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문제 정의
- , 2011). 이 연구는 바지락의 생활사 및 산란특성을 이해하기 위해 바지락 수정란의 배 발생 과 유생발달 과정을 광학현미경과 주사현미경을 이용하여 밝히고, 산란 전.후의 바지락 번식 생리학적 특징을 규명하였다.
제안 방법
- 산란은 24시간 동안 지속되었으며, 수정란이 침전되지 않도록 통기 (aeration) 하였다. 24시간 후 산란을 마친 바지락 18개체를 선별하여 산란 후 번식상태를 확인 하기 위해 조직과 번식량 측정에 사용하였다.
- 각 시료에 포함된 바지락 알 단백질 양은 표준물질로 포함된 바지락 알의 흡광계수 (optical density) 에 대한 표준 회귀 곡선 (standard regression curve) 과 시료의 희석배수로부터 유추하였다. ELISA에 의하여 측정된 각 개체의 알 단백질량은 바지락 알 단백질이 바지락 알에 차지하는 비율 (40 %) 을 감안, 측정된 알 단백질 양에 2.44를 곱하여, 각 개체에 포함된 바지락 알의 양을 추정하였다. 최종적으로 생식소 지수 (Gonad Somatic Index, GSI) 는 ELISA를 통하여 측정된 번식량 (알의 총 중량) 이 전체 조직의 건중량에 차지하는 비율 (egg mass/total tissue dry weight) 로 표현하였다.
- 그 후, 2차 항체에 대한 발색 시약을 참가 한 뒤 항원항체 반응 결과를 흡광도를 이용하여 측정하였다. 각 시료에 포함된 바지락 알 단백질 양은 표준물질로 포함된 바지락 알의 흡광계수 (optical density) 에 대한 표준 회귀 곡선 (standard regression curve) 과 시료의 희석배수로부터 유추하였다. ELISA에 의하여 측정된 각 개체의 알 단백질량은 바지락 알 단백질이 바지락 알에 차지하는 비율 (40 %) 을 감안, 측정된 알 단백질 양에 2.
- , (2004) 이 개발한 바지락 알에 대한 다클론 항체를 1차 항체, 1차 항체에 대한 alkaline phosphateconjugated goat anti-rabbit IgG를 2차 항체로 사용하여 반응시켰다. 그 후, 2차 항체에 대한 발색 시약을 참가 한 뒤 항원항체 반응 결과를 흡광도를 이용하여 측정하였다. 각 시료에 포함된 바지락 알 단백질 양은 표준물질로 포함된 바지락 알의 흡광계수 (optical density) 에 대한 표준 회귀 곡선 (standard regression curve) 과 시료의 희석배수로부터 유추하였다.
- 최종적으로 생식소 지수 (Gonad Somatic Index, GSI) 는 ELISA를 통하여 측정된 번식량 (알의 총 중량) 이 전체 조직의 건중량에 차지하는 비율 (egg mass/total tissue dry weight) 로 표현하였다. 또한 각 개체의 포란수 (fecundity) 는 ELISA에 의하여 측정된 바지락 알의 총량을 바지락 알개체 중량 (22 ng, Park et al., 2004) 으로 나누어 추정하였다.
- 사육수는 2일마다 전량 환수하였으며, 환수 시마다 유생의 크기는 실물투영기 (PJ-200, Olympus) 를 이용하여 측정하였다. 바지락 유생의 먹이공급은 D상 유생이 관찰된 난 발생 24시간 후부터 실시하였다. 먹이생물은 한국 미세조류은행 (KMMCC) 에서 분양 받은 Isochrysisgalbana (KMMCC-12), Chaetoceroscalcitrans (KMMCC-604), Tetraselmissuecica (KMMCC-111) 를 conwy배지를 이용하여 최대 20 L규모로 계대 배양하였으며, Helm et al.
- 4 psu를 유지하였으며, 해수는 5, 3, 1 μm의 여과필터를 통과한 해수를 사용하였다. 바지락은 별도의 자극 없이 순치 12시간째인 밤 12:00시경 산란하였다. 산란은 24시간 동안 지속되었으며, 수정란이 침전되지 않도록 통기 (aeration) 하였다.
