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문제 정의
- 본 연구에서는 마늘이나 양파 등의 Allium속 채소류의 근권으로부터 미생물을 분리하여 마늘 푸른곰팡이병균에 부패를 현저하게 억제하는 유용미생물을 선발하고, 항균 활성 및 영양원으로서 탄소원과 질소원의 이용성을 조사하였고, 선발 미생물을 공시하여 마늘 푸른곰팡이병을 대상으로 병 억제기작을 구명하였다.
제안 방법
- 약 30분 정도 건조 후 구멍에 Penicillium hirsutum 현탁액이 넘치지 않을 정도로 접종하여 습실 상자에 넣어 20℃ 항온기에 7일간 배양하고 형성된 병반 직경을 기준으로 길항균을 선발하였다. 1차 선발에서는 처리 당 마늘인편 3개씩 3반복으로, 2차 선발시에는 처리 당 마늘인편 10개씩 3반복으로 시험을 수행하였다. 근권 미생물의 발병억제효과는 다음과 같은 계산식에 의해 조사 평가하였다.
- , Hayward, CA)를 이용하고, 그람양성인 길항균에 대해서는 Biolog GP plates를 이용하여 탄소원 및 질소원의 이용성을 조사하여 동정하였다. 그람양성인 길항균에 대해서는 Bartholomew Michell의 방법을 응용한 Walts의 방법에 따라 7.5% malachite green과 0.25% safranine을 사용하여 내생포자 생성여부를 확인하였다.
- 길항균 PA59-4의 먹이경합능력 확인을 위하여 10% 또는 1% 마늘주스에 길항균 현탁액(1.0×108 cfu/ml)을 부피비로 동량 첨가 하여 최종적으로 5% 또는 0.5% 마늘주스를 제조하여 마이크로플레이트의 well에 담았다.
- 길항력이 우수하거나 마늘인편검정에서 병 진전을 현저히 억제하는 균으로 선발된 균에 대해서는 그람염색을 하여 그람음성 및 그람양성을 판정하였으며, 그람음성 길항균에 대해서는 각각 Biolog GN plates(Biolog, Inc., Hayward, CA)를 이용하고, 그람양성인 길항균에 대해서는 Biolog GP plates를 이용하여 탄소원 및 질소원의 이용성을 조사하여 동정하였다. 그람양성인 길항균에 대해서는 Bartholomew Michell의 방법을 응용한 Walts의 방법에 따라 7.
- 마늘 저장병을 일으키는 푸른곰팡이병을 생물적으로 방제하기 위하여 마늘과 양파 등 파속 채소 근권 또는 근면으로부터 미생물 1,292균주를 분리하였다. 분리한 균주를 대상으로 푸른곰팡이병에 대한 항균성 검정과 마늘인 편검정을 실시하여 최종적으로 푸른곰팡이병 진전을 현저히 억제하는 S59-4균주를 선발하였으며, Biolog system을 이용하여 동정한 결과 Pantoea agglomerans 59-4(Pa59-4)로 동정되었다.
- 마늘 푸른곰팡이병 방제용으로 실용화할 수 있는 길항균을 선발하기 위하여 항균성 검정과 마늘인편검정에 의하여 선발된 길항균 158종을 공시하여 마늘인편상에서의 병 진전 억제효과를 평가하였다(Table 4). 158균주 중 99균주는 병 진전을 70% 이상 억제하는 것으로 나타났으며, 99균주 중 29균주는 마늘에 대하여 병원성을 나타내어 마늘 푸른곰팡이병 방제에 사용하기는 곤란한 것으로 평가되었다.
- 마늘은 껍질을 벗긴 후 1% 차아염소산나트륨에 1시간동안 표면살균하고 멸균수로 3번 씻어내고 건조시켰다. 마늘에 직경 2 mm, 깊이 1 mm의 구멍을 2개 내고 흘러넘치지 않을 정도로 길항균 현탁액을 구멍에 접종하였다. 약 30분 정도 건조 후 구멍에 Penicillium hirsutum 현탁액이 넘치지 않을 정도로 접종하여 습실 상자에 넣어 20℃ 항온기에 7일간 배양하고 형성된 병반 직경을 기준으로 길항균을 선발하였다.
