[논문]제마성향정기산과 열다한소탕의 항염증 효능 비교 연구

심은형; 유수성; 이호영

doi:10.6116/kjh.2017.32.4.61.

제마성향정기산과 열다한소탕의 항염증 효능 비교 연구
Anti-inflammatory Effects of Jema-sunghyangjungkisan and Yeoldahanso-tang 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.32 no.4, 2017년, pp.61 - 68

심은형 (한국한의학연구원 한의기반연구부) , 유수성 (한국한의학연구원 한의기반연구부) , 이호영 (한국한의학연구원 한의기반연구부)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Jema-sunghyangjungkisan (JSGS, Jima Xingxiang Zhengqi san) and yeoldahanso-tang (YDHST, Reduo hanshao decoction) are traditional herbal formulas which commonly used to prevent and treat stroke in traditional korean medicine. However, JSGS and YDHST extracts have not been previously reported to have anti-inflammatory effects. Therefore, We measured the anti-inflammatory effects of JSGS and YDHST extracts on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated murine macrophage cell line, RAW 264.7 cells. Methods : To investigate the anti-inflammatory activities of JSGS and YDHST extracts, tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$), interleukin (IL)-6, nitric oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) were examined in RAW 264.7 cells with LPS of $1{\mu}g/m{\ell}$. Results : JSGS and YDHST extracts did not have any cytotoxicity in RAW 264.7 cells. $TNF-{\alpha}$ concentration decreased 49.67% at $500{\mu}g/m{\ell}$ by JSGS but, YDHST has no statistically significant effect at all concentration. IL-6 accumulation on JSGS and YDHST extracts in LPS-stimulated RAW 264.7 cells reduced 22.03% and 41.44% at $500{\mu}g/m{\ell}$ respectively. In addition, JSGS has no inhibitory effects on NO accumulation and YDHST reduced 10.08% at $500{\mu}g/m{\ell}$. Moreover, JSGS and YDHST treatment does-dependently reduced the $PGE_2$ production. In particular, YDHST ($500{\mu}g/m{\ell}$) extract was more effective compared with $10ng/m{\ell}$ of indomethacin which is the $PGE_2$ positive control. Conclusions : Our results suggest that treatment of JSGS and YDHST extracts decreased the LPS-stimulated inflammation. Therefore, in the present study, we demonstrated that JSGS and YDHS may be used as a potential anti-inflammatory therapeutic agent.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

또한, 습담은 서양의학적으로 대사성질환과 연관성이 높고, 혈관 및 조직의 염증반응을 야기한다고 알려져 있다²⁸⁾. 본 연구에서는 변증 습담 처방인 제마성향정기산과 열다한소탕에 대한 항염증 효과를 확인하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW 264.7를 LPS로 유도하여 염증반응을 유발시킨 in vitro 모델에서 염증매개인자들의 억제효과에 각 처방이 미치는 영향을 비교하고자 하였다.

