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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 補陽還五湯을 보다 효과적인 뇌졸중 한약제제로 개발하기 위해서 기본 처방에瘀血을 순환시키는 丹蔘․牛膝․桂枝와 뇌신경을 보호하는 것으로 알려진 遠志, 石菖蒲를 첨가하여 加味補陽還五湯(mBHT)을 구성하고 허혈성 뇌졸중 동물 모델(MCAO ischemic rat model)에서 mBHT의 뇌경색 억제 및 뇌신경세포 보호기전에 대한 연구를 수행 하였다.
- 그러나 보양환오탕의 허혈성 뇌졸중 후 유발되는 세포사멸의 억제를 통한 신경보호효과 및 그 작용기전에 대한 연구는 미비한 실정이다. 또한 임상에서 뇌졸중 후에 치매증상이 동반하는 경우가 많이 나타나므로 본 연구에서는 補陽還五湯에 瘀血을 순환시키는 丹蔘․牛膝․桂枝와 뇌신경을 보호하는 것으로 알려진 遠志, 石菖蒲를 추가하여 加味補陽還五湯(modified BHT, mBHT)을 구성하였고 허혈성 뇌졸중(transient middle cerebral artery occulusion ischemic stroke) 동물모델에서 mBHT 의 뇌경색 억제 및 뇌신경세포 보호기전에 대한 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 mBHT의 신경보호효과를 검증하기 위해 신경허혈로 인한 뇌경색의 부피변화를 조사하였으며 중대뇌동맥 폐쇄 후 나타나는 뇌경색이 mBHT 투여에 의해 유의적으로 줄어드는 것을 확인하였다. 또한 mBHT는 뇌허혈로 인한 사망률을 대조군에 비해 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났는데, 이것은 mBHT가 뇌경색을 억제함으로써 생존기간을 연장 시킬 수 있음을 의미한다.
가설 설정
- A : Non-ischemic H, Bax immuno-fluorescence was barely detectable. Vehicle, markedly increased Bax immuno- fluorescence(see inset, double-labeled of Bax, green, and DAPI, blue) was detected throughout the cortex.
- B : The infarct volumes in saline-treated vehicle group and mBHT treated group (n=5, respectively) are expressed as the percentage of hemisphere volumes and are presented as the means±SD.
제안 방법
- Probe는 4-0 nylon surgical thread의 한쪽 끝을 가열하여 구형으로 만든 다음 20～25㎜ 길이로 잘라서 사용하였다. 90분간 결찰(occlusion)한 후 probe를 제거하여 144시간 동안 재관류 (reperfusion)시켰다. 동물이 마취에서 회복된 다음, Bederson 등30)의 방법에 따라 꼬리를 중심으로 들었을 때, 몸의 불균형, 앞발의 좌우모양, 왼쪽 선회 등으로 신경증상을 확인하였다.
- Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 위하여 뇌 조직절편 슬라이드표본을 xylene으로 파라핀을 제거한 다음 순차적인 알코올에 수화시키고 hematoxylin으로 5분간 염색한 후 eosin으로 2분간 염색하였다.
- SD 흰쥐를 80% N2O와 20% O2에 혼합한 1.5% isoflurane으로 흡입하여 마취시키고, 보온패드와 보온램프를 사용하여 체온을 약 37±0.5℃로 유지하면서 중대뇌동맥을 폐색하였다.
- 9% 생리식염수에 녹인 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) 염색약으로 실온에서 10분간 염색하였다. TTC 용액으로 붉게 염색된 뇌 절편을 4% paraformaldehyde 용액으로 고정시킨 후 각 절편의 뒤편 영상을 카메라로 촬영하고 경색면적을 경색을 일으킨 반구의 전체면적에서 염색이 되지 않은 경색면적을 백분율로 나타내어 각 7개의 절편들의 평균을 계산하였다.
