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문제 정의
- 그러나 유용 이매패류의 생산성 증대라는 측면에서는 부유유생 기간 동안의 이들의 환경요인의 변동에 따른 개체군 동태를 밝히는 것은 매우 중요하며 이를 위해 현미경적인 크기의 유생에 대한 정확한 동정은 필수요건이다. 따라서, 본 연구는 태안 갯벌형 바다목장 해역에서 출현한 이매패 유생을 채집하여 single cell PCR 및 미세 형태구조를 통한 종 동정을 실시하였다.
제안 방법
- PCR tube에 보관된 유생들은 single cell PCR을 수행 하기 위하여 lysis buffer[SDS(0.005%) and proteinase K (400 ng µl −1)] 5 µl를 넣고 액체 질소(10분)와 60℃ water bath(30분)간 동결 및 용해를 3회 반복하여 세포를 파괴하였다.
- Primer는 ITS 부위 (Forward; 5'-dGTTTCCGTAGGTGAACCTG-3', Reverse;5'-dCTCGTCTGATCTGAGGTCG-3')로 각각 0.3 µM, MgCl2 (1.5 mM), dNTP (each 200 1.5 µM), 2.5 units의 Taq DNA polymerase (EX taq, Takara, Japan)와 PCR buffer 를 넣어 총 부피를 50 µl에 맞춰서 투입하여 thermal cycler(TP-600, Takara, Japan)를 이용하여 증폭하였다.
- 이렇게 분리된 시료는 Axioskop 40 광학현미경에서 MRc5 CCD camera로 촬영하였다. SEM 관찰을 위한 시료는 Osmium tetroxide와 saturated mercuric chloride 고 정액(5:1 v/v)으로 10분간 고정 및 tert-butanol로 10분간 치환 후 Hexamethyldisilazane로 건조하였다. 이렇게 건조된 시료는 aluminum stub에 올려놓은 뒤 gold-palladium으로 코팅(MSC-101, Jeol, Japan) 후 주사전자현미경 (5600LV, Jeol)으로 관찰하였다(Jung et al.
- 광학현미경(LM) 및 주사전자현미경(SEM) 관찰을 위하여 시료는 capillary를 통하여 이매패 유생을 분리하였다. 이렇게 분리된 시료는 Axioskop 40 광학현미경에서 MRc5 CCD camera로 촬영하였다.
- 시료는 실험실로 운반하여 Capillary method를 통하여 광학 현미경(Axioskop 40, Zeiss, Germany) 하에서 한 개체씩 분리하여 PCR tube에 보관하였다. 이때 PCR 비증폭및 분석오류를 최소화하기 위하여 10회 반복 실험하였다.
- 시료는 실험실로 운반하여 Capillary method를 통하여 광학 현미경(Axioskop 40, Zeiss, Germany) 하에서 한 개체씩 분리하여 PCR tube에 보관하였다. 이때 PCR 비증폭및 분석오류를 최소화하기 위하여 10회 반복 실험하였다. PCR tube에 보관된 유생들은 single cell PCR을 수행 하기 위하여 lysis buffer[SDS(0.
- SEM 관찰을 위한 시료는 Osmium tetroxide와 saturated mercuric chloride 고 정액(5:1 v/v)으로 10분간 고정 및 tert-butanol로 10분간 치환 후 Hexamethyldisilazane로 건조하였다. 이렇게 건조된 시료는 aluminum stub에 올려놓은 뒤 gold-palladium으로 코팅(MSC-101, Jeol, Japan) 후 주사전자현미경 (5600LV, Jeol)으로 관찰하였다(Jung et al. 2010).
- 광학현미경(LM) 및 주사전자현미경(SEM) 관찰을 위하여 시료는 capillary를 통하여 이매패 유생을 분리하였다. 이렇게 분리된 시료는 Axioskop 40 광학현미경에서 MRc5 CCD camera로 촬영하였다. SEM 관찰을 위한 시료는 Osmium tetroxide와 saturated mercuric chloride 고 정액(5:1 v/v)으로 10분간 고정 및 tert-butanol로 10분간 치환 후 Hexamethyldisilazane로 건조하였다.