- 마늘푸른곰팡이병균에 대한 길항균을 선발하기 위하여 마늘 재배지의 토양, 마늘과 양파의 근권, 저장 중인 마늘과 양파의 표면으로부터 진균과 세균을 분리하였다. 토양시료는 토양 20 g에 물 200 ml을 첨가하여 상온에서 150 rpm으로 진탕한 후 이를 희석하였다.
- 2001년에는 항균활성이 높은 길항균을 선발하기 위하여 분리미생물과 푸른곰팡이병균을 TSA 배지상에 대치 배양하여 병원균 생장을 현저하게 억제하는 미생물을 선발하였다. 마늘푸른곰팡이병균은 PDA 배지상에 7일간 배양한 후 증류수에 106포자/ml 농도로 현탁하여 7 mm paper disc에 피펫팅하여 접종하였고, 검정 대상 미생물을 paper disc에 같이 피펫팅한 후 배양하면서 항균활성 유무를 조사하였다 (Fig. 1).
- 멤브레인을 통한 용액의 이동여부는 crystal violet 용액을 실린더 내부에 넣고 물은 마이크로플레이트의 구멍에 넣거나 또는 그 반대로 하여 확인하였다. 길항균 PA59-4의 먹이경합능력 확인을 위하여 10% 또는 1% 마늘주스에 길항균 현탁액(1.
- 저장중에 푸른색 곰팡이 포자가 형성된 부패 마늘을 골라 포자를 루프에 묻힌 후 potato dextrose agar(PDA) 배지에 도말하여 얻은 균총을 취하여 20℃ 항온기에서 5일간 배양하였다. 배지에 생긴 곰팡이 균총을 새로운 PDA 배지에 이식하여 이를 시험 균주로 이용하였다. 접종원은 병원균을 PDA 배지상에 14일간 배양한 후 배지에 20 ml의 멸균수를 첨가하고 부드러운 고무브러시로 문질러서 병원균 포자를 회수하고 hemacytometer로 계수하여 제조하였다.
- 선발한 길항균 Pa59-4의 항균활성을 알아보기 위하여 감자한천배지, TSA 및 1/10 TSA배지를 직경 9 cm 페트리디쉬에 20 ml씩 분주한 후 병원균과 길항균 Pa59-4를 대치배양(배지 중앙에 푸른곰팡이병균을 접종하고 대각선으로 정사각형이 되도록 길항균 현탁액을 묻힌 paper disc를 치상)하여 푸른곰팡이 병균에 대한 Pa59-4의 저지원 형성여부를 조사하였다.
- 약 30분 정도 건조 후 구멍에 Penicillium hirsutum 현탁액이 넘치지 않을 정도로 접종하여 습실 상자에 넣어 20℃ 항온기에 7일간 배양하고 형성된 병반 직경을 기준으로 길항균을 선발하였다.
- 병원균과 길항균이 접종된 실린더를 포함하는 마이크로플레이트는 25℃에서 24시간과 48시간 인큐베이션한 후에 삽입실린더를 well로부터 꺼내어 막에 있는 물을 tissue paper로 닦아내고 membrane을 scapel로 잘라내었다. 잘라낸 membrane 은 슬라이드글라스로 옮겨 lactophenol- cotton blue로 염색하고 마운팅한 다음 광학현미경으로 포자발아 및 균사 생장을 관찰하였다.
- 배지에 생긴 곰팡이 균총을 새로운 PDA 배지에 이식하여 이를 시험 균주로 이용하였다. 접종원은 병원균을 PDA 배지상에 14일간 배양한 후 배지에 20 ml의 멸균수를 첨가하고 부드러운 고무브러시로 문질러서 병원균 포자를 회수하고 hemacytometer로 계수하여 제조하였다.
대상 데이터
- 1). 길항균에 의한 영양분 이용효과를 검정하기 위하여 조직배양용 마이크로 플레이트(24구멍; Costor, Corning Inc., 뉴욕주, 미국)와 실린더(Millicell-CM; Millipore Corp., 메사츄세츄주, 미국)를 사용하였다. 삽입 실린더는 바닥부분에 친수성 폴리테트라에틸렌 멤브레인필터(구멍크기 0.
- 5% 마늘주스를 제조하여 마이크로플레이트의 well에 담았다. 대조로 물 단독, 0.5%와 5% 마늘주스를 조제하여 사용하였다. 푸른곰팡이병균의 포자현탁액(2×105 포자/ml)은 마이크로플레이트 내에 정치한 실린더 안쪽에 0.
