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문제 정의
- Renin-angiotensin-aldosterone계에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈장 내 aldosterone의 수치를 살펴보았다. aldosterone의 농도는 SHR-GOJ 투여군이 33.
- 이에 저자는 加味玉女煎이 고혈압 유관인자에 미치는 영향을 밝히고자 정상군(WKY), 대조군(SHR), 加味玉女煎 투여군(SHR-GOJ)으로 나누어, 세포독성 및 간독성(ALT, AST), 몸무게 및 장기무게에 미치는 영향, 혈압 및 심박수에 미치는 영향, 혈장 내 aldosterone 농도 변화에 미치는 영향, dopamine, norepinephrine, epinephrine의 농도에 미치는 영향 및 전해질(Na+, K+, Cl-, Ca++) 변화에 미치는 영향, 신기능에 미치는 영향(uric acid, BUN, creatinine) 등을 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 실험동물은 정상군(WKY), 대조군(SHR) 그리고 실험군(SHR-GOJ)으로 각 군 6마리씩 실험을 실시하였다. SHR-GOJ군에는 성인 기준 하루 두첩 분량 (56.7 mg/kg)으로 4주 동안 매일 GOJ를 투여하였고, SHR군은 동량의 증류수를 투여하였다.
- . 加味玉女煎은 玉女煎 本方에 生地黃, 白芍藥, 石決明, 牡蠣, 磁石을 가한 처방으로 腎精不足하고 肝陽上亢하는 고혈압에 유효하리라 사료되어 加味玉女煎을 시료로 선정하였다.
- 加味玉女煎이 혈압 유관인자의 변화에 미치는 영향을 연구하기 위해, 혈압 및 심박수의 변화, 혈장 내 aldosterone, catecholamine 함량 및 전해질 농도의 변화 등을 측정, 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 혈압과 심박 수는 혈압측정기를 사용하여 측정하였다. 동물들의 안정을 위해 측정 전에 3회 이상 홀더에 적응을 시켰고, 혈압과 심박수는 10회 이상 측정하여 평균을 결과로 사용하였다.
- 배양한 human fibroblast cells를 96 well plate에 2×105 cell씩 분주한 후 배양하고, 24시간 후 GOJ를 200, 100, 50, 25, 12.5 ㎍/㎖ 농도로 투여하였다.
- 분리한 혈청은 생화학기기를 이용하여 AST, ALT, BUN, creatinine, uric acid를 측정하였고, Na+, K+, Cl-, Ca++의 측정은 전해질 측정기를 이용하였다. 혈장 성분은 감마 카운터기를 이용하여 핵의학적 방법으로 aldosterone, dopamine, norepinephrine, epinephrine을 측정하였다.
- 시료 추출 방법은 GOJ 2첩을 한약 약탕기에 넣고, 정제수 1500 ㎖와 같이 혼합하여 3시간 열탕하여 추출한 후 흡입 여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 GOJ를 분리한 후, 다시 동결 건조기에서 24시간 동결 건조하여 분말 18 g을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온냉동고 (-80℃)에서 보관하면서, 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
- 신기능에 미치는 영향을 확인하기 위해 uric acid, BUN, creatinine 을 검사하였다. Uric acid, BUN, creatinine의 수치를 측정한 결과, SHR-GOJ 투여군은 각각 3.
- 심장 및 혈관의 작용과 밀접한 연관이 있는 dopamine, norepinephrine, epinephrine의 농도를 측정하여 혈압조절에 유의성이 있는지를 살펴보았다. 혈장 성분 분석 결과, dopamine과 norepinephrine에서 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다.
- 약물의 안전성 확보를 위하여 GOJ의 독성검사를 in vitro, in vivo에서 실시하였다. 먼저 세포독성검사에서 200㎍/㎖의 농도에서 90.
- 이에 저자는 加味玉女煎이 고혈압 유관인자에 미치는 영항을 밝히고자 정상군(WKY), 대조군(SHR), 加味玉女煎 투여군(SHR-GOJ)으로 나누어, 증류수와 GOJ 추출물을 각각 4주 동안 경구투여한 후 세포독성 및 간독성(ALT, AST), 몸무게 및 장기무게에 미치는 영향, 혈압 및 심박수에 미치는 영향, 혈장 내 aldosterone 농도 변화에 미치는 영향, dopamine, norepinephrine, epinephrine의 농도에 미치는 영향 및 전해질(Na+, K+, Cl-, Ca++) 변화에 미치는 영향, 신기능에 미치는 영향 등을 측정하였다.