- 3 mg/L의 범위를 나타냈다. 사육수는 2일마다 전량 환수하였으며, 환수 시마다 유생의 크기는 실물투영기 (PJ-200, Olympus) 를 이용하여 측정하였다. 바지락 유생의 먹이공급은 D상 유생이 관찰된 난 발생 24시간 후부터 실시하였다.
- 바지락 수정란의 시간 경과에 따른 난 발생과 유생 발달 과정을 관찰하기 위해 광학 현미경과 주사 전자 현미경 (scanning electron microscope) 을 이용하였다. 수정직후, 수정란의 세포분열, 난할, 배발생, 유생 발생 단계를 광학 현미경으로 관찰하였고, 각 발생 단계별 바지락의 배발생 과 유생의 외형적 특징을 주사 전자 현미경으로 관찰하기 위해 2% glutaraldehyde에 1시간 동안 전 고정하였다. 전 고정이 완료된 시료는 50, 70, 90, 95, 100%의 에탄올로 탈수 과정을 거쳐 30, 50, 70, 100%의 isoamyl acetate (JUNSEI) 로 치환하였다.
- 이 연구에서는 바지락 (Ruditapes philippinarum) 의 번식량 및 유생발생을 관찰하였으며, 이를 위하여 수정란 및 유생을 21일 간 실내사육수조를 이용하여 배양하였다. 바지락은 2011년 8월 제주시 김녕에서 채집 실험 수조로 옮겨졌으며, 다음날 자연적인 방란 방정이 관측되었다.
- 수정직후, 수정란의 세포분열, 난할, 배발생, 유생 발생 단계를 광학 현미경으로 관찰하였고, 각 발생 단계별 바지락의 배발생 과 유생의 외형적 특징을 주사 전자 현미경으로 관찰하기 위해 2% glutaraldehyde에 1시간 동안 전 고정하였다. 전 고정이 완료된 시료는 50, 70, 90, 95, 100%의 에탄올로 탈수 과정을 거쳐 30, 50, 70, 100%의 isoamyl acetate (JUNSEI) 로 치환하였다. 치환 후, 시료를 여과지에 옮겨 진공건조를 실시하고, gold 입자로 코팅하였다.
- , (2006) 의 방법에 따라 분류하였다. 조직시료 작성에 이용된 바지락을 대상으로 비만도 지수 (Condition Index, CI) 를 산출하였으며, 비만도는 바지락 습 중량 (g)과 패각 건 중량의 비율로 결정하였다.
- 44를 곱하여, 각 개체에 포함된 바지락 알의 양을 추정하였다. 최종적으로 생식소 지수 (Gonad Somatic Index, GSI) 는 ELISA를 통하여 측정된 번식량 (알의 총 중량) 이 전체 조직의 건중량에 차지하는 비율 (egg mass/total tissue dry weight) 로 표현하였다. 또한 각 개체의 포란수 (fecundity) 는 ELISA에 의하여 측정된 바지락 알의 총량을 바지락 알개체 중량 (22 ng, Park et al.
- 전 고정이 완료된 시료는 50, 70, 90, 95, 100%의 에탄올로 탈수 과정을 거쳐 30, 50, 70, 100%의 isoamyl acetate (JUNSEI) 로 치환하였다. 치환 후, 시료를 여과지에 옮겨 진공건조를 실시하고, gold 입자로 코팅하였다. 코팅된 바지락 유생 시료는 장방출주사전자현미경 (JSM-6700F, JEOL Korea Ltd) 를 이용하여 수정란과 유생의 발달단계별 형태 변화를 관찰하였다.
- 치환 후, 시료를 여과지에 옮겨 진공건조를 실시하고, gold 입자로 코팅하였다. 코팅된 바지락 유생 시료는 장방출주사전자현미경 (JSM-6700F, JEOL Korea Ltd) 를 이용하여 수정란과 유생의 발달단계별 형태 변화를 관찰하였다.
- 포매 된 조직 시료는 마이크로톰을 이용하여 6 μm 두께로 자른 후, 탈 파라핀 과정을 거쳐 Harris’s hematoxylin 과 Eosin Y로 염색하였다.