- mBHT의 구성약재를 정량하여 총 499g을 세말한 다음, 추출기에 투입하고 물 2L를 사용하여 98℃에서 3시간 동안 추출하였으며 이를 700mmHg, 55℃에서 15시간 감압 건조하여 건조엑스를 수득하였다(yield of 34.8%). mBHT 건조엑스는 밀폐용기에 넣어 -20℃냉동보관하면서 실험직전 1x PBS에 녹여 동물실험을 위한 약물시료로 사용하였다.
- 5% isoflurane으로 흡입마취시킨 다음 뇌를 적출하여 4% paraformaldehyde 용액으로 4℃에서 2～3일간 고정하였다. 고정이 완료된 뇌 조직은 paraffin 용액을 이용하여 블록을 만든 후 microtome을 이용하여 선조체 부위의 위아래 축을 중심으로 7㎛ 두께로 coronal section을 수행하였다. Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 위하여 뇌 조직절편 슬라이드표본을 xylene으로 파라핀을 제거한 다음 순차적인 알코올에 수화시키고 hematoxylin으로 5분간 염색한 후 eosin으로 2분간 염색하였다.
- 뇌경색에 의한 실험동물의 생존율에 대한 mBHT 의 효과를 조사하기 위하여 허혈을 유발시킨 후 5일 동안 mBHT를 경구투여하면서 생존율을 측정하였다.
- 뇌졸중 발병 후 나타나는 뇌경색(infarction)에 대한 mBHT의 감소효과를 조사하기 위하여 90분 중대뇌동맥 폐쇄 후 144시간 재관류한 뇌조직에서 뇌경색의 부피를 측정하였다.
- 대조군은 약물 대신 1 × PBS를 투여하였으며, 실험군은 1 × PBS에 mBHT를 녹여 폐색 24시간 후부터 매 24시간마다 총 5회 경구투여하였다.
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8. 면역조직형광염색
면역조직형광염색(immunofluorescence)을 위해 뇌조직절편 슬라이드표본을 xylene으로 파라핀을 제거하고 순차적인 알코올에 수화시킨 후, 뇌경색에 의한 세포사멸을 확인하기 위해 Bax, Bcl2, Cytochrome C에 대한 단일클론항체와 실온에서 2시간 반응시켰다. 이를 1 × PBS로 3회 세척한 후 Cy3-conjugated donkey anti-mouse IgG 또는 FITC-conjugated donkey antimouse IgG와 실온에서 1시간 반응시켰다.
- 본 연구에서는 허혈성 뇌졸중 흰쥐모델(MCAO)을 이용하여 가미보양환오탕의 뇌경색 억제 및 뇌신경보호 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험동물을 대조군(vehicle)과 실험군(sample group) 으로 나누고, 실험군은 다시 서로 다른 농도(200㎎/㎏)의 mBHT를 경구투여한 군과 양성 대조약물로 항산화제인 Edaravone(1㎎/㎏)을 복강 투여한 군으로 나누었다. 대조군은 약물 대신 1 × PBS를 투여하였으며, 실험군은 1 × PBS에 mBHT를 녹여 폐색 24시간 후부터 매 24시간마다 총 5회 경구투여하였다.
- 이를 1 × PBS로 3회 세척한 후 Cy3-conjugated donkey anti-mouse IgG 또는 FITC-conjugated donkey antimouse IgG와 실온에서 1시간 반응시켰다.
- 이를 다시1 × PBS 용액으로 10분씩 3회 세척한 다음 DAPI가 포함된 mounting 시약으로 봉입하고 cover glass를 씌운 후 형광현미경으로 관찰하였다.
