RBL-2H3 세포에서 차조기씨 물 추출물의 항산화성 및 항염증 효과를 알아보기 위하여 DNP-IgE와 HSA로 세포를 활성화시켰다. 활성화된 비만 세포에서 분비되어 나오는 히스타민을 효소적 방법으로 측정하였으며, 염증성 사이토카인 IL-4과 TNF-$\alpha$의 생성량은 ELISA 방법으로 측정하였다. 차조기씨 물 추출물은 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가되었으며, $1,000\;{\mu}g$/mL농도에서 DPPH와 hydroxyl radical 소거능이 각각 38.9, 93.1%로 가장 높게 나타났다. 이는 차조기씨에 함유된 130.7 mg/g의 높은 페놀 함량에 기인하여 항산화 효과를 나타내었다. 한편 차조기씨 물 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 현저히 높은 양의 히스타민을 분비하였지만, 각 추출물의 농도로 처리시킨 세포에서의 분비량은 유의적으로 감소되었고, IL-4와 TNF-$\alpha$의 분비량 모두 차조기씨 물 추출물을 처리군은 대조군에 비해서 유의적으로 낮은 생성량을 보여주었다. 결과적으로 차조기씨 물추출물은 비만세포에 항원-항체 반응으로 인해 발병되는 제1형 알레르기 반응의 약학적 효능을 가진 것으로 나타나 임상적으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사용되며, 향후 이에 대한 심층적이고 체계적인 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
RBL-2H3 세포에서 차조기씨 물 추출물의 항산화성 및 항염증 효과를 알아보기 위하여 DNP-IgE와 HSA로 세포를 활성화시켰다. 활성화된 비만 세포에서 분비되어 나오는 히스타민을 효소적 방법으로 측정하였으며, 염증성 사이토카인 IL-4과 TNF-$\alpha$의 생성량은 ELISA 방법으로 측정하였다. 차조기씨 물 추출물은 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가되었으며, $1,000\;{\mu}g$/mL농도에서 DPPH와 hydroxyl radical 소거능이 각각 38.9, 93.1%로 가장 높게 나타났다. 이는 차조기씨에 함유된 130.7 mg/g의 높은 페놀 함량에 기인하여 항산화 효과를 나타내었다. 한편 차조기씨 물 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 현저히 높은 양의 히스타민을 분비하였지만, 각 추출물의 농도로 처리시킨 세포에서의 분비량은 유의적으로 감소되었고, IL-4와 TNF-$\alpha$의 분비량 모두 차조기씨 물 추출물을 처리군은 대조군에 비해서 유의적으로 낮은 생성량을 보여주었다. 결과적으로 차조기씨 물추출물은 비만세포에 항원-항체 반응으로 인해 발병되는 제1형 알레르기 반응의 약학적 효능을 가진 것으로 나타나 임상적으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사용되며, 향후 이에 대한 심층적이고 체계적인 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
The present study was to investigate anti-oxidative and anti-inflammatory activity of Perillae semen in RBL-2H3 basophilic leukemia cells. Inhibitory effect of Perillae semen onto free radical generation was determined by measuring DPPH and hydroxyl radical scavenging activities in vitro. Anti-infla...
The present study was to investigate anti-oxidative and anti-inflammatory activity of Perillae semen in RBL-2H3 basophilic leukemia cells. Inhibitory effect of Perillae semen onto free radical generation was determined by measuring DPPH and hydroxyl radical scavenging activities in vitro. Anti-inflammatory actions of Perillae semen extracts (100, 250, $500\;{\mu}g/mL$) were assessed by testing their effects on the degranulation of mast cells. For this, $\beta$-hexosaminidase released from RBL-2H3 cells was used and proinflammatory cytokines were measured by an ELISA kit. Our results indicated that Perillae semen water extracts effectively inhibited free radical generation. At the concentration of $500\;{\mu}g/mL$ of water extract, the degranulation of RBL-2H3 cells were inhibited by 42.1%. The IgE-antigen complex increased the accumulation of IL-4 and TNF-$\alpha$ secretion in RBL-2H3 cells and treatments with 250 and $500\;{\mu}g/mL$ of Perillae semen extracts suppressed the IgE induced secretion of IL-4 and TNF-$\alpha$ protein by 20.5, 26.9% and 14.5, 16.5% respectively. We observed that Perillae semen water extract reduced $\beta$-hexosaminidase, IL-4, and TNF-$\alpha$ secretion in RBL-2H3 cells. These results provide that Perillae semen may be beneficial in the treatment of allergic inflammatory disease.
