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문제 정의
- 현재까지의 山靑木에 대한 연구들은 유효 성분 동정 및 생리 활성에 대한 연구, 급성 간손상 유발 실험 동물 모델에서 transaminase, LDH 등 효소와 간조직 검사를 통한 간보호 효과를 확인하는 등에 초점이 맞춰져 있었다. 간경변증의 주요 기전이라고 할 수 있는 간성상세포 활성화에 대하여 연구된 결과는 드문 것으로 보이며 이에 본 연구에서는 山靑木 추출물을 rat의 간성상세포에 직접 투여하여 효과를 검증하였다.
- 이에 저자는 山靑木이 간성상세포의 섬유화 억제에 미치는 영향을 관찰하고자, 간성상세포의 활성도와 증식을 관찰하기 위해 MTT Assay와 BrdU Assay를 시행하였고, collagen의 합성량 및 단백합성에 직접 관련이 있는 mRNA의 발현량을 관찰했으며, IL-6의 분비량을 정량하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 10 ㎕의 PCR 생성물에 2㎕의 6× gel loading buffer(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% sucrose)를 혼합하여 0.5 μg/ml의 ethidium bromide가 첨가된 2% 한천 gel에 0.5× TBE(45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA)를 이용하여 90V로 1시간 동안 전기영동을 하였으며 Gel Doc 1000 gel documentation system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 band를 확인하였다.
- 2 ㎕의 10× reaction buffer(100 mM Tris-HCl, pH9.0 500 mM KCl, 1% Trition X-100), 4 ㎕의 25 mM MgCl2, 2 ㎕의 10 mM deoxynucleoside triphosphate (dNTP), 0.5 ㎕(40 unit/㎕)의 ribonuclease(RNase) inhibitor, 15 unit의 AMV reverse transcriptase(Promega, Medison, WI, USA)를 가하여 최종량을 20 ㎕로 하였다.
- 2% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamine이 포함된 배지에 약재를 필요한 농도로 희석하여 처리하였다.
- 24-well plate에 T6 cell을 분주하고 24시간동안 배양한 후 농도별로 약재를 처리하고 24시간, 48시간, 72시간별로 MTT Assay를 시행하였다.
- 6-well plate에 HSC-T6 cell을 분주하고 다음날 한 장의 plate에서 3개 well씩 같은 농도로 0μg/ml, 31.25μg/ml, 62.5μg/ml, 125μg/ml, 250μg/ml, 500μg/ml의 농도별로 약재를 처리한 후 24시간, 48시간별로 Qiagen사의 RNeasy Mini Plus Kit를 이용하여 RNA를 분리 하였다.
- 96-well plate에 세포를 분주하고 24시간 후 0μg/ml, 31.25μg/ml, 62.5μg/ml, 125μg/ml, 250μg/ml, 500μg/ml의 농도로 24시간, 48시간 약제처리를 한 후 BrdU Assay를 시행하였다.
- 96-well plate에 세포를 분주하고 24시간 후 0μg/ml, 31.25μg/ml, 62.5μg/ml, 125μg/ml, 250μg/ml, 500μg/ml의 농도로 24시간, 48시간 약제처리를 한 후 측정 하였다.
- GAPDH를 house keeping gene으로 하고, 간성상세포에서 합성하는 collagen 중의 하나인 collagen type 1a2, 성상세포가 활성화되면 증가하는 것으로 알려진 alpha-Smooth Muscle Actin(ASMA), 기존의 collagen 골격을 이루고 있는 Collagen type Ⅳ를 분해하는 물질 중 하나인 Matrix metalloprotease-2(MMP-2)를 측정하였고, 촬영된 이미지를 바탕으로 0μg/ml과 GAPDH를 기준으로 비율을 구하여 수치로 나타내었다(Fig. 3-a, Fig. 3-b, Fig. 3-c).
- PCR의 방법은 2㎕의 cDNA에 5㎕의 10× PCR buffer(100 mM Tris-HCl, pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2), 4㎕의 dNTP, 20p㏖의 sense와 antisense primer, 2 unit의 Taq DNA polymerase를 넣고 멸균된 증류수로 총 volume이 50㎕가 되도록 조정하였다.
- Peprotech의 Murine IL-6 ELISA Development Kit을 사용하였으며 제작사의 매뉴얼에 따라서 측정하였다.
