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문제 정의
- 본 연구에서는 제비꽃 추출물로부터 분리된 활성물질 αTP의 항산화 활성 및 세포 보호효과를 확인함으로써 인구고령화와 더불어 사회적 문제가 되고 있는 퇴행성 신경질환의 치료제로써의 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
- α-TP의 apoptosis 억제효과를 측정하기 위하여 핵의 변화를 관찰하였다.
- 10 µL의 시료 (100, 500, 1000 µg/mL), 음성대조구 (PBS) 또는 Trolox standard를 ABTS radical cation과 5분 동안 30℃에서 배양하면서 흡광도의 변화를 UV/VIS spectrophotometer로 734 nm의 파장에서 측정하였다.
- 16,17) 본 연구팀에서는 국내, 외에서 자생하고 있는 약용식물 추출물을 대상으로 뇌신경세포계 hybridoma N18-RE-105 세포를 이용하여 고농도의 glutamate로부터 유도되는 산화적 스트레스로부터 세포보호 효과를 갖는 천연물의 탐색을 시도하였다.
- 32) 이렇듯 강력한 세포사멸을 유도하는 glutamate의 세포독성으로 부터 α-TP의 세포 보호효과를 알아보기 위해 광학현미경하에서 세포의 형태학적인 변화를 관찰하였다.
- 110 mm, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고, 이 여액을 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 acetone 추출물을 얻었다. Acetone 추출물의 극성을 각각 달리하여 hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water로 순차적으로 용매 분획하여 bioassay를 해본 결과 hexane 층에서 활성을 확인하였다. 다음으로 CHCl3 : MeOH = 100 : 1의 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하였다.
- 5% Triton X-100 용액을 50 µL 첨가하여 40 rpm으로 10분 동안 shaking시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50 µL를 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 glutamate 실험군과 비교한 값을 나타내었다.
- MTT reduction assay − 세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다.
- Acetone 추출물의 극성을 각각 달리하여 hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 water로 순차적으로 용매 분획하여 bioassay를 해본 결과 hexane 층에서 활성을 확인하였다. 다음으로 CHCl3 : MeOH = 100 : 1의 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하였다. 활성이 우수한 부분을 모아서 HPLC를 실시한 결과, 90% MeOH와 UV 254 nm의 조건에서 활성물질의 peak을 확인할 수 있었으며, 이를 JBK-1이라 명명하였다(Fig.
- 반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 µL 첨가하여 녹이고 ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포생존율을 구하였다.
- 본 연구에서는 제비꽃 (Viola mandshurica) 추출물에서 항산화 활성 및 세포 보호효과를 확인하고 활성물질의 분리 및 정제를 실시하여, αtocopherol의 유도체인 9-hydroxy-α-tocopherone (α-TP)을 분리하였다.
- 하지만 제비꽃에 관한 생리·약리학적 연구는 아직 초보적인 단계에 불과하며, 특히 신경세포 보호효과와 관련된 연구는 수행된 바가 없다. 본 연구팀은 제비꽃 추출물로부터 항산화 활성 및 세포 보호효과를 가지는 생리활성물질을 분리하고자 제비꽃의 acetone 추출물을 hexane, diethyl ether, ethyl acetate 및 물 층으로 순차적 분획하여 silica gel column chromatography를 실시하여 비극성이 높은 물질 순으로 분리하였다. 최종적으로 HPLC를 실시하여 단일물질로 분리한 다음, 이 활성물질을 JBK-1이라 명명하였다.
- 사용된 배지는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 1 × HAT supplement를 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- 세포생존율 측정을 위해 MTT reduction assay 방법을 이용하여 아무것도 처리하지 않은 정상군과 glutamate를 처리한 대조군 그리고 glutamate와 α-TP를 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다.
- 세포의 형태학적 변화 관찰 − α-TP와 20 mM의 glutamate의 처리에 대한 N18-RE-105 세포의 형태학적인 변화에 대한 관찰을 위해 세포를 6-well plate에 1 × 105 cells/mL로 분주하여 24시간 배양하여 phase-contrast microscope (TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포 형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.
- PBS 완충용액으로 2회 세척하고 10% formalin을 처리하여 2시간 고정한 후 다시 PBS 완충용액으로 세척하고 Hoechst 33342 (Sigma)로 30분 동안 염색하였다. 염색 후 PBS 완충용액으로 세척하고 형광현미경으로 각 well의 세포를 관찰하고 400배로 사진 촬영하였다.
- α-TP의 apoptosis 억제효과를 측정하기 위하여 핵의 변화를 관찰하였다. 즉, 세포의 수축과 응축으로 인해 일어나는 apoptotic body를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색체인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다. Fig.