- 혈압과 심박 수는 혈압측정기를 사용하여 측정하였다. 동물들의 안정을 위해 측정 전에 3회 이상 홀더에 적응을 시켰고, 혈압과 심박수는 10회 이상 측정하여 평균을 결과로 사용하였다.
- 의 측정은 전해질 측정기를 이용하였다. 혈장 성분은 감마 카운터기를 이용하여 핵의학적 방법으로 aldosterone, dopamine, norepinephrine, epinephrine을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 백서는 7주령, 체중 200-220g의 雄性 Wister kyoto rats (WKY)와 spontaneously hypertensive rats (SHR)을 실험 당일까지 고형사료 (슈퍼피드, 강원도, Korea)를 자유 식이하면서 물을 충분히 공급하였다. 실온 22 ± 2℃, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (07:00 ~ 19:00), 조도 150 ~ 300 Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 쥐만을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 加味玉女煎 (Gamioknyeo-jeon : GOJ)의 구성 약물은 대전대학교 부속한방병원에서 구입 후 정선하여 사용하였다. 약물 구성은 다음과 같다(Table.
- 본 연구에 사용된 기기는 Ice-maker (Vision, Korea), Serum separator (녹십자, Korea), Centrifuge (Beckman Co., USA), Rotary vaccum evaporator (Büchi 461, Switzerland), Deep freezer (Sanyo Co., Japan), Freeze dryer (Eyela Co., Japan), Autoclave (Hirayama, Japan), Ultrasonic cleaner (Branson Ultrasonics Co., USA), ELISA reader (Molecular Divice., USA), Roller Mixer (Gowon scientific technology Co., Korea), 한약유출기 (DWP-1800T, 웅진, Korea), Spectrophotometer (UV-256.7, Shimazu, Japan), Non invasive blood pressure system (CODA6, Kent, USA), Balance (CAS, Korea), 생화학기기 (AU400, Olimpus, USA), 전해질 측정기 (NOVA5, Japan), 감마 카운터기 (WIZARD 1470, Finland) 등이다.
- 본 연구에 사용된 시약은 Dulbecco`s phosphate buffered saline (DPBS-A; Sigma Co., USA), RPMI 1640 (Sigma Co., USA), Collagenase A (BM, USA), DNase type Ⅰ (Sigma. Co., USA), Penicillin (Sigma.Co., USA), pyrogallol (Sigma. Co., USA), Streptomycin (Sigma. Co., USA), Amphotericin B (Sigma. Co., USA), Trypsin (invitrogen., USA), Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; Sigma., USA), 3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma., USA), Dimethyl sulfoxide (DMSO; Sowa chemical., Japan), 3.8% Sodium citrate (Sigma Co., USA), Ethylacrtate (Junsei., Japan), Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4; Yakuri., Japan), Bovine serum albumin (BSA; Sigma, USA), 정제수(동원샘물, Korea) 등이며, 이 밖에 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 실온 22 ± 2℃, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (07:00 ~ 19:00), 조도 150 ~ 300 Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 쥐만을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 정상군(WKY), 대조군(SHR) 그리고 실험군(SHR-GOJ)으로 각 군 6마리씩 실험을 실시하였다. SHR-GOJ군에는 성인 기준 하루 두첩 분량 (56.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과를 t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구하였다. 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 <0.
이론/모형
- 세포독성 측정은 MTT assay로 하였다. 배양한 human fibroblast cells를 96 well plate에 2×105 cell씩 분주한 후 배양하고, 24시간 후 GOJ를 200, 100, 50, 25, 12.
성능/효과
- 1. 加味玉女煎은 hFCs의 세포독성과 SHR의 간독성 평가상 유의한 독성변화를 보이지 않았다.
- 2. 加味玉女煎은 유의성 있게 심박수를 감소시켰고, 혈압을 강하시켰다.
- 3. 加味玉女煎은 aldosterone을 유의성 있게 감소시켰다.