제안 방법

LPS로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포에 제마성향정기산과 열다한소탕을 농도별로 처리하고 양성대조군으로 indomethacin을 1.25, 2.5, 5 및 10 ng/㎖의 농도로 처리하여 배양한 후 상층액을 이용하여 PGE₂ 생성량을 확인하였다. 실험결과, 정상군 (0.
RAW 264.7 세포를 2.5 × 105 cells/well의 밀도로 48 well plate에 분주한 후 세포가 confluent한 상태가 되었을 때 LPS (1 ㎍/㎖)와 함께 처방을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하고 배양 상층액 내에 분비되는 염증성 사이토카인； TNF-α및 IL-6과 염증매개인자； NO 및 PGE2의 분비량을 측정하였다.
RAW 264.7 세포에 LPS를 이용하여 염증반응을 유도하고 각 처방을 농도별로 처리하여 처방이 TNF-α및 IL-6의 생성량에 미치는 영향을 확인하였다.
RAW 264.7세포를 3 × 103 cells/well의 밀도로 96 well plate에 분주한 후 세포가 confluent한 상태가 되었을 때 각각의 처방을 농도별 (0, 10, 20, 50, 100, 200, 500 or 1,000 ㎍/㎖)로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
TNF-α및 IL-6 생성량 측정은 ELISA kit를 사용하여 제조사의 수행방법에 따라 측정하였으며 NO 생성량을 측정하기 위하여 Griess reagent를 이용하였으며 nitric oxide synthase inhibitor인 L-NMMA를 양성대조군으로 사용하였다.
실험에 사용된 약재는 옴니허브 (Daegu, Korea)에서 구입하여 전문가 감별 후 사용하였다 (Table 1). 각 처방에 따라 약재를 배합한 후 약재 무게의 10배에 해당하는 증류수를 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 무압환류추출법 (COSMOS60, Kyungseo Machine CO. Incheon, Korea)을 통하여 추출하였고, 추출액은 sieve을 사용하여 필터링 한 후, 동결건조(PVTFD-100, ilShin BioBase, Daegu, Korea )하여 -70℃에서 보관하였다.
따라서 본 연구에서는 습담 치료에 공통적으로 사용되는 제마성향정기산과 열다한소탕에 대해 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 이용하여 TNF-α, IL-6, NO 및 PGE2 등 염증성 사이토카인 및 염증매개인자의 생성량을 확인함으로써 각 처방에 대한 항염증 효과에 대해 비교 분석하였다.
마우스 대식세포 RAW 264.7에 LPS를 첨가하여 염증반응을 유도하였다. 양성대조군으로 사용한 L-NMMA는 25, 50, 100 및 200 µM의 농도로 처리하고 제마성향정기산과 열다한 소탕을 농도별로 처리한 후 NO 생성량을 측정하였다.
마우스 대식세포주인 RAW 264.7을 이용하여 습담 처방으로 사용되는 제마성향정기산과 열다한소탕에 대한 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
7세포를 3 × 10³ cells/well의 밀도로 96 well plate에 분주한 후 세포가 confluent한 상태가 되었을 때 각각의 처방을 농도별 (0, 10, 20, 50, 100, 200, 500 or 1,000 ㎍/㎖)로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 세포에 CCK-8 용액을 첨가하여 37℃, 5% (v/v) CO₂ 조건에서 4시간 동안 배양한 후, microplate reader (Benchmark Plus, BIO-RAD, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통하여 상대적 세포생존율 (% of control)을 계산하였다. 본 실험은 세포독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 진행하였다.
배양이 완료된 세포에 CCK-8 용액을 첨가하여 37℃, 5% (v/v) CO₂ 조건에서 4시간 동안 배양한 후, microplate reader (Benchmark Plus, BIO-RAD, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통하여 상대적 세포생존율 (% of control)을 계산하였다. 본 실험은 세포독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 진행하였다.
TNF-α및 IL-6 생성량 측정은 ELISA kit를 사용하여 제조사의 수행방법에 따라 측정하였으며 NO 생성량을 측정하기 위하여 Griess reagent를 이용하였으며 nitric oxide synthase inhibitor인 L-NMMA를 양성대조군으로 사용하였다. 상층액 내 존재하는 PGE₂ 생성량을 측정하기 위해서 PGE₂ ELISA kit를 사용하였으며 양성대조군으로 indomethacin을 사용하였다.
양성대조군으로 사용한 L-NMMA는 25, 50, 100 및 200 µM의 농도로 처리하고 제마성향정기산과 열다한 소탕을 농도별로 처리한 후 NO 생성량을 측정하였다.
1). 이상의 결과를 바탕으로 세포독성이 나타나지 않는 62.5, 125, 250 및 500 ㎍/㎖의 농도로 실험조건을 설정하여 각 처방에 대한 효능을 확인하였다.

대상 데이터

Lipopolysaccharide (LPS), NG-methyl-L-arginine (LMMA), indomethacin은 Sigma-Aldrich (MO, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용한 Cell counting kit-8 (CCK-8)은 Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)에서, Griess reagent는 Promega Corporation (Madison, WI, USA)에서, PGE₂ ELISA kit는 Amershame (UK)에서, TNF-α및 IL-6 ELISA kit은 Invitrogen Co.(Camarillo, CA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
Dulbeco’s modified eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (P&S), Dulbeco’s phosphate-buffered saline (DPBS), trypsinDTA는 Gibco BRL (NY, USA)에서 구입하였다.
마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고 5.5% FBS와 1% P&S가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
실험에 사용된 약재는 옴니허브 (Daegu, Korea)에서 구입하여 전문가 감별 후 사용하였다 (Table 1). 각 처방에 따라 약재를 배합한 후 약재 무게의 10배에 해당하는 증류수를 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 무압환류추출법 (COSMOS60, Kyungseo Machine CO.