- Promega사의 Reverse Transcription System을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 山靑木 100g을 환류추출기에 넣고 1000cc의 증류수를 더하여 관류냉각장치를 부착한 상태로 2시간씩 전탕하였다. 이 전탕액을 Whattmann Paper로 filtering 한 후 rotary evaporator로 감압농축하고 동결 건조하여 40g(증류수 추출)의 건조추출물을 얻어 실험에 사용하였다.
- 山靑木이 IL-6의 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 IL-6 정량을 시행하였다. 실험 결과 24시간 및 48시간 처리군에서 농도의존적으로 IL-6의 분비량이 증가하는 경향을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 山靑木이 간성상세포의 collagen 합성에 미치는 영향을 유전자의 발현양상을 통해 관찰해 보기 위해 RT-PCR을 시행하였다. GAPDH를 house keeping gene으로 하고, 간성상세포에서 합성하는 collagen 중의 하나인 collagen type 1a2, 성상세포가 활성화되면 증가하는 것으로 알려진 alpha-Smooth Muscle Actin(ASMA), 기존의 collagen 골격을 이루고 있는 Collagen type Ⅳ를 분해하는 물질 중 하나인 Matrix metalloprotease-2(MMP-2)를 측정하였고, 촬영된 이미지를 바탕으로 0μg/ml과 GAPDH를 기준으로 비율을 구하여 수치로 나타내었다(Fig.
- 山靑木이 간성상세포의 간섬유화 억제에 미치는 영향을 관찰하고자 MTT assay, BrdU assay, RT-PCR 및 procollagen assay, IL-6 assay를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 山靑木이 간성상세포의 증식에 미치는 영향을 확인해보기 위해 각각 24시간과 48시간 동안 약제 처리를 한 후 BrdU assay를 시행하였다. 실험결과 모든 농도에서 유의성 있게 세포증식이 억제됨을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 반응 양성 샘플들이 초록색을 나타낼 때까지 실온에서 빛을 차단한 상태로 30분간 샘플들을 배양하였다. 마지막으로, 참조 파장으로 490nm를 선택하고 405nm의 파장에서microplate reader로 샘플들의 흡광도를 측정하였다.
- 배양이 끝나고 suction 후 4회 세척한 후 substrate solution을 100㎕씩 각 well에 분주하고 색이 발현될 때까지 실온에 배양한 뒤 발색 되는 것을 확인하고 650nm로 보정된 405nm 파장에서 ELISA plate reader로 측정하였다.
- 본 연구에서는 일반적인 한약재의 농도로 설정되어 500μg/ml를 최고 농도로 설정하였고 시간별로 약재를 투여하였다.
대상 데이터
- Fetal Bovine Serum(FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), Antibiotics 등은 Gibco사(CA, USA), n-propanol, thiazoly blue tetrazolium(MTT) 등은 Sigma사(MO, USA), 5-Bromo-2'-deoxy Uridine Labeling and Detection Kit(BrdU Kit)은 Roche사(Mannheim, Germany), Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit는 TaKaRa사(Shiga, Japan), RNeasy Mini Plus Kit는 Qiagen사(CA, USA), Taq DNA polymerase는 Bioneer사(Deajoen, Korea), Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) System은 Promega사(WI, USA) 등의 제품을 사용하였고, IL-6 정량에 사용된 Kit는 Peprotech사(New Jersey, USA)의 제품을 사용하였다.
- House keeping gene으로는 GAPDH를 사용하였고, target gene으로는 ASMA(Alpha-Smooth Muscle Actin), MMP-2, Collagen type 1a2를 사용하였으며 각 primer의 sequence는 다음과 같다(Table 1).
- Rat의 간성상세포주인 HSC-T6 cell line(kind gift of Dr. Scott L. Friedman)을 이용하였다. 세포는 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamine이 포함된 DMEM배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 의 incubator에서 배양하였다.
- Fetal Bovine Serum(FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), Antibiotics 등은 Gibco사(CA, USA), n-propanol, thiazoly blue tetrazolium(MTT) 등은 Sigma사(MO, USA), 5-Bromo-2'-deoxy Uridine Labeling and Detection Kit(BrdU Kit)은 Roche사(Mannheim, Germany), Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit는 TaKaRa사(Shiga, Japan), RNeasy Mini Plus Kit는 Qiagen사(CA, USA), Taq DNA polymerase는 Bioneer사(Deajoen, Korea), Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) System은 Promega사(WI, USA) 등의 제품을 사용하였고, IL-6 정량에 사용된 Kit는 Peprotech사(New Jersey, USA)의 제품을 사용하였다. 기타 plastic wares는 SPL사(Korea) 제품을 이용하였다.