- 채집 후 시료는 선상에서 80% 에탄올로 고정 후 냉장보관하였다. 이렇게 채집된 이매패류의 부유 유생은 해부 현미경(SZX9, Olympus, Japan)에서 계수하였다(Table 1).
- 증폭된 PCR 산물은 Qiaquick PCR purification Kit (Qiagen, 28104)으로 정제하였다. 정제된 산물은 ThermoSequenceTM 2.0 sequencing kit(USB, Ohio, USA)과 Dual Dye automated sequencer(Model 4200, LI-COR, USA)로 염기서열을 분석하였고, 얻어진 염기서열은 Genbank의 BLAST search를 통해 가장 근접한 종들을 찾아 database 하였다. 이렇게 정리된 database의 염기서열의 정렬은 clustal W 방법으로 Bio-edit 7.
- 83"E)에서 채집하였다. 조사기간은 Chung et al. (2005) 및 Choi et al. (2005), 일본의 全國沿岸漁業振興開發協會 (1996) 등의 바지락의 봄철 산란의 보고에 맞추어 2006년 12월부터 2007년 7월까지 8개월동안 월 2회, 대조기의 만조시에 실시하였다. 이매패 유생의 채집은 이들이 다양한 공간에 걸쳐 불균일한 패치상으로 분포하며, 각정기 및 성숙기 유생이 거의 항상 저층이나 해저 직상층에 분포함을 고려하여 망목 50 µm 크기의 Kitahara형 플랑크톤 네트로 수평 및 수직 정량 예인하였다.
대상 데이터
- 태안 갯벌형 바다목장 해역 내 이매패류 유생의 채집은 태안군 고남면 소재 옷점 연안의 조하대 정점 (36o24'38.99"N, 126o 24'21.83"E)에서 채집하였다.
데이터처리
- Genetic distance of analyzed sequences of Ruditapes philippinarum and Meretrix lusoria larvae as estimated by the Kimura 2-parameter model. All results are based on pairwise analysis. G.
- 5 γ distributed rate로 Kimura 2- parameter model을 통해 분석하였다. 계통수 및 pairwise distance 분석은 MEGA 2.0 program을 이용하였다 (Charrel et al. 1999).
이론/모형
- Table 2. Genetic distance of analyzed sequences of Ruditapes philippinarum and Meretrix lusoria larvae as estimated by the Kimura 2-parameter model. All results are based on pairwise analysis.
- Pairwise distance는 0.5 γ distributed rate로 Kimura 2- parameter model을 통해 분석하였다.
- 2(Hall 1999)을 통해 분석하였다. 계통수 분석은 neighbor-joining (NJ) algorithm 으로, genetic distance는 Kimura 2-parameter distance model과 1000 replications의 bootstrap으로 분석하였다. Pairwise distance는 0.
- 0 sequencing kit(USB, Ohio, USA)과 Dual Dye automated sequencer(Model 4200, LI-COR, USA)로 염기서열을 분석하였고, 얻어진 염기서열은 Genbank의 BLAST search를 통해 가장 근접한 종들을 찾아 database 하였다. 이렇게 정리된 database의 염기서열의 정렬은 clustal W 방법으로 Bio-edit 7.0.5.2(Hall 1999)을 통해 분석하였다. 계통수 분석은 neighbor-joining (NJ) algorithm 으로, genetic distance는 Kimura 2-parameter distance model과 1000 replications의 bootstrap으로 분석하였다.
성능/효과
- Single-cell PCR 결과, 채집된 이매패류 유생은 바지락 (Ruditapes philippinarum)과 백합(Meretrix lusoria)과 99% 이상의 높은 유전적 상동성을 가지고 있었다. 그러나, 바지락은 R.
- 이때의 유생은 Nano-Pico size의 식물플랑크톤을 섭식하며 3-5일이 지나면 각장이 130-140 µm가 되어 각정기로 들어가며, 2-4주일 지나면 변태기(Pediveliger stage)로 각장이 180 µm 이상이 되며, 착저를 위해 저층에 분포한다고 보고하였다. 따라서, 본 조사해역에서 5월 초에 가장 높은 개체수를 보이다가 5월 중순에 개체수가 급감했던점으로 미루어 볼 때(Table 1), 동시적인 산란과 함께 빠른 부유 유생 생활사를 가지고 있음을 판단할 수 있었다.