- 마늘푸른곰팡이병을 생물적으로 방제하기 위하여 2001년부터 2002년까지 2년에 걸쳐 파속채소의 근권 및 근면으로부터 표면서식미생물 1,292종을 분리하였다(Table 1). 2002년에 마늘인편을 이용한 생물검정을 통하여 선발한 길항균은 대부분 양파나 다른 작물보다는 마늘의 근권과 근면으로부터 주로 분리되었다.
이론/모형
- Pa59-4의 영양원 경합능력을 검정하기 위하여 Janisiewicz 등(2000)이 사용한 방법에 따라 마이크로플레이트상에서 푸른곰팡이병균의 포자발아 및 생장정도를 조사하였다(Fig. 1). 길항균에 의한 영양분 이용효과를 검정하기 위하여 조직배양용 마이크로 플레이트(24구멍; Costor, Corning Inc.
- 길항균은 대치배양법과 마늘인편을 이용한 생물 검정법을 이용하여 선발하였다. 2001년에는 항균활성이 높은 길항균을 선발하기 위하여 분리미생물과 푸른곰팡이병균을 TSA 배지상에 대치 배양하여 병원균 생장을 현저하게 억제하는 미생물을 선발하였다.
성능/효과
- 마늘 푸른곰팡이병 방제용으로 실용화할 수 있는 길항균을 선발하기 위하여 항균성 검정과 마늘인편검정에 의하여 선발된 길항균 158종을 공시하여 마늘인편상에서의 병 진전 억제효과를 평가하였다(Table 4). 158균주 중 99균주는 병 진전을 70% 이상 억제하는 것으로 나타났으며, 99균주 중 29균주는 마늘에 대하여 병원성을 나타내어 마늘 푸른곰팡이병 방제에 사용하기는 곤란한 것으로 평가되었다.
- In vitro에서 항균성 검정시 항균활성을 보인 길항균 89종을 처리하였을 때의 푸른곰팡이병균의 포자색깔의 변화를 유형별로 구분하여 조사한 결과 항균활성을 보인 균주 중 24균주는 외관상 변화를 관찰할 수 없었으며, 63균주는 포자를 갈변시켰고, 1균주는 포자를 흑변시켰고, 1균주는 포자형성을 억제시키는 것으로 나타났다.
- PFTE 멤브레인 필터를 이용하여 마늘푸른곰팡이병균과 Pa59-4의 nutrient competition을 조사한 결과, 0.5%와 5% 마늘주스에서는 모두 발아가 잘되었으나 마늘주스에 PA59-4를 혼합하였을 경우에는 0.5%마늘주스에서는 발아가 되지 않았고 5%에서는 마늘 주스만 처리하였을 때 보다 발아가 현저하게 억제되었다(Table 7과 Fig. 3). Pa59-4는 항균활성에 의하여 푸른곰팡이병균을 억제하지 않는 것은 항균활성 검정결과 확인된 바 있고, Pa59-4가 영양원인 마늘주스를 적게 첨가해 주었을 때 푸른곰팡이병균의 포자발아와 균사생장을 현저하게 억제시킨 반면 마늘주스를 많이 첨가해 주었을 때에는 억제효과가 현저하게 저하되었고 길항균 Pa59-4와 함께 접종하였을 때 발아되지 않았던 병원균 포자를 신선한 5% 마늘 쥬스에 접종했을 때에는 다시 잘 발아 되었던(자료생략) 것으로 보아 Pa59-4의 마늘 푸른곰팡이병 억제효과는 nutrient competition(영양원 경합)에 의한 것으로 판명되었다.
- 3). Pa59-4는 항균활성에 의하여 푸른곰팡이병균을 억제하지 않는 것은 항균활성 검정결과 확인된 바 있고, Pa59-4가 영양원인 마늘주스를 적게 첨가해 주었을 때 푸른곰팡이병균의 포자발아와 균사생장을 현저하게 억제시킨 반면 마늘주스를 많이 첨가해 주었을 때에는 억제효과가 현저하게 저하되었고 길항균 Pa59-4와 함께 접종하였을 때 발아되지 않았던 병원균 포자를 신선한 5% 마늘 쥬스에 접종했을 때에는 다시 잘 발아 되었던(자료생략) 것으로 보아 Pa59-4의 마늘 푸른곰팡이병 억제효과는 nutrient competition(영양원 경합)에 의한 것으로 판명되었다. Poppe 등(2003)은 감귤 푸른곰팡이병에 높은 방제효과를 보이는 P.