The present study was to investigate anti-oxidative and anti-inflammatory activity of Perillae semen in RBL-2H3 basophilic leukemia cells. Inhibitory effect of Perillae semen onto free radical generation was determined by measuring DPPH and hydroxyl radical scavenging activities in vitro. Anti-inflammatory actions of Perillae semen extracts (100, 250, $500\;{\mu}g/mL$) were assessed by testing their effects on the degranulation of mast cells. For this, $\beta$-hexosaminidase released from RBL-2H3 cells was used and proinflammatory cytokines were measured by an ELISA kit. Our results indicated that Perillae semen water extracts effectively inhibited free radical generation. At the concentration of $500\;{\mu}g/mL$ of water extract, the degranulation of RBL-2H3 cells were inhibited by 42.1%. The IgE-antigen complex increased the accumulation of IL-4 and TNF-$\alpha$ secretion in RBL-2H3 cells and treatments with 250 and $500\;{\mu}g/mL$ of Perillae semen extracts suppressed the IgE induced secretion of IL-4 and TNF-$\alpha$ protein by 20.5, 26.9% and 14.5, 16.5% respectively. We observed that Perillae semen water extract reduced $\beta$-hexosaminidase, IL-4, and TNF-$\alpha$ secretion in RBL-2H3 cells. These results provide that Perillae semen may be beneficial in the treatment of allergic inflammatory disease.
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문제 정의
본 연구는 RBL-2H3 세포에서 차조기씨 물 추출물의 항산 화성 및 항염증 효과를 알아보기 위하여 DNP-IgE와 HSA 로 세포를 활성화시켰다. 활성화된 비만 세포에서 분비되어 나오는 히스타민을 효소적 방법으로 측정하였으며, 염증성 사이토카인 IL-4과 TNF-α의 생성량은 ELISA 방법으로 측정하였다.
본 연구에서는 식용과 약용으로 많이 사용되지만 그 효능에 대한 연구가 많이 진행되지 않은 차조기씨의 항산화성 및항염증 효능을 규명하기 위하여 총 페놀함량, 전자공여능, OH-소거능을 측정하였으며, mast cell line인 RBL-2H3 세포를 이용하여 점액 분비를 일으키는 β-hexosaminidase 와 IL-4, TNF-α의 분비에 차조기씨 물 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.
제안 방법
19) 에탄올에 농도별로 희석시킨 추출물 (100, 250, 500, 1000 μg/mL) 600 μL 에 DPPH (1.5 × 10 -4 M) 200 μL를 첨가하여 암조건에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
20) 농도별로 희석시킨 시료 (100, 250, 500, 1,000 μg/mL) 100 μL, 100 mM sodium phosphate (pH 7.4) 250 μL, 1 mM EDTA 100 μL, 36 mM deo-xyribose 100 μL, 1 mM FeCl3·6H2O 100 μL, 1 mM L-ascorbic acid 100 μL, 10 mM H2O2 100 μL, 증류수 150 μL를 첨가하여 38℃ acid 1 mL, 10% trichloroac-tic acid 1 mL 를 첨하가여 100℃에서 10분간 boiling 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식에 의거하여 hy-droxyl radical 소거 활성을 구하였다.
21) Rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3) 세포를 96-well plates에 1 × 10 6 cells/ mL 농도로 100 μL 씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가되지 않은 배지에 시료를 농도별 (0, 100, 250, 500, 1,000, 2,000 mg/L) 로 제조한 후 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
24-well plate에 2 × 105 cells/mL의 세포와 DNP-IgE (0.5 μg/mL)를 분주한 뒤 37℃, 5% CO2배양기에서 12시간 배양한 다음 새로운 DMEM 배지에 시료를 농도별 (0, 100, 250 μg/mL)로 희석시켜 세포에 처리하였다.
30분 동안 배양한 후 DNP-HAS (10 μg/mL)를 가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 2시간 반응시키고 ice bath에서 10분간 incubation 하여 반응을 종결시켰다.
Hydrocyl radical 소거 활성은 Chung 등의 방법을 응용 하여 측정하였다.20) 농도별로 희석시킨 시료 (100, 250, 500, 1,000 μg/mL) 100 μL, 100 mM sodium phosphate (pH 7.
본 연구는 RBL-2H3 세포에서 차조기씨 물 추출물의 항산 화성 및 항염증 효과를 알아보기 위하여 DNP-IgE와 HSA 로 세포를 활성화시켰다. 활성화된 비만 세포에서 분비되어 나오는 히스타민을 효소적 방법으로 측정하였으며, 염증성 사이토카인 IL-4과 TNF-α의 생성량은 ELISA 방법으로 측정하였다.