- 4. 加味玉女煎은 dopamine, norepinephrine을 유의성 있게 감소시켰다.
- AST 측정결과, WKY는 221.7±5.1 I.U/L, SHR 은 205.0±9.2 I.U/L, SHR-GOJ은 211.7±4.0 I.U/L으로 나타났고, ALT 측정결과, WKY는 51.7±5.8 I.U/L, SHR은 60.3±6.7 I.U/L, SHR-GOJ은 58.7±7.0 I.U/L으로 나타났다(Fig. 2).
- Uric acid, BUN, creatinine의 수치를 측정한 결과, SHR-GOJ 투여군은 각각 3.2±0.6 mg/㎗, 21.3±1.2 mg/㎗, 0.6±0.1mg/㎗로 나타나 대조군인 SHR군이 4.4±0.6 mg/㎗, 23.8±0.4 mg/㎗, 0.7±0.1 mg/㎗ 인 것에 비해 유의하게 감소하였다.
- hFCs에 대한 세포생존율을 관찰한 결과, 대조군은 104±0.7 (%)인데 비하여, GOJ 투여군 12.5, 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖)의 농도에서는 각각 101.2±1.2, 100.6±0.6, 97.3±1.6, 93.8±0.7, 90.7±1.1 (%)로 나타났다(Fig. 1).
- 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 <0.05일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- 이상의 실험 결과를 종합해 보면, GOJ는 세포 및 간장과 신장에 대한 독성평가를 통해 안전성이 확인되었고, 혈압과 맥박수를 동시에 저하시켜 베타-adrenalin 수용체 차단제와 유사하게 작용할 것으로 추정되었으나, 혈액검사상 epinephrine 수치는 변화가 없고 norepinephrine 수치가 감소한 것을 근거로 알파-adrenalin 수용체 차단제와 유사한 작용을 한 것으로 추정하고 있습니다. 또한 aldosterone 수치가 감소하여 angiotensin 전환효소 억제제나 angiotensin 수용체 차단제의 작용도 있는 것으로 사료되며, 전해질에서도 비록 sodium 수치는 감소하지 않았지만 chloride 수치가 감소하여 세포외액량 감소를 통한 혈압조절가능성도 있는 것으로 사료된다.
- 이상의 실험 결과를 종합해 보면, GOJ는 세포 및 간장과 신장에 대한 독성평가를 통해 안전성이 확인되었고, 혈압과 맥박수를 동시에 저하시켜 베타-adrenalin 수용체 차단제와 유사하게 작용할 것으로 추정되었으나, 혈액검사상 epinephrine 수치는 변화가 없고 norepinephrine 수치가 감소한 것을 근거로 알파-adrenalin 수용체 차단제와 유사한 작용을 한 것으로 추정하고 있습니다. 또한 aldosterone 수치가 감소하여 angiotensin 전환효소 억제제나 angiotensin 수용체 차단제의 작용도 있는 것으로 사료되며, 전해질에서도 비록 sodium 수치는 감소하지 않았지만 chloride 수치가 감소하여 세포외액량 감소를 통한 혈압조절가능성도 있는 것으로 사료된다.
- 심장 및 혈관의 작용과 밀접한 연관이 있는 dopamine, norepinephrine, epinephrine의 농도를 측정하여 혈압조절에 유의성이 있는지를 살펴보았다. 혈장 성분 분석 결과, dopamine과 norepinephrine에서 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다. Norepinephrine은 주로 알파 수용체를 흥분시켜 전신의 혈관을 수축시키는 물질로 알파-adrenalin 수용체 차단제는 norepinephrine의 작용을 차단한다15,16.
후속연구
- 이상의 결과들로 미루어 보아 加味玉女煎은 고혈압의 치료에 사용될 수 있을 것으로 생각되며, 그 작용기전에 대해 보다 많은 연구가 필요하리라 사료된다.
- 향후 보다 정밀한 연구를 통해 GOJ는 고혈압의 치료에 활용 가치가 높으리라 생각되고, 고혈압 의원인 및 한약의 혈압강하 작용기전에 대한 지속적인 연구를 통해 고혈압의 한방치료가 개발되어야 할 것으로 사료된다.
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