- 이 연구는 바지락의 생활사 및 산란특성을 이해하기 위해 바지락 수정란의 배 발생 과 유생발달 과정을 광학현미경과 주사현미경을 이용하여 밝히고, 산란 전.후의 바지락 번식 생리학적 특징을 규명하였다.
대상 데이터
- 바지락 유생의 먹이공급은 D상 유생이 관찰된 난 발생 24시간 후부터 실시하였다. 먹이생물은 한국 미세조류은행 (KMMCC) 에서 분양 받은 Isochrysisgalbana (KMMCC-12), Chaetoceroscalcitrans (KMMCC-604), Tetraselmissuecica (KMMCC-111) 를 conwy배지를 이용하여 최대 20 L규모로 계대 배양하였으며, Helm et al., (2004) 이 제시한 유생 크기에 따른 먹이공급표에 따라 유생수와 크기를 계산하여 24시간 동안 먹이공급펌프를 이용하여 공급하였다.
- 바지락의 산란 유도는 수용량 40 L원형수조를 이용하여 실시하였다. 산란 유도시 수온은 24°C, 염분 33.
- , (2004) 이 개발한 바지락 알에 대한 다클론항체와면역효소법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 을 이용하여 분석하였다. 번식량 측정은 산란 이전 바지락 10 개체 중, 암컷으로 판명된 5 개체와 산란 후 선발된 18개체 중 조직학적 관찰에 의하여 산란이 확인 된 암컷 7 개체를 대상으로 실시하였다. 동결건조하여 균질화된 20 mg의 바지락 조직과 순수 분리된 바지락 알 표준물질을 인산완충용액 (0.
- 실험에 이용된 바지락은 각장 38-39.8 mm크기의 50개체로, 2011년 8월 14일 제주시 김녕항에서 채집되었으며 (Fig. 1), 당일 수온은 21.5℃였다. 채집된 바지락은 실험실로 옮겨져 산란 전까지 실내 사육수조에 순치되었다.
- 조직학적 관찰은 산란 전에 임의로 선발한 10 개체와 산란 후, 선발된 바지락 18 개체를 대상으로 실시하였다. 조직시료는 바지락 생식소가 포함되도록 체 조직의 중앙을 3 mm 두께로 절단한 뒤, Davison’s solutiona에 48시간 고정하였다.
- 채집된 바지락은 실험실로 옮겨져 산란 전까지 실내 사육수조에 순치되었다. 총 50개체 의 바지락 중, 임의로 선별된 10개체는 산란 전 번식량 및 성 성숙도 분석에 이용되었다.
이론/모형
- 포매 된 조직 시료는 마이크로톰을 이용하여 6 μm 두께로 자른 후, 탈 파라핀 과정을 거쳐 Harris’s hematoxylin 과 Eosin Y로 염색하였다. 광학현미경하에서 바지락 생식소 발달 단계는 Drummond et al., (2006) 의 방법에 따라 분류하였다. 조직시료 작성에 이용된 바지락을 대상으로 비만도 지수 (Condition Index, CI) 를 산출하였으며, 비만도는 바지락 습 중량 (g)과 패각 건 중량의 비율로 결정하였다.
- 원심분리 된 바지락 조직 상등액은 4,000–5,000배로 희석하였으며, 각각의 상등액 100 μL를 96 well microplate에 24시간 배양하여 항원을 준비하였다. 다음날, Park et al., (2004) 이 개발한 바지락 알에 대한 다클론 항체를 1차 항체, 1차 항체에 대한 alkaline phosphateconjugated goat anti-rabbit IgG를 2차 항체로 사용하여 반응시켰다. 그 후, 2차 항체에 대한 발색 시약을 참가 한 뒤 항원항체 반응 결과를 흡광도를 이용하여 측정하였다.
- 바지락 수정란의 시간 경과에 따른 난 발생과 유생 발달 과정을 관찰하기 위해 광학 현미경과 주사 전자 현미경 (scanning electron microscope) 을 이용하였다. 수정직후, 수정란의 세포분열, 난할, 배발생, 유생 발생 단계를 광학 현미경으로 관찰하였고, 각 발생 단계별 바지락의 배발생 과 유생의 외형적 특징을 주사 전자 현미경으로 관찰하기 위해 2% glutaraldehyde에 1시간 동안 전 고정하였다.
