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문제 정의
- 본 연구는 蚯蚓藥鍼이 비만을 유발시킨 SpragueDawely계 rat의 혈장과 간장의 지질 및 지질과산화물, 항산화계 효소, 전염증성 cytokines 등에 미치는영향을 통하여 비만에 대한 蚯蚓藥鍼의 효과를 알아보고자 실시하였으며 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구는 비만의 예방과 치료를 위하여 고지방식이로 비만을 유도한 Sprague-Dawely계 rat를 대상으로 中脘(CV12)10), 足三里(ST36)10)에 蚯蚓藥鍼을 시술하고 이에 따른 지질강하 효과, 항산화 효과 및 전염 증성 cytokines 농도에 미치는 영향 등을 조사하여 약간의 지견을 얻었으므로 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 가열한 시험관을 흐르는 수돗물에서 냉각시키고 증류수 1㎖와 n-butanol : pyridine (15 : 1, v/v)의 혼합용액 5.0㎖를 가한 후 voltex하였으며 1,500×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액(nbutanol : pyridine층)을 채취하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 간장 CAT의 활성을 측정하기 위하여 간장 0.2g을 20배의 25mM KH2PO4-NaOH buffer(pH 7.0)에 넣어 균질화시키고 이 homogenate를 같은 buffer로 60배 희석한 후 ice bath 상태에서 ultrasonicator(Heat System Ultrasonics. Inc, Ultrasonic Processor W-385)로 15초씩 2회 반복하여 이 시료를 spectrophotometer(550nm)에서 흡광도를 측정한 후 formaldehyde를 표준용액으로 하여 얻은 표준곡선으로부터 활성을 계산하였다14).
- 간장 TBARS량은 1～2g의 간장절편을 0.9%의 생리식염수로 세척하여 혈액을 제거하고 1.15% KCl 수용액과 혼합한 후 homogenizer로 충분히 마쇄하여 10% homogenate를 만들었다.
- 대조군을 제외한 약침 처리군들은 4주 동안, 격일로 오후 7시에 각 처리군별로 자침을 실시하였으며, 약침 처리 시의 스트레스를 줄이기 위해 1.5m의 합판에 10개의 보정축을 설치한 보정틀을 제작, 이용하였다. 취혈은 인체의 中脘(CV12)10) 및 足三里(ST36)10)에 상응하는 부위를 WHO의 표준경혈정위법11)의 방법에 준하여 laser dector(Akuplas MFL, MBB, Germany)를 이용하여 취혈했고 약침액은 1ml 용량의 1회용 주사기를 사용하여 각 혈위에 0.
- 본 실험에서는 ferricytochrome C의 환원이 방해되는 정도를 550nm에서 30초 간격으로 3분간 비색정량한 후 ferricytochrome C의 환원을 50% 방해하는 SOD의 양을 1unit로 하여 분당 활성정도를 나타내었다.
- 비만의 근본 원인이 膏粱厚味의 섭식이나 소화기계통의 문제임에 착안하여 健脾和胃하고 中氣를 돕는 穴性을 가진 두 穴을 선택하였으며 각 穴의 효능을 알아보기 위하여 蚯蚓藥鍼 처리군을 中脘약침군 (TⅠ), 足三里약침군(T Ⅱ), 中脘－足三里약침군(T Ⅲ)의 세 군으로 나누었다.
- 시중에서 구입하여 정선한 100g의 蚯蚓 분말을 둥근 flask에 2ℓ의 증류수와 함께 넣어 수증기 증류법으로 1,600㎖의 증류액을 만든 후 냉각, 여과하고 이여액을 100㎖가 되게 감압, 농축하여 pH 7.0으로 조정한 후 냉장 보관했다.
- 식이급여는 실험기간 4주 동안 전 처리군에 동일하게 기본식이(Table 1)를 급여하였고 급여량은 각 처리군간에 섭취량의 차이가 5% 이내가 되도록 균등 급여하였으며 물은 자유 급여하였다.
- 일정량의 간장절편을 생리식염수로 세척하여 혈액을 제거시킨 후, 0.15M KCl 수용액과 함께 homogenizer로 20%의 homogenate가 되도록 마쇄하여 9,000 × g에서 15분간 원심분리하였고 이 상층액을 다시 15,000 × g에서 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 단백질의 함량이 100～200㎍이 되도록 취하여 분석에 사용하였다.
- 전염증성 cytokines 농도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 혈장과 간장의 IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10 농도 변화를 측정하였다.