각 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl2 , 25 mM PIPES, 1 mM CaCl2 , 0.1% BSA, pH 7.2)로 2회 세척한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 10분간 반응시킨 후 FBS와 1% penicillin-streptomycin가 첨가되지 않은 배지에 시료를 농도별 (0, 100, 250 μg/mL)로 희석시켜 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 30분 동안 반응시켰다.
따라서 차조기씨 물 추출물을 이용한 항히스타민과 cytokine 활성 측성 시 세포 생존율에 영향을 주지 않는 500 μg/mL농도 범위에서 진행하였다.
이후 dinitropheny-human serum albumin (DNP-HSA, 10 μg/mL)을 가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 2시간 반응시키고 ice bath에서 10분간 incubation시켜 반응을 종결시켰다.
차조기씨 물 추출물의 전자공여능을 측정하기 위하여 DP-PH radical에 대한 소거활성을 측정하였다. Fig.
차조기씨 물 추출물이 DNP-IgE와 HSA로 염증을 유도 시킨 RBL-2H3 세포에서 cytokine IL-4와 TNF-α 생성량에 미치는 영향을 알아보기 위해 시료를 100, 250, 500 μg/mL농도로 전처리하여 cytokine의 분비량을 측정한 결과는 Fig. 5와 Fig. 6에 나타내었다.
차조기씨 물 추출물이 항원-항체 복합 반응에 의해 유발되는 제1형 알레르기 반응에서의 항알레르기 염증 효과를 알아 보기 위하여 알레르기 반응으로 인해 생성되는 히스타민과 사이토카인의 분비를 측정하였다. 차조기씨 물 추출물을 염증 유발시킨 비만세포주인 RBL-2H3 세포에 처리하여 탈과립에 미치는 영향을 측정한 결과, DNP-IgE와 HSA를 처리하지 않은 안정상태의 RBL-2H3 세포에서 분비된 탈과립은 36.
Na2CO3 포화용액 1 mL 을넣은 후 1시간 동안 방치 후 700 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 표준물질은 tannic acid (Sigma Co., USA)를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 총 페놀 함량을 측정하였다.
대상 데이터
Rat basophilic leukemia cell인 RBL-2H3세포는 한국 세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양 받은 뒤 10% heat-inactivated FBS와 1% penicillin-strep-tomycin이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle Medium) 배지에서 37℃, 5 % CO2 조건하에 배양하였다.
차조기씨는 춘천시 소재 건재상에서 구입하였으며, 수세한 후 10.7배 증류수를 가하여 60℃에서 24시간 교반하면서 유효성분을 추출하였다. 이를 실온에서 방냉하고 여과한 다음 감압농축기 (Eyela, Japan)로 농축하였고, 동결 건조기 (Ilshin FD 8508, Korea)을 이용하여 -70℃에서 건조한 시료를 냉동보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하 였다.
데이터처리
실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 GraphPad In-Stat (GraphPad InStat Version 3.00, 2003) 프로그램을 이용하여 실험군당 평균 ± 표준오차로 표시하였고, 각 농도 평균차의 통계적 유의성을 p < 0.05 수준에서 Tukey-Kra-mer multiple comparisons test에 의해 검정하였다.
이론/모형
배양이 끝난 세포의 생존률은 MTT [3-(4,5-dimethylthi-azole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] 환원 방법을 이용하여 측정하였다.21) Rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3) 세포를 96-well plates에 1 × 10 6 cells/ mL 농도로 100 μL 씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가되지 않은 배지에 시료를 농도별 (0, 100, 250, 500, 1,000, 2,000 mg/L) 로 제조한 후 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
시료의 전자공여능은 2.2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (D-PPH)을 사용한 방법으로 측정하였다.19) 에탄올에 농도별로 희석시킨 추출물 (100, 250, 500, 1000 μg/mL) 600 μL 에 DPPH (1.
총페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’ s phenol 시약을 이용한 비색법을 이용하였다.
활성화된 비만 세포에서 분비되어 나오는 히스타민을 효소적 방법으로 측정하였으며, 염증성 사이토카인 IL-4과 TNF-α의 생성량은 ELISA 방법으로 측정하였 다.
활성화된 비만 세포에서 분비되어 나오는 히스타민을 효소적 방법으로 측정하였으며, 염증성 사이토카인 IL-4과 TNF-α의 생성량은 ELISA 방법으로 측정하였다.