- 중대뇌동맥 폐색 144시간 경과 후 흰쥐를 1.5% isoflurane으로 흡입마취시킨 다음 뇌를 적출하고 뇌주형틀을 이용하여 frontal pole에서 2㎜ 두께로 잘라 7개의 뇌 관측 절편을 만들었으며 0.9% 생리식염수에 녹인 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) 염색약으로 실온에서 10분간 염색하였다. TTC 용액으로 붉게 염색된 뇌 절편을 4% paraformaldehyde 용액으로 고정시킨 후 각 절편의 뒤편 영상을 카메라로 촬영하고 경색면적을 경색을 일으킨 반구의 전체면적에서 염색이 되지 않은 경색면적을 백분율로 나타내어 각 7개의 절편들의 평균을 계산하였다.
- 중대뇌동맥 폐색 24시간 후 mBHT를 200㎎/㎏/ body weight 용량으로 하루에 한 번 총 5회 경구투여 하면서 실험동물의 생존율을 조사하였다
- 5℃로 유지하면서 중대뇌동맥을 폐색하였다. 즉 마취하에서 목의 정중선을 따라 경부를 절개하고 미주신경에 손상을 주지 않도록 주의하면서 좌측 총경동맥(Common carotid artery; CCA), 내경동맥(Internal carotid artery; ICA), 외경동맥(External carotid artery; ECA)을 분리한 다음, 총경동맥과 외경동맥을 결찰하고 내외경동맥의 분지점으로부터 내경동맥 내로 probe를 삽입하고 그 바로 위쪽을 결찰하였다. Probe는 4-0 nylon surgical thread의 한쪽 끝을 가열하여 구형으로 만든 다음 20～25㎜ 길이로 잘라서 사용하였다.
- 허혈에 의해 손상된 뇌 조직에서 mBHT의 신경세포 보호효과를 조사하기 위해서 중대뇌동맥 폐쇄에 의해 허혈을 유발시킨 흰쥐로부터 뇌를 적출하여 H&E 염색을 수행하였다.
- 허혈에 의해 손상된 뇌 조직에서 신경세포사멸(apoptosis)에 대한 mBHT의 억제효과를 조사하기 위하여 세포사멸 조절인자인 Bax, Bcl-2, cytochrome c에 대한 면역형광염색(immunofluorescence)을 수행하였다. 먼저 세포사멸인자인 Bax의 경우 생리식염수를 투여한 군(Vehicle)에서는 정상적인 대뇌피질(Non-Ishchemic H)에 비해 증가되었으며, mBHT와 edaravone을 투여한 군에서는 감소되었다(Fig.
대상 데이터
- 8%). mBHT 건조엑스는 밀폐용기에 넣어 -20℃냉동보관하면서 실험직전 1x PBS에 녹여 동물실험을 위한 약물시료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 가미보양환오탕의 처방은 Table 1과 같은 12가지 한약재로 구성되어 있으며, 구성 한약재는 모두 규격에 적합한 원료성적서가 첨부된 한약재를 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다.
- 실험에 사용되어진 시약은 methanol(Merck Co, Germany), 3-(4,5-dimethy; lthazol-2-yl-2,5-teterazolium bromide ; MTT, Sigma, St Louis, CA, USA), acrylamide solution(BioRad Labolatories Inc, CA, USA), anti-Bax(SantaCruz Co, Ltd, SantaCruz, CA, USA), anti-Bcl2(SantaCruz), anti-Cytochrome c (SantaCruz), X-ray film(Kodak Co, Ltd, Burnaby, British Columbia), ECL solution(PIerce Co, IL, USA), protein assay solution(BioRad Laboratories, Inc, CA, USA) 등이며, 실험에 사용된 기기로는 microplater reader(Asys, Sunnyvale, CA, USA), deepfreezer advantage(Queue, USA), thermal cycler(Bio-Rad Labolatories Inc), orbital shaker(Finemould Precision IN, Co, Gyenggi-do, korea), BioDoc ItTM Imaging System(UVP, Cambridge, UK), UV-VIS Spectrophotometer(Shimazu, Japan), fluorescence microscopy (Olympus Imaging America Inc, Center Valley, PA 18034-0610, USA), luminescence spectrometer(PerkinElmer LS50, USA), heating pad(FHC Inc, ME, USA) 등이다.