데이터처리

각 실험결과는 SYSTAT ver. 13.0 (SPSS Inc. USA)을 이용하여 분석하였으며, 평균 (mean) ± 평균오차 (SEM)로 표기하였다.
각 실험결과의 유의성 검증은 일원배치분산분석으로 비교한 후, Bonferroni multiple comparison method을 이용하여 p<0.05의 유의수준에서 검증하였다.

이론/모형

각 처방에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 CCK-8 assay를 진행하였다. RAW 264.

성능/효과

1. 제마성향정기산 및 열다한소탕은 1000 ㎍/㎖까지 세포독성이 나타나지 않았다.
2. 제마성향정기산은 500 ㎍/㎖에서 49.67% 만큼 TNFα를 억제하였고 열다한소탕은 모든 농도에서 통계적 유의성이 나타나지 않았다.
3. 각 처방에 대한 IL-6 생성량은 제마성향정기산은 500㎍/㎖에서 22.03%, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖에서 41.44%만큼 감소하는 것을 확인하였다.
4. 두 처방이 NO 생성량에 미치는 영향을 확인한 결과, 제마성향정기산은 실험에 사용한 모든 농도에서 통계적 유의성을 확인할 수 없었으며, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖에서 10.08% 억제효과가 있는 것을 확인하였다.
5. 두 처방의 PGE₂ 생성 억제효과는 제마성향정기산과 비교하여 열다한소탕이 우수하며 특히, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖에서 양성대조군인 indomethacin (10 ng/㎖) 보다 PGE₂ 억제효과가 뛰어났다.
IL-6 생성량은 정상군 (0.28±0.28 ng/㎖)과 비교하여 LPS 유도군에서 약 150배 (41.51±0.42 ng/㎖) 증가하는 것을 확인하였다.
각 처방에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 CCK-8 assay를 진행하였다. RAW 264.7 세포에 각 처방을 농도별 (0, 10, 20, 50, 100, 200, 500 and 1000 ㎍/㎖)로 처리한 결과, 실험에 사용한 최고농도 (1000 ㎍/㎖)까지 세포독성이 없음을 확인하였다 (Fig. 1). 이상의 결과를 바탕으로 세포독성이 나타나지 않는 62.
08% 감소 시켰다. 각 처방에 대한 PGE₂ 분비억제 효과를 확인한 결과, 두 처방 모두 농도의존적으로 PGE₂ 억제에 효과가 있는 것으로 나타났으며 500 ㎍/㎖에서 제마성향정기산 (40.85%), 열다한소탕 (99.51%)로 PGE₂ 생성 억제에 효과가 있었다. 두 처방의 PGE₂ 생성량 억제에 대한 활성을 비교 하였을 때 제마성향정기산과 비교하여 열다한소탕이 PGE₂ 억제 효과가 우수하고 특히, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖ 농도에서 양성대조군인 indomethacin (10ng/mL) 보다 PGE₂ 억제 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
그러나, 제마성향정기산은 모든 농도에서 통계적 유의성이 나타나지 않았으며, 열다한소탕는 500 ㎍/㎖에서 NO 생성량이 10.08%(71.19±1.80 µM)가 감소하고 (p<0.05), 다른 농도에서는 통계적 유의성이 없음을 확인하였다 (Fig. 3).
두 처방의 IL-6 억제효과는 제마성향정기산은 500 ㎍/㎖에서 22.03% 감소하고 (p<0.05), 다른 농도에서는 통계적 유의성이 없었으며 열다한소탕은 500 ㎍/㎖에서 41.44% 감소하고 (p<0.01), 모든 농도에서 통계적으로 유의하게 IL-6 생성량이 감소하는 것을 확인하였다.
51%)로 PGE₂ 생성 억제에 효과가 있었다. 두 처방의 PGE₂ 생성량 억제에 대한 활성을 비교 하였을 때 제마성향정기산과 비교하여 열다한소탕이 PGE₂ 억제 효과가 우수하고 특히, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖ 농도에서 양성대조군인 indomethacin (10ng/mL) 보다 PGE₂ 억제 효과가 뛰어난 것으로 나타났다. 이러한 결과는 습담 처방으로 사용되는 제마성향정기산과 열다한소탕이 COX-2 발현 및 활성수준을 조절함으로써 PGE₂ 생성을 억제하는 것으로 예상된다.
