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문제 정의
- 본 연구는 IC-RT-PCR을 이용하여 RT-PCR의 복잡한 전처리 과정의 단순화하고, 박과류의 종자전염바이러스 검사에 IC-RT-PCR의 활용 가능성 확인을 목적으로 수행하였다.
제안 방법
- RT-PCR. CGMMV 검출을 위해 CGMMV-N30/CGMMVC60 프라이머를 이용하였으며, KGMMV와 ZGMMV의 검출은 KGMMV-N60/KGMMV-C10을 이용하여 RT-PCR을 실시하였다(이 등, 2003). RT-PCR은 IC 추출액 5 µl와 각 프라이머 1 µl, DEPC water 13 µl를 Maxime RT Premix kit(Intron, Seoul, KR)에 첨가하고, PC-808 thermal cycler(Astec, Fukuoka, JP)를 사용하여 수행하였다.
- DEPC water 10 µl를 첨가하고 플라스틱필름으로 밀봉하여 동일한 방법으로 열처리 후 RT-PCR을 수행하였다.
- , Seoul, KR)를 구입하여 메뉴얼에 따라 수행하였다. IC-RT-PCR과 ELISA의 검출한계의 비교를 위해 CGMMV 에 감염된 박종자의 추출액을 10배씩 단계별로 희석하여 각각 ELISA와 RT-PCR을 수행하였다. Immunocapture과정은 Harness의 방법을 일부 변형하여 적용하였다(Harness 등, 2003).
- ELISA 결과 검증. IC-RT-PCR을 이용하여 ELISA의 검사결과를 재 확인하기 위하여 검출한계 비교시험을 마친 ELISA 마이크로플레이트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 마이크로플레이트의 반응액을 버리고 Immunocapture 과정과 동일한 방법으로 3회 세척 후 15분간 건조하였다.
- IC-RT-PCR을 이용한 바이러스 검출. 박과류의 종자 전염 바이러스를 검출하기 위해 IC-RT-PCR을 수행한 결과 CGMMV의 이병종자 및 잎에서 모두 609 bp의 증폭 밴드를 확인할 수 있었으며, KGMMV 및 ZGMMV의 경우 403 bp의 PCR 증폭 밴드가 나타남으로써 IC-RT-PCR을 이용하여 3종의 바이러스 검출이 가능하였다(Fig.
- RT-PCR은 IC 추출액 5 µl와 각 프라이머 1 µl, DEPC water 13 µl를 Maxime RT Premix kit(Intron, Seoul, KR)에 첨가하고, PC-808 thermal cycler(Astec, Fukuoka, JP)를 사용하여 수행하였다.
- 건조된 PCR 튜브에 DEPC water 20 µl를 첨가하여 70oC에서 15분간 열처리하고 얼음에 넣어 Immunocapture 과정을 수행하였다.
- 박과작물에 발생하는 종자전염 바이러스 3종(CGMMV, KGMMV, ZGMMV)에 대한 검출을 위해 IC-RT-PCR의 적용 가능성을 시험하였다. IC-RT-PCR을 이용하여 감염 종자와 잎으로 부터 바이러스의 특이적인 검출이 가능하였으며, 검출 민감도는 ELISA 보다 100배 이상 높았다.
- 박과작물의 종자전염 바이러스 검사과정에 RT-PCR의 복잡하고 번거로운 RNA 추출과정을 생략하고 다량의 시료를 동시에 처리하기 위해 IC-RT-PCR의 활용 방법을 모색하였다. 본 연구를 통해 IC-RT-PCR 방법이 standard RTPCR의 민감성은 유지하면서 시료의 전처리 과정을 생략할 수 있으며 또한 ELISA 검사결과의 검증까지 가능한 검사법으로 확인되었다.
- 양성대조구는 이병종자로부터 추출한 total-RNA를 사용하였으며, 음성대조구는 건전한 박종자를 사용하였다. 반응 온도는 reverse transcription을 위해 42oC에서 2분, 95oC에서2분 처리하고, PCR 증폭은 95oC 45초, 60oC 60초, 72oC60초로 40회 증폭시켰으며 마지막에 72oC에서 10분간 처리하였다. 최종 RT-PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- 반응 온도는 reverse transcription을 위해 42oC에서 2분, 95oC에서2분 처리하고, PCR 증폭은 95oC 45초, 60oC 60초, 72oC60초로 40회 증폭시켰으며 마지막에 72oC에서 10분간 처리하였다. 최종 RT-PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
대상 데이터
- ELISA 및 IC 처리. ELISA 검사는 국내에 시판중인 DAS-ELISA 키트(Agdia, Inc., Elkhart, IN; Kisan Biotech Co., Seoul, KR)를 구입하여 메뉴얼에 따라 수행하였다. IC-RT-PCR과 ELISA의 검출한계의 비교를 위해 CGMMV 에 감염된 박종자의 추출액을 10배씩 단계별로 희석하여 각각 ELISA와 RT-PCR을 수행하였다.
- 바이러스 이병시료. 식물검역과정에서 CGMMV와 KGMMV가 검출된 박종자 시료를 수집하고, (주)농우바이오에서 CGMMV, KGMMV, ZGMMV가 감염된 박, 수박, 호박의 잎과 종자를 추가로 분양받아 실험에 사용하였다.