- 마늘인편상에서 푸른곰팡이병에 대하여 우수한 억제효과를 보인 4종의 길항균과 2001년도 시험에서 생육촉진효과를 보인 5종의 길항균에 대해서는 세균학적 또는 생화학적 특성을 조사하였다. 균 동정을 위하여 그람염색을 하여 음성과 양성으로 구분한 후 그람음성균은 Biolog GN plate로, 그람양성균은 Biolg GP plate 에 접종하여 영양원(탄소원, 질소원)의 이용성을 조사하여 동정하였는데, 억제효과를 보인 4종의 길항균은 각각 S31-8은 Klebsiella terrigena, S38-9는 Pseudomonas fluorescens, S59-4는 Pantoea agglomerans로 동정되었으며, S5-1은 동정되지 않았다(Table 6). P.
- Calvente 등(1999)에 따르면 사과저장 중 부패를 일으키는 푸른곰팡이병에 억제효과가 우수한 Rhodotorula glutinis는 Rhodotorulic acid라는 siderophore를 생성함으로써 발병을 억제시킨다고 한다. 그러나 본 시험에 공시한 길항균 Pa59-4는 병원균에 대한 영양원 경합능력은 우수하나 대치배양에 의한 항균성 검정시 저지원이 전혀 형성되지 않은 것으로 보아 병원균 균사를 분해할 수 있는 효소를 생산하거나 직접 침입할 수 있는 능력은 없는 것으로 판단된다. Han 등(2000)은 근권에서 유도저항성을 일으키는 능력이 있는 미생물을 간편하고 신속하게 선발하는 방법에 대한 연구 결과를 발표하면서 본 시험에서 공시한 균과 동일한 종인 P.
- agglomerans strain Eh252가 in vitro 조건하에서 화상병균의 생장을 억제하는 두 가지 항생물질을 생산한다고 보고하였다. 그러나 본 시험에서 시험에 공시한 길항균 Pa59-4는 모든 배지 상에서 마늘푸른곰팡이병균에 대한 항균활성을 보이지 않았으므로 푸른곰팡이병균의 생장을 억제하는 항생물질을 생성하지 않는 것으로 판단되었다.
- 선발한 길항균 Pa59-4의 억제기작을 조사하기 위하여 TSA배지 상에서 병원균과 대치 배양하였을 때 항균활성을 보이지 않았다. 길항균 Pa59-4과 병원균간의 영양원 경합여부를 Janisiewicz(2000)의 방법으로 조사한 결과, 저농도로 마늘즙액에 병원균과 길항균 Pa59-4를 함께 처리하였을 때, 길항균 Pa59-4는 병원균의 포자발아 및 균사생장을 현저히 억제하였으며, 길항균 Pa59-4와 함께 접종하였을 때 발아되지 않았던 병원균 포자를 신선한 5% 마늘쥬스에 접종했을 때에는 다시 잘 발아 되는 것으로 나타나 길항균 Pa59-4균주의 억제기작은 영양원 경합에 의한 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때, 길항균 Pa59-4는 마늘저장 중 부패를 줄일 수 있는 유망한 길항균으로 판단되었다.
- 2). 따라서 길항균 Pa59-4는 푸른곰팡이병균에 대하여 항균활성은 없는 것으로 판명되었다. Stockwell 등(2002)에 따르면 사과와 배화상병 방제용으로 사용되는 P.
- 그 원인은 항균활성만을 기준으로 선발할 경우에는 주로 미생물이 내는 항균활성물질에 의해 병원균의 생육이 억제되는 반면에 마늘 인편검정법을 통해서 길항균을 선발할 경우에는 항균활성이 있는 길항균을 포함하여 먹이경합능력이 우수하거나 병 저항성을 유도하는 미생물도 함께 선발할 수 있기 때문이라 생각된다. 병원균에 대한 저지능력이 없으면서 발병을 억제하는 미생물은 먹이경합능력이 우수하거나 병저항성을 유도하는 미생물로 사료되었다.