- 바지락의 산란 전, 후 번식량 (reproductive effort) 는 Park et al., (2004) 이 개발한 바지락 알에 대한 다클론항체와면역효소법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 을 이용하여 분석하였다. 번식량 측정은 산란 이전 바지락 10 개체 중, 암컷으로 판명된 5 개체와 산란 후 선발된 18개체 중 조직학적 관찰에 의하여 산란이 확인 된 암컷 7 개체를 대상으로 실시하였다.
- , (2004) 는 바지락 알에 대한 항체를 최초로 개발하여 난 단백질을 정량할 수 있는 효소면역학적 방법 (ELISA) 을 개발 보고하였다. 이 연구에서는 일반적인 산란 유도에 의한 번식량 측정 대신, 바지락 체내에 분포하는 난 단백질을 Park et al., (2004) 이 개발한 항체와 효소면역학적 방법에 의하여 정량하였다. 일반적으로 화학물질 또는 수온변화를 이용한 산란 유발에 의한 바지락 번식량 측정은 바지락의 부분 산란 (partial spawning) 으로 인하여 실제 바지락체내에 있는 번식량 보다 낮게 평가되는 (underestimated) 경향이 있는 반면, 효소면역학적 방법에 의한 번식량 측정은 실제적인 량을 추정하는 장점을 지닌다 (Park and Choi 2004).
성능/효과
- D상 유생 단계에서는 패각과 내부 기관의 성장과 발달이 뚜렷이 일어났다. 3일생 D상 유생은 면반 (velum) 을 이용하여 공급된 먹이생물의 섭이 및 유영활동이 관찰되었고 (Fig. 4C), 6일생유생에서는 패각의 성장이 뚜렷하여 prodissoconch I이 D-형을 유지하는 반면, 패각의 가장 자리에서는 조밀하게 밀집된 성장선 (growth line) 을 갖는 prodissoconsh II 시기로의 발달이 관찰되었다 (Fig. 6C). 10일생유생에서는 소화기관 (digestive system) 의 발달이 뚜렷이 관찰되었으며, 이때 먹이생물 섭이에 의한 소화활동이 관찰되었다 (Fig.
- D상 유생이 최초로 관찰된 시점 (수정 후 19시간 경과, 각장 86 μm) 부터 포복피면자유생이 관찰된 21일까지의 일간 패각 성장율은 평균 10.3μm/day 이었으며, 수정 후 5일 까지 급속한 패각 성장을 보였으며, 수정 후 10일부터 20일 까지 패각은 선형 (linear) 으로 성장하였다.
- 5F). 낭배기가 완료됨에 따라 바지락 배아 (embryo) 의 표면에는 뚜렷한 섬모 발달이 이루어졌고 (Figs. 3I, 5G), 섬모를 이용한 해수 내 배아의 자유 유영이 관찰되었다. 또한, 후기 낭배기에 원구의 반대편에 shell field의 분화가 관찰되었다 (Fig.
- 따라서 방란을 통하여 방출된 바지락 알의 개체수는 약 8.23 × 106 eggs로 추정되었다 (Table 1).
- 면역학적 방법을 이용한 산란 직전의 바지락 (N = 5) 에서 측정된 생식소지수 (GSI) 는 28.6 ± 10.7%이었으며, 이를 포란수로 추정한 결과 개체당 평균 11,725,162 ± 9,269,842 eggs를 포함하고 있었다.
- 비만도의 감소는 육중량의 감소에 의한 것으로 추정되며, 평균 조직 건 중량은 산란 전 0.6271 ± 0.3 g에서 산란 후 0.3768 ± 0.1 g으로 약 40% 정도 감소하였다 (Table 1).
- 성숙한 바지락으로부터 방란, 방정된 알과 정자는 우유빛의 색을 띠었으며, 난은 바닥에 가라앉는 비부착성 침성란 (demersal eggs) 의 특성을 보였다. 암컷 바지락에서 방란 된 난은 직경 55–60 μm의 타원형으로 난황막 (vitelline envelope) 으로 둘러싸인 뚜렷한 투명대 (hyaline zone) 에 의해 둘러싸여 있었다 (Fig.