- 백합은 우리나라 남, 서해연안에서 수온이 25-27℃ 사이의 8월에서 9월 사이에 주로 산란한다고 보고하였으나(유 2000), Chung (2007)에 의하면 산란은 6월에서 9월까지 지속되나 수온이 22℃ 이상으로 상승하는 7-8월이 산란 성기로 나타났다고 하였다. 따라서본 연구에서는 4월에서 6월까지의 수온의 범위가 15.9~22.5℃로 나타나고 있어 본 연구에 출현한 부유 자패는 6월 산란군에 속하는 것으로 보인다.
- 백합 유생의 평균 길이는 각장이 202±44 µm, 각고가 161±35 µm, 각폭이 96±38 µm을 나타내었고, 각 장과 각고의 비율이 1.25로 바지락 유생보다 크기가 컸다(Table 3).
- 따라서 Ruditapes 속의 분류체계에 있어, 향후 심도 있는 연구가 제기되는 부분이다. 본 조사해역인 태안 갯벌형 바다목장은 바지락의 주 서식지이며, 백합도 채집됨을 감안할 때, 본 연구에서 분석된 염기서열은 바지락과 백합의 유생의 것이라 판단된다. 그러나, Meretrix species에 속하는 종 중 M.
- 분석된 시료의 1108 bp의 염기서열들은 바지락 (Ruditapes philippinarum, Accession number: EF035088) 과 99%의 상동성을 보였다(Fernández et al. 2000).
- 2000). 이를 가지고 백합과(Veneridae)를 구성하는 종들의 계통을 분석한 결과 R. philippinarum과 동일 계통을 형성하였다(Fig. 1). 또 다른 시료의 904 bp의 염기서열은 백합(Meretrix lusoria, AB499129)와 99% 상동성으로, 0.
- 1995), metamorphosis를 준비하는 피면자기(pediveliger stage) (L3), CaCO3 침적에 의한 불투명한 larval shell이 형성되는 단계(L4)로 구분이 된다(Nichols and Black 1994). 채집된 바지락 유생은 D-veliger stage로 관찰된 개체들은 크기가 대부분 유사하여 동시적인 산란후의 부유 유생기를 거치고 있음을 판단할 수 있었다. 특히 접번중 이빨은 8-10개를 보여 Sakai and Sekiguchi (1992)가 보고한 D-shape상의 바지락 유생의 접번 이빨의 모양과 일치 하였다.
- 태안 갯벌형 바다목장해역에서 출현하는 이매패류 유생의 동정을 위하여 single cell PCR 및 현미경 관찰한결과, 바지락(R. philippinarum)과 백합(M. lusoria) 유생으로 동정되었다. D-veliger stage의 바지락은 각장이 156±22 µm, 각폭 126±12 µm, 각고 92±14 µm를 나타낸 반면, umbonal stage의 백합 유생은 각장이 202±44 µm, 각폭이 161±35 µm, 각고가 96±38 µm를 나타내었다.
후속연구
- D-veliger stage의 바지락은 각장이 156±22 µm, 각폭 126±12 µm, 각고 92±14 µm를 나타낸 반면, umbonal stage의 백합 유생은 각장이 202±44 µm, 각폭이 161±35 µm, 각고가 96±38 µm를 나타내었다. 비록 본 연구에서는 2종의 유생이 선별되었으나, 바다목장 해역 내 다양한 이매패류의 유생이 출현할 것으로 예상되어, 이를 규명하기 위해 장기간에 걸친 조사에 따라 정량 및 정성 분석의 연구가 필요하다. 또한 single cell PCR 기법은 배양이 어려운 micro-size 생물을 가지고 효과적인 동정을 할 수 있는 기술이라 판단되나 각 분류군에 맞는 동정 방법론 개발 등 다각적인 연구가 계속적으로 이루어져야 된다.
- 2000). 이와 같이 이매패류 유생의 정확한 종 동정을 위한 다각적 방법론들의 도입은 형태학적 동정의 오류를 보완할 수 있으며, 나아가 형태, 분자, 면역학적인 종 특이적 분류체계를 구축하는데 기여할 수 있을 것이다.
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