- 마늘 저장병을 일으키는 푸른곰팡이병을 생물적으로 방제하기 위하여 마늘과 양파 등 파속 채소 근권 또는 근면으로부터 미생물 1,292균주를 분리하였다. 분리한 균주를 대상으로 푸른곰팡이병에 대한 항균성 검정과 마늘인 편검정을 실시하여 최종적으로 푸른곰팡이병 진전을 현저히 억제하는 S59-4균주를 선발하였으며, Biolog system을 이용하여 동정한 결과 Pantoea agglomerans 59-4(Pa59-4)로 동정되었다. 선발한 길항균 Pa59-4의 억제기작을 조사하기 위하여 TSA배지 상에서 병원균과 대치 배양하였을 때 항균활성을 보이지 않았다.
- 선발한 길항균 Pa59-4가 푸른곰팡이병균에 대하여 항균활성을 가지고 있는지 알아보기 위하여 영양원이 풍부한 감자한천배지와 TSA 그리고 TSA를 1/10로 희석한 배지에서 병원균과 Pa59-4를 대치배양을 하여 저지원의 형성여부를 조사한 결과, 선발한 길항균 Pa59-4는 시험에 공시한 배지상에서 모두 저지원을 형성하지 않았다(Fig. 2). 따라서 길항균 Pa59-4는 푸른곰팡이병균에 대하여 항균활성은 없는 것으로 판명되었다.
- 길항균 Pa59-4과 병원균간의 영양원 경합여부를 Janisiewicz(2000)의 방법으로 조사한 결과, 저농도로 마늘즙액에 병원균과 길항균 Pa59-4를 함께 처리하였을 때, 길항균 Pa59-4는 병원균의 포자발아 및 균사생장을 현저히 억제하였으며, 길항균 Pa59-4와 함께 접종하였을 때 발아되지 않았던 병원균 포자를 신선한 5% 마늘쥬스에 접종했을 때에는 다시 잘 발아 되는 것으로 나타나 길항균 Pa59-4균주의 억제기작은 영양원 경합에 의한 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때, 길항균 Pa59-4는 마늘저장 중 부패를 줄일 수 있는 유망한 길항균으로 판단되었다.
- 푸른곰팡이병에 높은 발병억제효과를 보인 99균주 중 마늘에 병원성을 보인 29균주를 제외한 70균주를 가지고 3차에 걸쳐 발병억제효과를 검정한 결과 모든 시험에서 S5-1, S31-8, S38-9 및 S59-4균주가 우수한 효과를 나타냈다(Table 5).
- 2002년에 선발한 158균주 중 89균주는 in vitro 항균성 검정을 통해서, 69균주는 마늘인편검정을 통해서 선발되었다. 항균성 검정을 통하여 선발한 길항균의 항균력을 배지상에서의 저지원 크기별로 구분하였을 때 저지원 직경이 10 mm 이상 되는 균주가 94.4%인 반면(Table 2), 마늘인편검정을 통하여 선발한 길항균은 오직 23.2%만이 10 mm 이상의 저지원을 나타냈을 뿐 76.8%의 길항균은 저지원을 전혀 생성하지 않거나 8 mm 미만의 저지원을 형성하는 것으로 나타났다(Table 3). In vitro 조건에서 푸른곰팡이 병균에 대한 높은 항균성을 보이는 미생물이 in vivo 조건에서는 병 진전억제 효과가 낮은 경우가 매우 많다.
- 이는 마늘이 여러 가지 미생물의 생육을 억제하는 물질을 생성하거나 포함하고 있기 때문에 비록 항균활성이 높은 미생물이라 할지라도 처리한 부위에서 마늘이 내는 물질에 의해 생육이 억제되어 정착할 수 없을 경우 병원균의 생장을 억제하지 못하기 때문이라 사료된다. 항균활성을 기준으로 선발한 균주들은 저지원의 크기가 10.1~13.0 mm인 균주들을 중심으로 정규분포를 하는 반면, 마늘인편상에서 생물검정을 통해 선발한 균주들은 저지능력이 전혀 없거나 매우 낮은 그룹과 저지능력이 매우 높은 그룹으로 이원화 되는 경향을 나타냈다. 그 원인은 항균활성만을 기준으로 선발할 경우에는 주로 미생물이 내는 항균활성물질에 의해 병원균의 생육이 억제되는 반면에 마늘 인편검정법을 통해서 길항균을 선발할 경우에는 항균활성이 있는 길항균을 포함하여 먹이경합능력이 우수하거나 병 저항성을 유도하는 미생물도 함께 선발할 수 있기 때문이라 생각된다.
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