성능/효과
250, 500, 1,000 μg/mL의 범위에서 농도 의존적으로 증가되었 으며, 1,000 μg/mL농도에서 각각 38.9, 93.1%로 가장 높았다.
31) RBL-2H3 세포로부터의 TNF-α의 분비량은 아무런 처리를 하지 않은 군에서는 26.2 ± 2.6 pg/mL로 DNP-IgE와 HSA로 세포를 자극시킨 군 37.8 ± 1.0 pg/ mL에 비하여 현저히 낮았다.
6) 또한 차조기의 면역 기능과 관련된 연구로는 소엽즙이 염증 부위의 호중성 백혈구 및 대식세포의 수와 질에 절대적으로 영향을 미쳐 탐식능을 증대시키고, 혈관내피세포의 부착능, 활성산소와 산생능 등을 활성화시켜 염증성 피부질환의 치료에 유용하다고 보고하였다.7) 가미 소자강기탕은 알레르기 천식에 있어서 호흡 양상을 개선시 키고, 기관조직 내의 부종, 호산구 침윤을 감소시키며,8) 차조 기씨유가 알러지 반응 및 노화 등에 유의적인 효과를 기대할수 있다고 하였다.9) Yang 등10) 은 소엽 추출물이 허혈성 뇌질 환에 사용되어 뇌손상을 억제할 가능성이 높으며 이와 관련된 기전은 IL-10의 생성량 증가를 통한 IL-1β와 TNF-α 의 생성 억제와 관련이 깊다는 것을 천명하였다.
IL-4의 분비량은 항원-항체로 염증을 유도시키지 않은 안정 세포 (without IgE-HSA)에 비해 염증을 유도시킨 대조 군 세포에서 IL-4의 분비량은 2.68 ± 0.1 pg/mL로 현저히 증가되었다.
따라서 차조기씨 물 추출물은 IL-4와 TNF-α 생성량을 감소시킴으로서 항염증에 대한 작용을 나타낼 수 있음을 보여주는 결과라 하겠다.
시료의 100, 250, 500 μg/mL의 농도 범위에서 각각 98.2 ± 2.7, 98.1 ± 2.7, 96.5 ± 1.5% 세포 생존율을 나타내었고 대조 군과 비교했을 때 유의적인 차이가 없었지만, 1,000 및 2,000 μg/mL농도에서는 약 10%의 세포독성을 나타내었다.
이러한 결과는 차조기씨 추출물이 DNP-IgE와 HSA로 자극한 RBL-2H3 세포에서 IL-4와 TNF-α의 발현을 억제하여 염증을 억제하는 기전을 가지고 있음을 보여준다.
차조기씨 물 추출물 100, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도 에서 hydroxyl 라디칼 소거능을 측정한 결과, Fig. 2와 같이 각각 81.2 ± 2.7, 81.6 ± 4.2, 87.6 ± 4.3, 93.1 ± 1.3%로 차조기씨 물 추출물의 농도가 증가할수록 hydrox-yl radical 소거활성이 증가되었으며, 고농도인 1,000 μg/ mL에서 93.1%로 가장 높았다.
차조기씨 물 추출물은 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가되었으며, 1,000 μg/mL농도에서 DPPH와 hydroxyl radical 소거능이 각각 38.9, 93.1%로 가장 높게 나타났다.
차조기씨 물 추출물을 염증 유발시킨 비만세포주인 RBL-2H3 세포에 처리하여 탈과립에 미치는 영향을 측정한 결과, DNP-IgE와 HSA를 처리하지 않은 안정상태의 RBL-2H3 세포에서 분비된 탈과립은 36.0± 1.3%로 나타났고, 대조군에서는 현저한 증가를 나타내었 으며, 각 추출물 처리군은 100, 250, 500 μg/mL의 농도에서 각각 68.8 ± 11.9, 64.9 ± 1.3, 57.8 ± 3.2%의 분비로 농도가 증가할수록 유의적인 감소를 나타내었다.
차조기씨 물 추출물의 수율은 건시료 30 g을 추출한 후감압 농축하여 동결 건조된 무게를 측정한 결과, 차조기씨물 추출물 1.6 g을 얻어 수율 5.6%의 효율을 보였다. 총 페놀 함량은 130.
차조기씨물 추출물의 항히스타민 효과는 동일한 농도 (100 μg/mL) 의 비파엽 열수추출물과 비교 시 약 2배 정도 높았다.
총 페놀 함량은 130.7 ± 5.8 mg/g을 함유하는 것으로 나타났다 (Table 1).