- 추출 및 분리 − 건조된 제비꽃 500 g에 acetone 10 L을 가하여 3일 동안 상온에서 침출시켜 추출한 후, 여지(5C. 110 mm, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고, 이 여액을 감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 acetone 추출물을 얻었다.
- 최종적으로 HPLC를 실시하여 단일물질로 분리한 다음, 이 활성물질을 JBK-1이라 명명하였다. 활성물질 JBK-1의 화학 구조를 결정하기 위해 UV, HR-ESIMass, NMR spectrum 분석을 실시하였다. 그 결과, 활성물질 JBK-1의 화학 구조는 α-tocopherol의 유도체인 9-hydroxyα-tocopherone (α-TP)으로 동정되었다.
대상 데이터
- Hoechst 33342 염색 − N18-RE-105 세포주의 apoptosis 유도 활성을 측정하기 위하여 Hoechst 33342로 세포의 핵을 염색하였다.
- 시약 및 실험재료 − 본 실험에서 사용된 제비꽃은 경상남도 산청군 지리산 근처에서 채집하여 음건, 추출하여 실험에 사용하였다. 세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 L-glutamic acid, MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), ascorbic acid는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였으며, LDH (Lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), horse serum (HS) 및 HAT supplement 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다.
- 세포주 및 배양 − 본 실험에 사용된 세포주는 hybridoma N18-RE-105로써 한국생명공학연구원에서 분양 받아 사용하였다.
- 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), horse serum (HS) 및 HAT supplement 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다.
- 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), horse serum (HS) 및 HAT supplement 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다. 시료 추출용 유기용매는 99% 이상의 1급 시약(Daejung Chemical, Ltd, Korea)으로 ethanol, hexane, diethyl ether, ethyl acetate 등을 사용하였고, HPLC 분석용매는 Baker사(USA)의 특급용매를 사용하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
- 시약 및 실험재료 − 본 실험에서 사용된 제비꽃은 경상남도 산청군 지리산 근처에서 채집하여 음건, 추출하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Values not sharing the same letter are significantly different from one another by Duncan multiple range test (p<0.05).
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다.
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거능 측정 − DPPH (2,2,-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Mensor 등21,22)의 방법에 준하여 시료 20 µL에 0.2 mM의 DPPH 용액 80 µL를 가하여 10초 동안 강하게 진탕하여 실온에서 10분 동안 방치한 후, 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- LDH release assay − 세포 보호효과를 측정하기 위한 방법으로 LDH (lactate dehydrogenase) release assay를 실시하였다.
- 총 항산화능(Total radical trrapping antioxidant potential, TRAP) 측정 − 시료의 총항산화능(TRAP)은 Rice-Evans와 Miller23)의 inhibition assay 방법에 따라 분석하였다.
성능/효과
- α-TP 1000 µg/mL의 농도에서 52.5%로 가장 높은 라디칼 소거활성을 나타내었으며, 다음으로 500, 100, 50 µg/mL에서는 각각 43.5, 12.7, 5.5%의 활성을 보여, 농도 의존적인 결과를 나타내었다.
- α-TP의 항산화 활성을 알아보기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과, 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 1,2) 이러한 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제의 개발과 연구에 더 많은 관심이 집중되고 있다.3,4) 인체는 정상적인 상태에서 superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase 등 항산화 효소와 glutathione (GSH), uric acid 등의 여러 가지 비효소적 항산화 물질들에 의해 활성산소의 축척이나 해로운 산화작용을 막음으로 인해 활성산소 생성과 항산화 효소에 의한 제거작용이 균형을 이루고 있다. 그러나 활성산소들은 불안정하고 산화력이 높아 여러 생체 물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스를 유발하게 되며 동맥경화 및 당뇨병 등 각종 질병을 일으킬 뿐만 아니라 생체 대사과정에서 세포막 지질을 과산화시키고 세포막 투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시킨다.
- Fig. 7A의 결과와 같이, glutamate 처리군의 세포생존율은 40.7%로 나타났으나, α-TP를 10, 50, 100 ng/mL의 농도로 세포에 처리했을 때의 세포생존율은 41.8, 51.6, 72.4%로 증가하였다.
- Fig. 8과 같이 glutamate 처리군의 세포핵은 condensation과 fragmentation으로 인한 apoptotic body가 핵 주변에 나타나는 전형적인 apoptosis 특징을 보이는 반면에 50, 100 ng/mL 농도의 α-TP를 처리했을 때 정상군과 유사하게 타원형의 온전한 핵 모양을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- Glutamate가 세포에 손상을 끼침에 따라 세포막 파괴로 인해 LDH 방출량이 높은 것과 대조적으로 α-TP 처리군에서는 농도 의존적으로 glutamate가 유도하는 산화적 스트레스로 인한 세포손상으로부터 N18-RE-105 세포를 보호함에 따라 효과적으로 LDH 방출량을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
- Glutamate가 처리된 N18-RE-105 세포에 α-TP를 10, 50, 100 ng/mL로 처리하여 glutamate 처리군과 비교한 결과, glutamate 단독 처리군에서는 58%의 LDH를 방출하는 것을 확인할 수 있는데 반해 α-TP 처리군에서는 LDH 방출량이 40.9%, 30.8%, 25.9% 로 감소하여 정상군의 수준으로 회복되었다는 것을 확인할 수 있었다.