- 본 실험에 사용한 약재는 강원도 정선군에서 채취한 것을 사용하였다.
- Friedman)을 이용하였다. 세포는 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamine이 포함된 DMEM배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 의 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- Microsoft사의 Excel program을 이용하여 T-test를 수행하였으며, p<0.05인 경우를 유의성이 있는 것으로 보았다.
이론/모형
- 山靑木이 간성상세포의 collagen 합성에 미치는 경향을 알아보기 위해 Procollagen assay를 시행하였다. 각각 24, 48시간 동안 약재를 처리한 후 실험한 결과, 24시간 처리군에서의 31.
- 山靑木이 간성상세포의 viability에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 각각 24시간, 48시간, 72시간 동안 약재를 처리한 후 나타난 결과를 통계 처리하였을 때 모든 시간 군에서 농도의존적으로 세포 활성도의 감소 경향이 나타났다.
성능/효과
- 1. 山靑木은 간성상세포의 활성도를 농도의존적으로 억제하는 경향이 있었다.
- 2. 山靑木은 간성상세포의 증식을 농도의존적으로 유의성 있게 억제하였다.
- 24, 48 시간 동안 약재를 처리한 후 나타난 결과, 24시간 처리군의 31.25μg/ml와 125μg/ml, 250μg/ml, 500μg/ml에서 농도의존적으로 유의성 있게 procollagen 합성량을 감소시켰으며, 48시간 처리군에서도 농도의존적으로 procollagen 합성량이 줄어드는 경향을 보였으나 유의성은 없었다(Fig. 4).
- 3. 山靑木은 24시간 처리군에서 ASMA, Collagen type 1a2 유전자의 발현을 감소시키는 경향을 보였으며 48시간 처리군에서 ASMA 유전자의 발현을 감소시켰다. MMP-2의 발현에는 별다른 변화를 나타내지 않았다.
- 4. 山靑木은 24시간 처리군에서는 procollagen의 합성을 농도의존적으로 유의하게 억제하였고, 48시간 처리군에서는 유의성은 나타나지 않았지만 농도의존적으로 억제하는 경향을 보였다.
- 5μg/ml와 500μg/ml 농도에서 가장 큰 감소폭을 보였다. 48시간 처리군에서는 ASMA만 대조군에 비해 합성이 감소하는 경향을 보였으며 Collagen type 1a2에서는 일정한 경향성을 찾을 수 없었다. MMP-2는 24시간과 48시간처리군에서 모두 일정한 경향성을 발견할 수 없었다.
- 5. 山靑木은 농도의존적으로 IL-6 분비를 증가시키는 경향이 있었다.
- 山靑木이 간섬유화 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과 24시간에서는 山靑木 투여에 의하여 ASMA, collagen type 1a2 에서 대조군에 비해 유전자의 발현이 감소됨이 관찰되었으며, 모두 다른 농도에서보다 62.5μg/ml와 500μg/ml에서 유전자 발현이 더 억제된 것을 관찰할 수 있었으나 MMP-2에서는 특별한 경향성을 발견할 수 없었다.
- 山靑木이 간성상세포의 증식에 미치는 영향을 확인해보기 위해, 山靑木을 증류수로 추출하여 24, 48시간 동안 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500μg/ml 농도로 처리한 결과 모든 농도 및 모든 시간에서 유의성 있는 억제 효과가 나타나 농도의존적으로 간성상세포의 증식을 억제함을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- 山靑木이 간성상세포의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 山靑木을 시간별 및 농도별로 처리한 결과 24시간에서는 250μg/ml부터 유의성이 인정되었고, 48시간에는 62.5μg/ml부터, 72시간에서는 31.25μg/ml부터 효과가 있는 것으로 나타나 농도의존적으로 세포 활성도를 감소시켰다(Fig. 1).
- 각각 24, 48시간 동안 약재를 처리한 후 실험한 결과, 24시간 처리군에서의 31.25μg/ml 농도에서 유의하게 procollagen 생성량이 감소함을 확인할 수 있었다.