데이터처리
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균(mean)±표준오차 (standard error; SE)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 GraphPad Prism program의 Student t-test를 수행하여 p값이 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 1. 가미보양환오탕은 뇌허혈로 인해 증가하는 뇌경색의 부피를 유의적으로 감소시켰다.
- 2. 가미보양환오탕은 허혈성 뇌졸중 흰쥐의 생존율을 유의적으로 증가시켰다.
- 3. 가미보양환오탕은 뇌허혈로 인해 손상된 뇌조직에서 신경세포의 손상은 감소시키고, Bax와 cytochrome c의 발현을 억제하였으며, Bcl-2의 발현은 증가시켰다.
- 그리고 항산화제인 edalavone의 뇌경색 감소효과(17.1±4.15%)보다 우수한 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 4B). 따라서 mBHT의 투여는 허혈에 의한 손상된 뇌 조직에서 세포사멸인자인 Bax와 cytochrome c의 발현은 감소시키고, 항세포사멸인자인 Bcl-2의 발현은 증가시킴으로써 신경세포를 보호하는 것으로 나타났다.
- 따라서 가미보양환오탕은 허혈성 뇌졸중에서 뇌경색 발생을 억제하고 생존율을 증가시키며 신경세포손상을 막음으로써 뇌졸중을 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다.
- 또한 Bax를 발현하는 세포의 수(Bax-positive cells)를 측정한 결과, 정상적인 대뇌피질에서는 1.92±1.10%였으며, 경색이 일어난 부위의 대뇌피질에서는 13.02±3.16%로 증가하였다.
- 본 연구에서는 mBHT의 신경보호효과를 검증하기 위해 신경허혈로 인한 뇌경색의 부피변화를 조사하였으며 중대뇌동맥 폐쇄 후 나타나는 뇌경색이 mBHT 투여에 의해 유의적으로 줄어드는 것을 확인하였다. 또한 mBHT는 뇌허혈로 인한 사망률을 대조군에 비해 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났는데, 이것은 mBHT가 뇌경색을 억제함으로써 생존기간을 연장 시킬 수 있음을 의미한다. 이전 연구에 따르면 보양환오탕은 신경세포사멸을 억제할 수 있으며35), MCAO 에 의해 뇌졸중이 유발된 동물의 뇌손상 부위에서 염증반응을 유발하는 뇌신경교세포(microglia)의 활성을 억제함으로써 대뇌피질 주변부의 지연성 신경세포사멸을 막을 수 있다고 보고되었다36).
- 반면 mBHT와 edaravone을 투여한 군에서는 각각 18.44±8.30%와 8.54±1.86%로 증가하였으며, mBHT 투여군이 edaravone 투여군에 비해 Bcl-2의 발현이 증가된 것으로 나타났다 (Fig. 4B).
- 이전 연구에 따르면 보양환오탕은 신경세포사멸을 억제할 수 있으며35), MCAO 에 의해 뇌졸중이 유발된 동물의 뇌손상 부위에서 염증반응을 유발하는 뇌신경교세포(microglia)의 활성을 억제함으로써 대뇌피질 주변부의 지연성 신경세포사멸을 막을 수 있다고 보고되었다36). 본 연구결과는 mBHT가 허혈성 뇌졸중 환자의 뇌경색을 효과적으로 억제시킴으로써 이를 통해 뇌졸중 환자의 생존기간을 연장할 수 있음을 의미한다.