- JBK-1의 구조 결정 − 제비꽃 acetone 추출물로부터 순수 분리된 활성물질 JBK-1은 황색 분말로서, HR-ESI-Mass spectrum의 분석 결과, negative mode [M-H]-에서 445의 분자이온의 peak가 나타났으며, positive mode [M-H2O]+에서429의 ion fragment peak가 검출되었다(Fig. 2).
- MTT reduction assay에서도 동일하게 glutamate 단독 처리 시 40.7%의 세포생존율을 나타내는데 반하여 α-TP을 처리한 세포에서는 41.8, 51.6, 72.4%로 농도 의존적으로 세포가 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
- 16,17) 본 연구팀에서는 국내, 외에서 자생하고 있는 약용식물 추출물을 대상으로 뇌신경세포계 hybridoma N18-RE-105 세포를 이용하여 고농도의 glutamate로부터 유도되는 산화적 스트레스로부터 세포보호 효과를 갖는 천연물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 제비꽃(Viola mandshurica) 추출물로부터 강력한 항산화 활성 및 세포보호 효과를 확인할 수 있었다. 제비꽃은 다년생 표본으로 줄기가 없고 잎은 뿌리로부터 총생하며 엽병이 길고 날개가 있다.
- 그 결과, Fig. 6과 같이 정상군에 비해 대조군은 스트레스로 인하여 신경 돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포가 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었으나, α-TP를 50, 100 ng/mL 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포의 생존을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, 활성물질 JBK-1의 화학 구조는 α-tocopherol의 유도체인 9-hydroxyα-tocopherone (α-TP)으로 동정되었다.
- 이상의 Mass spectrum 결과로부터 JBK-1의 분자량은 446으로, 분자식은 C29H50O3로 결정되었다. 그리고 UV spectrum 분석 결과, JBK-1은 292 nm (aqueous acetonitrile)에서 최대 흡수 파장을 보이고 있었으며, 230 nm (aqueous acetonitrile)에서 shoulder가 관측되었다. 이것은 α-tocopherol의 특징적인 자외선 최대 흡수파장으로, 292와 230 nm에서 관측된 spectrum을 통해 JBK-1의 구조가 항산화 활성으로 알려져 있는 α-tocopherol의 유도체일 가능성이 제시되었다(Fig.
- 또한 세포 보호효과를 확인하기 위해 N18-RE-105 세포에 50, 100 ng/mL로 처리하여 형태학적인 변화를 관찰한 결과, glutamate를 단독으로 처리한 대조군에 비해 α-TP을 처리한 각 세포에서는 신경돌기의 출현 유도를 통한 신경세포 생존을 확인할 수 있었다.
- 이 결과는 α-TP가 glutamate의 산화적 스트레스로부터 유도되는 세포사를 강력하게 억제한다는 것을 시사하고 있다.
- 이러한 N18-RE-105 세포의 형태학적인 변화를 통하여 α-TP가 glutamate에 의한 세포의 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신할 수 있었다.
- 2). 이상의 Mass spectrum 결과로부터 JBK-1의 분자량은 446으로, 분자식은 C29H50O3로 결정되었다. 그리고 UV spectrum 분석 결과, JBK-1은 292 nm (aqueous acetonitrile)에서 최대 흡수 파장을 보이고 있었으며, 230 nm (aqueous acetonitrile)에서 shoulder가 관측되었다.
- 이상의 결과로부터 제비꽃 추출물로부터 분리한 α-TP는 항산화 활성과 glutamate의 산화적 스트레스로부터 유도되는 세포독성을 강력하게 억제하여 N18-RE-105 세포를 보호하고 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 인구 고령화와 더불어 증가하고 있는 퇴행성 신경질환을 치료하거나 예방할 수 있는 치료제로써의 가능성을 제시하였다.
- 최고 농도인 1000 µg/mL에서 positive control로 사용된 vitamin C (1000 µg/mL에서 72.7%)와 비교 시, α-TP는 비교적 높은 라디칼 소거활성을 보였다.
- 다음으로 CHCl3 : MeOH = 100 : 1의 전개 용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하였다. 활성이 우수한 부분을 모아서 HPLC를 실시한 결과, 90% MeOH와 UV 254 nm의 조건에서 활성물질의 peak을 확인할 수 있었으며, 이를 JBK-1이라 명명하였다(Fig. 1).
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