- 山靑木이 간성상세포의 viability에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 각각 24시간, 48시간, 72시간 동안 약재를 처리한 후 나타난 결과를 통계 처리하였을 때 모든 시간 군에서 농도의존적으로 세포 활성도의 감소 경향이 나타났다. 24시간 군에서는 고농도인 250μg/ml와 500 μg/ml에서 유의성이 인정되었고 48시간 군에서는 저농도인 31.
- 간섬유화에 영향을 미치는 cytokine 중 하나인 IL-6 분비에 山靑木이 미치는 영향을 알아보기 위해 각각 24시간, 48시간 약재처리 후 IL-6를 정량한 결과 24시간 처리군과 48시간 처리군에서 모두 농도 의존적으로 IL-6 분비가 증가하는 경향이 있었다(Fig. 5).
- 山靑木이 IL-6의 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 IL-6 정량을 시행하였다. 실험 결과 24시간 및 48시간 처리군에서 농도의존적으로 IL-6의 분비량이 증가하는 경향을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). IL-6는 염증성 cytokine의 일종으로 간손상시 kuffer cell이나 침윤된 염증세포, 간성상세포에서 분비되며 간성상세포를 활성화시키고 초기 염증반응을 촉진하는 역할을 한다.
- 실험 결과 ASMA, collagen type 1a2는 24시간 처리군에서 대조군에 비해 합성이 감소하는 효과를 보였는데 2가지 모두 62.5μg/ml와 500μg/ml 농도에서 가장 큰 감소폭을 보였다.
- 山靑木이 간성상세포의 증식에 미치는 영향을 확인해보기 위해 각각 24시간과 48시간 동안 약제 처리를 한 후 BrdU assay를 시행하였다. 실험결과 모든 농도에서 유의성 있게 세포증식이 억제됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- MMP-2는 24시간과 48시간처리군에서 모두 일정한 경향성을 발견할 수 없었다. 이러한 결과로 보아 山靑木 추출물은 24시간에서 ASMA와 collagen type 1a2에 대한 억제 효과가 있으나 48시간까지는 지속되지 않는 것으로 생각된다.
- 이상에서 山靑木은 간섬유화에 관여하는 간성상세포의 세포 활성도와 세포 증식도를 억제하고, collagen 합성 및 섬유화 인자를 억제하며 간성상세포에서 IL-6의 분비를 증가시키는 것으로 관찰되었다. 山靑木의 간섬유화 억제의 자세한 기전 및 동물 실험 등 다른 조건에서의 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- 이상에서 山靑木은 간섬유화에 관여하는 간성상세포의 세포 활성도와 세포 증식도를 억제하고, collagen 합성 및 섬유화 인자를 억제하며 간성상세포에서 IL-6의 분비를 증가시키는 것으로 관찰되었다. 山靑木의 간섬유화 억제의 자세한 기전 및 동물 실험 등 다른 조건에서의 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 그러므로 현재는 거의 민간에서만 쓰이고 있지만 간질환 치료에 한약재로 충분히 사용 가능하다고 생각된다. 그러나 상기한 효과를 보이는 기전에 대한 연구가 아직 미비하고, 간질환 중에서도 특정 질환에 대한 영향에 관한 연구는 거의 없는 실정이기 때문에 이에 대한 추가적인 연구들이 이루어져야 할 것이다.
- 이를 토대로 Herruzo 등은 랫드24와 토끼25를 이용한 섬유화 실험에서 IL-6가 관련 유전자 발현을 촉발시킴으로써 MMP-13 생성을 증가시켰으며, IL-6 농도와 처리 시간에 비례하여 MMP-13의 생성도 증가시켜 IL-6가 간섬유화를 유발하는 것이 아니라 억제한다고 보고했다. 위의 연구 결과들에 비추어 본다면 IL-6 분비가 증가되어 matrix degenaration을 통해 간섬유화 억제 효과를 보일 수 있다는 가설을 세울 수 있으나, IL-6의 간섬유화에 미치는 영향에 대한 논쟁이 먼저 해결되어야 할 것이고, 또한 산청목이 IL-6의 분비에 미치는 영향에 대해서도 추가 연구를 통해 확인해야 할 것으로 보인다.
- 이상에서 山靑木은 간성상세포의 활성과 증식을 억제하고, procollagen 합성을 억제시키는 효과가 있는 것으로 나타났으며, 그 작용기전에 대하여는 추후 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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