- 지질강하능을 알아보기 위해 혈장 FFA, TG, total cholesterol, HDL-C, LDL-C와 간장 total cholesterol, TG 농도의 변화를 측정하였다.
- 채혈은 실험종료일에 12시간 절식시킨 후 심장천자법에 의해 약 7㎖를 채취하고 혈액을 분석항목별로 나누어 각각의 시료로 사용하였다. 간장은 채혈을 마친 후, 적출하여 각각의 분석항목별 처리방법으로 처리하여 -80℃에 냉동 보관하였다.
- 평균체중이 183.71±5.69g인 Sprague-Dawely계 雄性 rat 50頭에 고지방식이(Table 1)를 8주간 급여한 후, 체중이 400～450g인 40頭를 선발해 대조군(Control), 처리 1군(T Ⅰ; Lumbricus Jungwan (CV12) pharmacopuncture), 처리 2군(T Ⅱ; Lumbricus Joksamni (ST36) pharmacopuncture) 및 처리 3군(T Ⅲ; Lumbricus Jungwan (CV12) and Joksamni (ST36) pharmacopuncture)으로 나누어 각 처리군 당 10頭씩 임의로배치했다.
- 항산화능을 알아보기 위하여 혈장과 간장의 TBARS 농도와 항산화계 효소인 SOD, CAT, GSH-Px의 활성도 변화를 측정하였다.
- 혈장 triglyceride(TG), total cholesterol, LDL-cholesterol (LDL-C) 및 HDL-cholesterol(HDL-C)량은 혈액자동 분석기(Boehringer Manheim, 독일)에 의해 분석하였다.
대상 데이터
- Cytokines(IL-1β, TNFα, IL-6, IL-10)의 정량은 시판 kit(Biosource International, USA)를 이용하였으며 이중 TNF-α의 최저 측정농도는 0.7pg/㎖였고 다른 cytokine들은 3～8pg/㎖ 였다.
- 본 연구에서는 역대 의가의 비만치료법 중에서 活血化瘀法에 착안하여 항혈전 작용과 지질강하 능력이있는 蚯蚓을 약침의 재료로 선택하였다.
- 0㎖를 가한 후 voltex하였으며 1,500×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액(nbutanol : pyridine층)을 채취하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 TMP(1,1,3,3-tetra-amitoxypropane)를 사용하였고, lipid peroxide 수준은 nmol MDA(malondialdehyde)로 표시하였다.
데이터처리
- 실험결과는 SPSS package(17.0)를 이용하여 one-way ANOVA를 수행하였고 다중비교는 Duncan’s multiple range test를 수행하였으며 p-value는 0.05 이하를 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
- 간장 GSH-Px의 활성은 Levander 등15)의 방법에 준하여 분석하였다. 일정량의 간장절편을 생리식염수로 세척하여 혈액을 제거시킨 후, 0.
- 간장 SOD의 측정은 xanthine oxidase에 의해 superoxide를 생성하고, 이 superoxide가 ferricytochrome C(Fe3+)를 ferrouscytochrome C(Fe2+)로 환원시키는데 이때 SOD가 존재하면 SOD가 superoxide와 경쟁하여 cytochrome C의 환원속도가 감소되는 원리를 이용한 Flohe 등13)의 방법으로 측정하였다.
- 5m의 합판에 10개의 보정축을 설치한 보정틀을 제작, 이용하였다. 취혈은 인체의 中脘(CV12)10) 및 足三里(ST36)10)에 상응하는 부위를 WHO의 표준경혈정위법11)의 방법에 준하여 laser dector(Akuplas MFL, MBB, Germany)를 이용하여 취혈했고 약침액은 1ml 용량의 1회용 주사기를 사용하여 각 혈위에 0.1ml를 주입하였다.
- 혈장 TBARS량은 혈장을 분리하여 37℃에서 120분 동안 배양한 후 Buege와 Aust12)의 방법에 의해 정량했다.
- 혈장 free fatty acid(FFA) 함량은 V-NEFA kit(日 水製藥, 일본)를 이용한 효소법에 의해서 측정하였다. 간장 total cholesterol 및 TG량은 정량용 kit(Wako Co, 일본)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 1. 지질강하능의 평가는 蚯蚓藥鍼 처리군 중 혈장 FFA, TG, total cholesterol, LDL-C와 간장 total cholesterol, TG의 항목에서 각각 통계적으로 유의한 농도저하를 나타내었다.