특히, 염증반응에서 즉각적으로 발현이 증가하는 COX-2에 의한 PGE₂ 생성은 면역세포의 활성을 유도하고 염증반응을 촉진시키는 TNF-α및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인을 생성하여 종양생성 및 염증반응을 유도한다^39-41). 본 연구에서 각 처방에 대한 NO 및 PGE₂ 분비억제 효과를 확인한 결과, NO 억제효과는 제마성향정기산은 모든 농도에서 통계적 유의성이 나타나지 않았고, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖에서 NO 생성량을 10.08% 감소 시켰다. 각 처방에 대한 PGE₂ 분비억제 효과를 확인한 결과, 두 처방 모두 농도의존적으로 PGE₂ 억제에 효과가 있는 것으로 나타났으며 500 ㎍/㎖에서 제마성향정기산 (40.
본 연구에서 각 처방이 염증성 사이토카인의 분비 억제에 미치는 효과를 확인한 결과, TNF-α생성량은 제마성향정기산의 경우 500 ㎍/㎖에서 49.67% 감소하는 것을 확인하였으며 (p<0.05), 나머지 농도에서는 통계적 유의성이 없었다.
실험결과, TNF-α는 정상군(1.93±0.37 ng/㎖)과 비교하여 LPS를 처리한 유도군에서 약 6.5배 (12.59±1.19 ng/㎖) 증가하였다.
실험결과, 정상군 (0.00±0.14 µM)과 비교하여 LPS를 처리한 유도 군의 NO 생성량이 약 80배 (80.17±0.67 µM)가 증가함을 확인하였다.
실험결과, 정상군 (0.20±0.02 ng/㎖)과 비교하여 LPS를 처리한 유도군은 PGE2 생성량이 약 55배 (10.91±0.71 ng/㎖) 증가함을 확인하였다.
양성대조군인 indomethacin은 10 ng/㎖ 에서 PGE2 생성량을 약 83% (2.04±0.34 ng/㎖) 억제하였고 실험에 사용한 모든 농도에서 PGE2 생성량을 농도의존적으로 감소하였다 (p<0.01).
두 처방의 PGE₂ 생성량 억제에 대한 활성을 비교 하였을 때 제마성향정기산과 비교하여 열다한소탕이 PGE₂ 억제 효과가 우수하고 특히, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖ 농도에서 양성대조군인 indomethacin (10ng/mL) 보다 PGE₂ 억제 효과가 뛰어난 것으로 나타났다. 이러한 결과는 습담 처방으로 사용되는 제마성향정기산과 열다한소탕이 COX-2 발현 및 활성수준을 조절함으로써 PGE₂ 생성을 억제하는 것으로 예상된다.
이상의 결과를 종합하여 두 처방이 염증성 사이토카인, NO 및 PGE₂ 생성억제에 일부 효과가 있음을 확인하였고, 제마성향정기산과 비교하여 열다한소탕이 항염증 효과가 우수한 것으로 나타났다. 이는 기존에 사용되는 습담치료 뿐만 아니라 염증성 질환 치료제로써의 응용연구를 제고할 수 있으며 추후, 각 처방에 대한 항염증 효과의 작용기전에 대한 연구 및 유효성분에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
제마성향정기산은 500 ㎍/㎖에서 22.03%(32.43±3.80 ng/㎖)가 감소하고 (p<0.05), 다른 농도에서는 통계적 유의성이 없었으며, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖에서 41.44% (24.43±1.39 ng/㎖)가 감소하고 (p<0.01), 모든 농도에서 통계적 유의성이 있었다 (Fig. 2B).
제마성향정기산은 500 ㎍/㎖에서 40.85%(6.54±0.28 ng/㎖), 열다한소탕는 500 ㎍/㎖에서 99.51%(0.25±0.04 ng/㎖)로 PGE2 생성을 억제하였으며 (p<0.01), 두 처방의 IC50는 제마성향정기산은 686.46 ㎍/㎖, 열다한소탕은 110 ㎍/㎖로 열다한소탕이 제마성향정기산보다 PGE2 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
01), 모든 농도에서 통계적으로 유의하게 IL-6 생성량이 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 500 ㎍/㎖에서 두 처방의 IL-6 억제효과는 열다한소탕이 우수한 것으로 나타났다.
46 ㎍/㎖, 열다한소탕은 110 ㎍/㎖로 열다한소탕이 제마성향정기산보다 PGE₂ 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 특히, 열다한소탕은 500 ㎍/㎖ 농도에서 양성대조군으로 사용한 indomethacin (10 ng/㎖)보다 PGE₂ 생성 억제효과가 우수했다 (Fig. 4).

