라폰티신 각 피크의 순도는 역치 이상이었으며 각 표준물질의 190~400 nm 스펙트럼과 비교하여 99% 이상의 일치도를 보여 원료 생약 대황의 다른 성분들 사이에서 두 성분이 분리되었음이 검증되었다. 탄산수소나트륨용액으로 녹인 센노사이드 A와 라폰티신의 스펙트럼, 같은 용액으로 추출한 약용대황 시험용액 중 두 물질의 스펙트럼은 Fig.
- 1) 대한약전에 수재된 세 가지 식물인 금 문계 대황의 장엽대황, 당고특대황, 약용대황은 중국의 사천성, 청해성, 감숙성의 해발 2000~3000 m 고지에서 자생하였으며 뿌리의 횡단면에 금문이 있는 것이 특징이었고,2,3) 효능은 사하활성으로4) 한방에서 소염, 해열, 진정, 발열성 감염질환, 상반신의 혈열, 구내염, 화농성질환, 변비 등의 치료에 사용되었다.5) 종대 황은 우리나라 충청, 강원, 경북 등의 저지대에서 재배되었고,2)구어혈작용으로 혈소판응집을 강력히 억제하였으며,2,6) 항알러지 작용7)을 나타내는 등 기원종에 따라 재배지나 약리학적으로 인체에 대한 작용 및 활성이 달라 생약으로 사용될 때 반드시 구분되어 사용되어야 한다.
- 그러나 정확성 검증 결과가 모두 일반적 방법 타당성 검증의 정확성 기준인 실측값의 ±15% 이내라는 기준에는 적합하였으므로31) 탄산나트륨용액을 추출용매로 사용하여도 무방한 것으로 생각되었다.
- 대황의 센노사이드 A와 라폰티신을 동시에 분석하기 위해 탄산수소나트륨용액과 메탄올로 용매를 달리해 분석법 타당성 검증으로 비교해 본 결과 모두 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성, 특이성, 정확성 파라미터에서 적합하였으나, 메탄올에 녹인 센노사이드 A의 직선성 범위가 탄산수소나트륨 용액의 경우보다 좁았고 정확성면에서는 라폰티신에서 메탄올로 추출하는 것이 회수율이 조금더 좋았다. 그러므로 본 연구의 목적인 센노사이드 A에 대해, 대한약전의 벨리데이션이 이미 검증된 정량법으로 라폰티신을 동시에 검사하기에 적합함을 실험법 벨리데이션으로 검증하였고, 라폰티신을 메탄올로 추출했을 때와 비교해 큰 차이가 없음을 입증하였다.
- 대황의 센노사이드 A와 라폰티신을 동시에 분석하기 위해 탄산수소나트륨용액과 메탄올로 용매를 달리해 분석법 타당성 검증으로 비교해 본 결과 모두 직선성, 검출한계, 정량한계, 정밀성, 특이성, 정확성 파라미터에서 적합하였으나, 메탄올에 녹인 센노사이드 A의 직선성 범위가 탄산수소나트륨 용액의 경우보다 좁았고 정확성면에서는 라폰티신에서 메탄올로 추출하는 것이 회수율이 조금더 좋았다. 그러므로 본 연구의 목적인 센노사이드 A에 대해, 대한약전의 벨리데이션이 이미 검증된 정량법으로 라폰티신을 동시에 검사하기에 적합함을 실험법 벨리데이션으로 검증하였고, 라폰티신을 메탄올로 추출했을 때와 비교해 큰 차이가 없음을 입증하였다.
- 시중에 유통되는 대황 6건을 분석해 본 결과 4건이 센노사이드 A 함량이 대한약전 기준에 미달되었고 그 중 2건은 라폰티신이 검출되어 총 4건이 부적합하였다. 본 연구의 경북 의성군 한국산 대황(8)은 라폰티신이 1.183%, 센노사이드 A는 검출되지 않아 토대황계열임을 알 수 있었고, 중국산 대황(7)은 라폰티신함량이 1.168%였고 센노사이드 A가 0.068%로 미량 검출되었다. 종대황의 라폰티신 함량은 한국산이 22.
- 시중에 유통되는 대황 6건을 분석해 본 결과 4건이 센노사이드 A 함량이 대한약전 기준에 미달되었고 그 중 2건은 라폰티신이 검출되어 총 4건이 부적합하였다. 본 연구의 경북 의성군 한국산 대황(8)은 라폰티신이 1.
- 정확성을 검증하기 위해 대황 시료를 탄산수소나트륨 용액으로 추출한 시험용액에 탄산수소나트륨 용액으로 녹인 센노사이드 A를 5.19, 10.72, 20.75 mg/l 3단계 농도로 최종 첨가하여 회수율을 검정한 결과는 Table III와 같이 99.42~100.22%(상대표준편차 0.39~0.78%)의 회수율을 보였고 메탄올로 추출한 시험 용액의 경우에도 탄산수소나트륨 용액과 차이가 없는 101.28~104.07%(상대표준편차 0.16~0.67%)의 회수율을 보였다. 그러나 라폰티신의 경우 탄산수소나트륨 용액으로 추출한 시험용액에 5.
후속연구
- 방법으로 대한약전의 센노사이드 A 정량법으로 적용하고자 방법 타당성 검증을 통해 신뢰성을 확보하였다. 결과 분석법의 타당성이 검증된 대한약전의 대황 중 센노사이드 A 정량방법으로 라폰티신의 존재 여부와 정량까지 동시에 가능함에 따라 대황의 품질관리의 효율성을 높여 일선 시장의 제품관리에 유용한 자료로 활용될 것이라 기대되었다. 실제 대황의 센노사이드 A와 라폰티신 함량을 분석한 결과 대황의 기원에 따라 센노사이드 A의 함량이 달랐으며 시중 유통되는 대황 6건 중 4건이 대한약전 기준에 부적합하였는데 2건은 센노사이드 A 함량 미달, 2건은 라폰티신 검출 및 센노사이드 A 함량이 미달했고, 2건만이 적합하여 지속적인 대황 품질 모니터링이 필요하였다.
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