- 원심분리 시의 온도는 4℃를 유지하여 조제한 시료를 stock solution(K buffer, 40mM glutathione, KH buffer, ㎖당 1unit의 glutathione reductase)에 넣어 37℃에서 10분간 항온시킨 후, 20mM NADPH를 첨가하여 다시 2분 동안 방치시켰다. 15mM t-butyl hydroperoxide를 가한 후 340nm에서 1분간 흡광도가 감소하는 속도를 측정하였고 GSH-Px 활성도의 unit는 mg protein당 1분 동안 NADPH가 NADH로 산화되는 nmol 수로 나타났다.
- 2. 항산화능의 평가는 蚯蚓藥鍼 처리군 중 혈장과간장 TBARS 항목에서 통계적으로 유의한 농도저하가 나타났고 항산화계 효소인 SOD와 CAT 의 활성도에서 통계적으로 유의한 상승을 나타내었다.
- 3. 전염증성 cytokines 농도의 평가는 蚯蚓藥鍼 처리군 중 혈장 IL-1β, IL-6, TNF-α와 간장 IL-6 의 항목에서 통계적으로 유의한 농도저하를, 혈장 IL-10에서 유의한 농도상승이 나타났다.
- SOD의 활성도는 中脘 약침군(TⅠ)과 中脘－足三 里약침군(T Ⅲ)에서 통계적으로 유의성 있는 상승을 나타내었다. CAT의 활성도는 蚯蚓藥鍼 처리군(TⅠ, T Ⅱ, T Ⅲ) 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의한 상승이 나타났으며, 세 군(TⅠ, T Ⅱ, T Ⅲ) 들 사이의 유의한 차이는 없었다. 간장 항산화계 효소중에서 GSH-Px는 전 처리군 모두 통계적으로 유의성 있는 변화가 나타나지 않았다(Table 6).
- 혈장 total cholesterol의 농도는 中脘약침군(TⅠ)과 中脘－足三里약침군(T Ⅲ)에서 대조군에 비해 유의성 있게 하락하였고 HDL-C 농도의 변화는 전 처리군에서 통계적 유의성이 없었다. LDL-C의 농도는 蚯蚓藥 鍼 처리군(T I, T Ⅱ, T Ⅲ) 모두가 대조군에 비해서 유의성 있게 하락하였으며, 그 중에서 中脘一足三里약침군(T Ⅲ)의 농도 변화가 가장 두드러졌다 (Table 3).
- 혈장 FFA의 농도는 蚯蚓藥鍼 처리군이 대조군보다 낮은 경향을 나타내었다. 蚯蚓藥鍼 처리군(T Ⅰ, T Ⅱ, T Ⅲ) 모두에서 통계적으로 유의한 변화가 있었는데 특히 中脘약침군(TⅠ)의 경우 하락폭이 컸다. TG의 농도는 中脘약침군(T Ⅰ)과 中脘一足三里약침군(T Ⅲ)에서 통계적으로 유의하게 저하되었다 (Table 2).
- 간장 cytokines의 농도는 IL-1β, TNF-α, IL-10의경우 전 처리군에서 통계적으로 유의성 있는 변화가 없었고 IL-6의 경우에는 모든 蚯蚓藥鍼 처리군(TⅠ, T Ⅱ, T Ⅲ)에서 전반적인 농도 저하가 있었으나 中脘 약침군(TⅠ)에서만 통계적으로 유의한 수치가 나타났다(Table 8).
- 간장 total cholesterol의 농도는 모든 蚯蚓藥鍼 처리군(TⅠ, T Ⅱ, T Ⅲ)에서 대조군보다 낮은 경향이 나타났지만 足三里 약침군(T Ⅱ)의 경우는 통계적인 유의성이 없었다. 간장 TG의 농도는 蚯蚓藥鍼 처리군 (TⅠ, T Ⅱ, T Ⅲ) 모두 통계적으로 유의성 있게 하락하였으며, 각 처리군(TⅠ, T Ⅱ, T Ⅲ)들 사이에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다(Table 4).
- 또한 간장 cytokines의 농도는 IL-1β, TNF-α, IL-10의 경우 전 처리군에서 통계적으로 유의성 있는 변화가 없었고 IL-6의 경우에는 中脘약침군에서 유의한 농도저하를 나타내었다(Table 8).
- 또한 간장 total cholesterol 농도는 中脘약침군과 中脘－足三里약침군에서 대조군에 비해 유의성 있게 하락하였고 간장 TG의 농도는 蚯蚓藥鍼 처리군 모두 유의성 있게 하락하였다(Table 4).