후속연구

생성억제에 일부 효과가 있음을 확인하였고, 제마성향정기산과 비교하여 열다한소탕이 항염증 효과가 우수한 것으로 나타났다. 이는 기존에 사용되는 습담치료 뿐만 아니라 염증성 질환 치료제로써의 응용연구를 제고할 수 있으며 추후, 각 처방에 대한 항염증 효과의 작용기전에 대한 연구 및 유효성분에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	생체 보호를 위한 방어기작인 염증반응이 진행되면 어떤 변화가 생기는가?	염증반응은 생체의 세포 및 조직이 물리적, 화학적 원인 등에 의해 손상되거나 외부에서 침입한 감염원에 의한 손상으로부터 생체를 보호하기 위한 방어기작이다.15,16) 염증반응이 진행되면 선천성 면역 (innate immunity)이나 획득성 면역 (adaptive immunity) 등을 매개로 하여 생체 내 대식세포가 활성화 되고 inducible nitric oxide synthase (iNOS)에 의해서 생성되는 nitric oxide (NO) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해서 생성되는 prostaglandin E2 (PGE2)와 같은 염증매개인자와 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin (IL)-6 및 interleukin (IL)-1β와 같은 염증성 사이토카인 (cytokines)을 분비한다17-19). 외부자극에 의해 염증반응이 일어나면 생체 내 염증관련인자들이 과잉생성 되고, 발적, 발열, 동통 등의 임상증상을 동반하게 되며 세균성패혈증, 류마티스성 관절염, 죽상동맥경화증, 자가면역질환과 같은 다양한 질환을 야기한다20-22).
	뇌혈관질환이란?	제마성향정기산 (濟馬星香正氣散, Jemaunghyangjungkisan, Jima Xingxiang Zhengqi san)은 성향정기산 (星香正氣散, Sunghyangjungkisan, Xingxiang Zhengqi san)에 창출 (蒼朮), 청피 (靑皮), 육계 (肉桂), 건강(乾薑), 익지인 (益智仁)을 가미한 처방으로 중풍 초기 구급처방에 사용되며1) 혈관 이완효과2), 대뇌피질 뇌경색 경계부위 감소효과3)에 대한 연구보고가 있고, 열다한소탕 (熱多寒小湯, Yeoldahanso-tang, Reduo hanshao decoction)은 태음인의중풍 및 성인병 예방과 치료에 사용되는 처방으로 당뇨성 중풍4), 혈관 염증5), 간 보호 효과6), 알러지성 접촉피부염에서의 효과7), 아토피 피부염 환자에 대한 임상연구8)가 보고되어 있다. 제마성향정기산과 열다한소탕은 공통적으로 뇌혈관질환 (중풍, stroke)의 예방 및 치료에 사용되는 처방으로, 뇌혈관질환은 뇌로 가는 혈류의 흐름이 원활하지 않아 뇌 조작이 손상되는 경우를 말한다.
	제마성향정기산과 열다한소탕은 어떤 처방에 쓰이는가?	제마성향정기산 (濟馬星香正氣散, Jemaunghyangjungkisan, Jima Xingxiang Zhengqi san)은 성향정기산 (星香正氣散, Sunghyangjungkisan, Xingxiang Zhengqi san)에 창출 (蒼朮), 청피 (靑皮), 육계 (肉桂), 건강(乾薑), 익지인 (益智仁)을 가미한 처방으로 중풍 초기 구급처방에 사용되며1) 혈관 이완효과2), 대뇌피질 뇌경색 경계부위 감소효과3)에 대한 연구보고가 있고, 열다한소탕 (熱多寒小湯, Yeoldahanso-tang, Reduo hanshao decoction)은 태음인의중풍 및 성인병 예방과 치료에 사용되는 처방으로 당뇨성 중풍4), 혈관 염증5), 간 보호 효과6), 알러지성 접촉피부염에서의 효과7), 아토피 피부염 환자에 대한 임상연구8)가 보고되어 있다. 제마성향정기산과 열다한소탕은 공통적으로 뇌혈관질환 (중풍, stroke)의 예방 및 치료에 사용되는 처방으로, 뇌혈관질환은 뇌로 가는 혈류의 흐름이 원활하지 않아 뇌 조작이 손상되는 경우를 말한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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