- RT-PCR은 IC 추출액 5 µl와 각 프라이머 1 µl, DEPC water 13 µl를 Maxime RT Premix kit(Intron, Seoul, KR)에 첨가하고, PC-808 thermal cycler(Astec, Fukuoka, JP)를 사용하여 수행하였다. 양성대조구는 이병종자로부터 추출한 total-RNA를 사용하였으며, 음성대조구는 건전한 박종자를 사용하였다. 반응 온도는 reverse transcription을 위해 42oC에서 2분, 95oC에서2분 처리하고, PCR 증폭은 95oC 45초, 60oC 60초, 72oC60초로 40회 증폭시켰으며 마지막에 72oC에서 10분간 처리하였다.
성능/효과
- IC-RT-PCR에 의한 ELISA의 검증. ELISA 검사를 모두 마친 마이크로플레이트를 이용하여 동일한 방법으로 IC-RT-PCR을 실시한 결과 민감도가 다소 저하되었으나 ELISA와 동일한 수준에서 검사결과가 재현되었다(Fig. 2A, Fig. 3). 따라서 ELISA 결과의 오반응이 의심되거나 결과 판정이 불확실한 경우 검사결과를 검증하는 방법으로써도 IC-RT-PCR의 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- ELISA와 IC-RT-PCR의 검출한계 비교를 위해 CGMMV 감염종자 마쇄액을 100부터 10−6까지단계별로 희석하여 두 가지 검사를 동시에 수행한 결과 ELISA는 10−2까지 검출이 가능하였고(Fig. 2A), IC-RT-PCR은 10−4까지 검출이 가능하였다(Fig. 2B).
- 박과작물에 발생하는 종자전염 바이러스 3종(CGMMV, KGMMV, ZGMMV)에 대한 검출을 위해 IC-RT-PCR의 적용 가능성을 시험하였다. IC-RT-PCR을 이용하여 감염 종자와 잎으로 부터 바이러스의 특이적인 검출이 가능하였으며, 검출 민감도는 ELISA 보다 100배 이상 높았다. 또한 반응을 마친 ELISA 마이크로플레이트에 남아있는 항원을 IC-RT-PCR의 template로 사용할 경우 ELISA 결과를 곧바로 확인할 수 있었다.
- 동일한 시료에 대하여 ELISA와 IC-RT-PCR 검사를 동시에 수행하여 비교한 결과 IC-RT-PCR은 모든 바이러스를 검출한 반면에 ELISA 검사법은 KGMMV를 검출하지 못하였다(Table 1). ELISA와 IC-RT-PCR의 검출한계 비교를 위해 CGMMV 감염종자 마쇄액을 100부터 10−6까지단계별로 희석하여 두 가지 검사를 동시에 수행한 결과 ELISA는 10−2까지 검출이 가능하였고(Fig.
- 2B). 따라서 CGMMV 검출을 위한 IC-RT-PCR의 민감도는 ELISA보다 100배 이상 높게 나타났으며, 이러한 민감도는 기존에 보고된 ELISA에 대한 PCR 검사법의 상대적 민감도와 유사한 수준이었다.
- IC-RT-PCR을 이용한 바이러스 검출. 박과류의 종자 전염 바이러스를 검출하기 위해 IC-RT-PCR을 수행한 결과 CGMMV의 이병종자 및 잎에서 모두 609 bp의 증폭 밴드를 확인할 수 있었으며, KGMMV 및 ZGMMV의 경우 403 bp의 PCR 증폭 밴드가 나타남으로써 IC-RT-PCR을 이용하여 3종의 바이러스 검출이 가능하였다(Fig. 1). 이병종자에서 추출한 total-RNA를 사용한 양성대조구의 경우 KGMMV에는 IC-RT-PCR 보다 더 강한 증폭밴드가 나타났지만(Fig.
- 박과작물의 종자전염 바이러스 검사과정에 RT-PCR의 복잡하고 번거로운 RNA 추출과정을 생략하고 다량의 시료를 동시에 처리하기 위해 IC-RT-PCR의 활용 방법을 모색하였다. 본 연구를 통해 IC-RT-PCR 방법이 standard RTPCR의 민감성은 유지하면서 시료의 전처리 과정을 생략할 수 있으며 또한 ELISA 검사결과의 검증까지 가능한 검사법으로 확인되었다. 이러한 IC-RT-PCR 방법을 통해 박과작물의 포장검사와 종자검정에 있어 많은 시료를 효율적으로 처리할 수 있고, 종자에 함유된 다양한 저해물질의 문제도 해결이 가능하다.
후속연구
- 3). 따라서 ELISA 결과의 오반응이 의심되거나 결과 판정이 불확실한 경우 검사결과를 검증하는 방법으로써도 IC-RT-PCR의 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 또한 반응을 마친 ELISA 마이크로플레이트에 남아있는 항원을 IC-RT-PCR의 template로 사용할 경우 ELISA 결과를 곧바로 확인할 수 있었다. 따라서 IC-RT-PCR에 의한 본 검정방법은 박과작물의 대규모 포장검사 및 종자검사에 편리하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 IC-RT-PCR 방법을 통해 박과작물의 포장검사와 종자검정에 있어 많은 시료를 효율적으로 처리할 수 있고, 종자에 함유된 다양한 저해물질의 문제도 해결이 가능하다. 또한 ELISA 양성샘플에 대한 검증시험을 위해 별도의 추가 샘플 없이 곧바로 분자생물학적 검증이 가능하기 때문에 신속하며 비용절감 효과도 기대된다.
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