- 를 다시 물로 환원시켜 주는 CAT를 모두 활성화시켜줌을 의미한다. 또한 앞의 혈장과 간장의 TBARS 항목과 연계하여 생각해 볼 때, 蚯蚓藥鍼 시술이 지질의 과산화 반응 억제와 항산화계 효소의 활성이라는 두가지 방면 모두에 효과가 있음을 알 수 있었다. 다만 GSH-Px에 대한 효과는 나타나지 않았다.
- 본 실험에서 검증된 IL-6, TNF-α는 지방세포가분비하는 adipokine으로서 비만으로 파생되는 염증성 질환의 지표로 사용될 수 있으며 IL-1β와 IL-10 역시염증반응의 활성화와 억제에 있어서 중요한 지표가 되므로 이는 蚯蚓藥鍼의 시술이 비만과 관련된 신체의 염증에 일정한 효과가 있음을 시사하는 것이며 나아가 비만성 질환인 제2형 당뇨병, 동맥경화 등의 예방에도 일정한 가능성을 짐작케 한다.
- 본 실험에서 혈장 FFA의 농도는 蚯蚓藥鍼 처리군모두에서 통계적으로 유의한 변화가 있었고 TG의 농도는 中脘약침군과 中脘－足三里약침군의 경우에서 유의한 변화가 있었다(Table 2). 혈장 FFA와 TG는 지방의 직접적인 공급원이자 인체의 에너지원으로서중요한 의미를 갖고 있으며 비만이 심할수록 증가되는 경향이 있으므로 이러한 실험 결과는 비만의 치료에 있어서 중요한 의미를 가질 것이다.
- 본 실험의 결과 혈장 cytokines 중에서는 IL-1β, IL-6, TNF-α의 경우 모든 蚯蚓藥鍼 처리군에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 농도가 저하하였으며 IL-10의 경우 中脘약침군에서만 통계적으로 유의한 상승이 나타났다(Table 7).
- 이러한 실험 결과는 蚯蚓藥鍼 시술이 1차적 항산화반응을 담당하는 SOD와 그 과정에서 파생되는 H2O2를 다시 물로 환원시켜 주는 CAT를 모두 활성화시켜줌을 의미한다. 또한 앞의 혈장과 간장의 TBARS 항목과 연계하여 생각해 볼 때, 蚯蚓藥鍼 시술이 지질의 과산화 반응 억제와 항산화계 효소의 활성이라는 두가지 방면 모두에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 이와 같이 비만이 지질과산화물과 adipokine의 생성을 통하여 순환계 질환과 대사성 질환 등 각종 질환의 발병에 깊이 관여하고 있다는 사실에 근거하여 蚯 蚓藥鍼의 시술을 통한 실험적 연구를 시도하였고, 그결과 여러 항목에서 유의한 효능이 있음이 밝혀졌다. 다만 아직 관련된 연구가 부족한 상태이므로 앞으로 다양하고 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 항산화계 효소 중에서 SOD의 활성도는 中脘약침군과 中脘－足三里약침군에서 통계적으로 유의성 있는 상승을 나타내었고 CAT 활성치는 蚯蚓藥鍼 처리군 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의한 상승을 보였다. GSH-Px는 전 처리군에서 통계적으로 유의성 있는 수치를 나타내지 못하였다(Table 6).
- 혈장 total cholesterol의 농도는 中脘약침군과 中脘－ 足三里약침군이 대조군에 비해 유의성 있게 하락하였고 HDL-C 농도의 변화는 전 처리군에서 통계적 유의성이 없었으며 LDL-C의 농도는 蚯蚓藥鍼 처리군 모두가 대조군에 비해서 유의성 있게 하락하였다 (Table 3).
- 혈장과 간장의 TBARS 농도는 蚯蚓藥鍼 처리군(TⅠ, T Ⅱ, T Ⅲ) 모두 대조군보다 낮은 경향을 보였으나 中脘一足三里약침군(T Ⅲ)의 경우만이 대조군보다 통계적으로 유의하게 높은 수치가 나타났다(Table 5).
후속연구
- 이와 같이 비만이 지질과산화물과 adipokine의 생성을 통하여 순환계 질환과 대사성 질환 등 각종 질환의 발병에 깊이 관여하고 있다는 사실에 근거하여 蚯 蚓藥鍼의 시술을 통한 실험적 연구를 시도하였고, 그결과 여러 항목에서 유의한 효능이 있음이 밝혀졌다. 다만 아직 관련된 연구가 부족한 상태이므로 앞으로 다양하고 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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