한편 차조기씨 물 추출 물을 처리하지 않은 세포에서는 현저히 높은 양의 히스타민을 분비하였지만, 각 추출물의 농도로 처리시킨 세포에서의 분비량은 유의적으로 감소되었고, IL-4와 TNF-α의 분비량 모두 차조기씨 물 추출물을 처리군은 대조군에 비해서 유의 적으로 낮은 생성량을 보여주었다.
후속연구
27) 그러나 환경오염과 식생활의 변화로 인하여 아토피, 천식, 비염과 같은 알레르기 질환은 가속화 될 것으로 예상되며, 이러한 알레르기 치료에 있어서 점액 분비, 가려움 및 통증 억제를 위해 항히스타민 약제의 사용은 부작용에도 불구하고 계속적 으로 증가될 것이다. 따라서 차조기씨 물 추출물의 항히스타민 효과는 추가적인 연구를 통해 천연 히스타민 저해제로의 개발이 가능성을 제시해준다.
한편 차조기씨 물 추출 물을 처리하지 않은 세포에서는 현저히 높은 양의 히스타민을 분비하였지만, 각 추출물의 농도로 처리시킨 세포에서의 분비량은 유의적으로 감소되었고, IL-4와 TNF-α의 분비량 모두 차조기씨 물 추출물을 처리군은 대조군에 비해서 유의 적으로 낮은 생성량을 보여주었다. 결과적으로 차조기씨 물 추출물은 비만세포에 항원-항체 반응으로 인해 발병되는 제 1형 알레르기 반응의 약학적 효능을 가진 것으로 나타나 임상적으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사용되며, 향후 이에 대한 심층적이고 체계적인 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
결론적으로 차조기씨 물 추출물은 활성화된 비만세포에서의 탈과립을 억제하며, 염증성 사이토카인인 IL-4와 TNF-α 분비량을 억제함으로써 항원-항체 반응으로 발병되는 알레 르기 질환의 예방 및 개선에 유용할 것이라 생각된다.
27) 그러나 환경오염과 식생활의 변화로 인하여 아토피, 천식, 비염과 같은 알레르기 질환은 가속화 될 것으로 예상되며, 이러한 알레르기 치료에 있어서 점액 분비, 가려움 및 통증 억제를 위해 항히스타민 약제의 사용은 부작용에도 불구하고 계속적 으로 증가될 것이다. 따라서 차조기씨 물 추출물의 항히스타민 효과는 추가적인 연구를 통해 천연 히스타민 저해제로의 개발이 가능성을 제시해준다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
차조기의 원산지는 어디인가?
crispa Decne)라고도 불리며 꿀풀과에 속하는 한해살이 초본식물로 그 잎을 자소엽이라 하고 여문 씨를 말린 것을 자소자(Perilla frutescens)라고 한다. 중국이 원산지로 우리나라 각지에서 재배되며 한방에서 차조기는 맛이 맵고, 성질이 따뜻하며 천식, 기침, 가래, 인후염, 소화불량, 요통, 불면증, 아토피 등의 처방에 이용된다. 차조기는 정유를 함유하며 주성분은 perillaldehyde 약 55%, α-limonene, α-prinene 등이며, 잎에는 cyamin, sterin, linolic, stearic, palmitic acid 등이 함유되어 있다.
자소는 한방에서 어떠한 처방에 이용되는가?
crispa Decne)라고도 불리며 꿀풀과에 속하는 한해살이 초본식물로 그 잎을 자소엽이라 하고 여문 씨를 말린 것을 자소자(Perilla frutescens)라고 한다. 중국이 원산지로 우리나라 각지에서 재배되며 한방에서 차조기는 맛이 맵고, 성질이 따뜻하며 천식, 기침, 가래, 인후염, 소화불량, 요통, 불면증, 아토피 등의 처방에 이용된다. 차조기는 정유를 함유하며 주성분은 perillaldehyde 약 55%, α-limonene, α-prinene 등이며, 잎에는 cyamin, sterin, linolic, stearic, palmitic acid 등이 함유되어 있다.
차조기란 무엇인가?
차조기는 자소 (Perilla frutescens Britton var. crispa Decne)라고도 불리며 꿀풀과에 속하는 한해살이 초본식물로 그 잎을 자소엽이라 하고 여문 씨를 말린 것을 자소자(Perilla frutescens)라고 한다. 중국이 원산지로 우리나라 각지에서 재배되며 한방에서 차조기는 맛이 맵고, 성질이 따뜻하며 천식, 기침, 가래, 인후염, 소화불량, 요통, 불면증, 아토피 등의 처방에 이용된다.
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