- 따라서 뇌경색이 발생하면 세포 내 칼슘농도의 변화, pH의 저하, Fas 수용체의 활성화, ROS 생성 등을 통해 Bcl-2의 발현은 억제되는 반면, Bax의 발현이 증가되어 cytochrome c를 mitochondria로부터 유리시키고 caspase 효소들을 활성화하여 세포사멸을 유도하게 된다40). 본 연구에서 mBHT는 허혈과 재관류로 인해 손상된 뇌조직에서 세포사멸 유도분자인 Bax와 cytochrome c 의 발현은 억제하면서, 항세포사멸유도분자인 Bcl-2의 발현은 증가시킴으로써 세포사멸로부터 신경세포를 보호할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 mBHT가 뇌졸중 환자에서 허혈성 손상에 의한 뇌경색의 발생을 줄이고, 세포사멸로부터 신경세포를 보호함으로써 효과적인 뇌졸중 치료제가 될 수 있음을 의미한다.
- 세포사멸인자인 cytochrome c는 생리식염수를 투여한 군(Vehicle)에서는 정상적인 대뇌피질(Non-Ishchemic H)에 비해 증가하였으나, mBHT와 edaravone 투여군에서는 감소되었다(Fig. 6). 즉 cytochrome-C를 발현 하는 세포의 수(cytochrome c-positive cells)를 측정한 결과, 정상적인 대뇌피질에서는 1.
- 정상적인 대뇌피질(non-ischemic hemisphere ; NonIshchemic H)의 경우에는 정상적인 형태의 뇌신경세포와 주위조직이 관찰되는 반면, 경색이 일어난 부위의 대뇌피질군(Vehicle)에서는 세포사멸로 인해 많은 뇌신경세포가 형태를 유지하지 못하고 변형되었으며 주위 조직 역시 치밀하지 못한 모습을 관찰 할 수 있었다. 하지만 mBHT 투여군(mBHT-200)과 edaravone 투여군(Edaravone-1)에서는 뇌신경세포와 주위 조직이 비교적 정상적인 형태를 나타내며 손상된 뇌신경세포의 수가 감소하는 것을 관찰하였다(Fig.
- 즉 Bcl-2를 발현하는 세포의 수(bal-2- positive cells)를 측정한 결과, 정상적인 대뇌피질에서는 18.52±7.99%였으며, 경색이 일어난 부위의 대뇌피질에서는 3.19±3.20%로 감소하였다.
- 즉 cytochrome-C를 발현 하는 세포의 수(cytochrome c-positive cells)를 측정한 결과, 정상적인 대뇌피질에서는 1.20±1.03%였으며, 경색이 일어난 부위의 대뇌피질에서는 18.60±2.91%로 증가하였으나, mBHT와 edaravone 투여군에서는 각각 1.65±0.76%와 2.64±2.61%로 감소되었다(Fig. 4B).
- 항세포사멸인자(anti-apoptotic molecule)인 Bcl-2의 발현은 생리식염수를 투여한 군(Vehicle)에서는 정상적인 대뇌피질(Non-Ishchemic H)에 비해 감소하였으나, mBHT와 edaravone 처리군에서는 증가하였다(Fig. 5). 즉 Bcl-2를 발현하는 세포의 수(bal-2- positive cells)를 측정한 결과, 정상적인 대뇌피질에서는 18.
- 허혈 유발 24시간 후 생리식염수를 투여한 군(Vehicle) 은 허혈에 의한 뇌경색과 혈관손상으로 생존율이 저하되어 144시간 후 생존율이 64.29%로 나타난 반면, mBHT를 투여한 경우에는 85.71%로 생존율이 증가 하였다. 또한 edaravone 투여군(Edaravone-1)에서도 생존율이 92.
- 허혈 유발 24시간 후 생리식염수를 투여한 흰쥐 (Vehicle)의 뇌절편에서는 허혈에 의한 손상으로 뇌경색과 혈관손상이 유발됨으로써 상당부분 TTC 용액에 염색되지 않은 반면(30.3±13.7%), mBHT를 투여한 경우에는 200㎎/㎏ 농도에서 5.8±5.2%로 유의적으로 뇌경색의 부피가 감소하였다(p<0.01).
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