- 수정 후 7시간째, 후기 낭배기에서 자유 유영생활을 하는 담륜자 유생 (trochopore larvae) 으로의 분화가 관찰되었다. 잘 발달된 구전섬모환 (prototroch) 을 갖고 있는 담륜자 유생은 섬모를 이용하여 수류를 일으키며 수조 내에서 활발한 회전 운동을 함이 관찰되었다 (Figs.
- 3A, 5B). 수컷 바지락에서 방정된 정자는 활발한 운동성을 보였고, 형태는 긴 원뿔 모양의 두부 (head) 와 한 개의 긴 편모 (flagellum) 를 갖고 있었다 (Fig. 5A). 두부는 상단의 뾰족한 첨체 (acrosome) 과 핵 (nuclei) 으로 구성되어있으며, 핵은 두부의 전, 후로 길게 신장되어 한쪽으로 구부러진 형태를 갖고 있었다 (Fig.
- 3D, 5E). 연속적인 세포분열이 진행되어 수정 후 4시간 50분에 약한 회전 운동성을 보이는 포배기 (blastula stage) 가 관찰되었고 (Fig. 3G), 이후낭배기 (gastrula stage) 에 접어들면서 수정난 표면에 섬모 (cilia) 가 형성되기 시작하고 뚜렷한 원구 (blastophore) 의 함몰이 관찰되었다 (Fig. 5F). 낭배기가 완료됨에 따라 바지락 배아 (embryo) 의 표면에는 뚜렷한 섬모 발달이 이루어졌고 (Figs.
- 완전한 D상 유생 (D-shape larvae) 은 수정 후 19 시간째 관찰되었으며, 이 시기 유생 각 장은 약 86 μm였다 (Fig. 4B).
- 이러한 차이는 먹이활동을 본격적으로 시작하는 유생발달 시기에 성장이 더딘 것에 기인한 것으로 사료된다. 이 연구에 사용된 바지락 사육조의 규모는 다른 연구에 쓰인 상업적인 바지락 유생사육 시설과 비교하여, 그 규모와 그 규모가 매우 작았으며, 그 결과 바지락 유생의 성장이나 먹이 활동에 부정적인 영향을 미친 것으로 사료된다.
- 이 들 연구에 의하면, 제주도 성산 지역 바지락의 산란은 6월부터 9월까지 관찰되었으며, 특히 수온이 23℃이상인 7-8월에 주로 산란한다고 보고하였다. 이 연구에서 바지락이 채집된 김녕 지역은 성산과 위도상으로 매우 유사한 지역이며, 김녕항 내에는 용천수로 인하여 간조 시 염분이 낮아짐이 관찰되었다. 김녕항 내조간대의 수온은 채집 당시 21℃, 염분 21.
- 이 연구에서 측정된 산란 전, 후의 바지락 비만도는 암, 수에 관계없이 평균적으로 0.5 ± 0.11-0.3 ± 0.05로 산란 전, 후로 비만도는 약 40% 감소하였다 (Table 1).
- 5시간이 소요되었고, 착저기 유생인 담륜자유생까지는 13일이 소요된 것으로 보고 하였다. 이번 연구결과 24℃ 수온에서 배양된 바지락 수정난은 수정 후 6시간째 낭배기 (grstrula) 가 형성되었고, 담륜자 유생 (trocophore) 은 7시간, D상 유생은 19시간째 관찰되었다 (Table 2). 바지락 배 발생 (embryogenesis) 과정은 Hur et al.
- 수정 후 7시간째, 후기 낭배기에서 자유 유영생활을 하는 담륜자 유생 (trochopore larvae) 으로의 분화가 관찰되었다. 잘 발달된 구전섬모환 (prototroch) 을 갖고 있는 담륜자 유생은 섬모를 이용하여 수류를 일으키며 수조 내에서 활발한 회전 운동을 함이 관찰되었다 (Figs. 4A, 5I).담륜자 유생기의 후반기에는 패각의 확장이 유생 양 측면에서 관찰되며, 좌각과 우각은 hinge에 의해 접혀 있다 (Fig.
- 6D). 저서생활로 들어가기 전의 포복피면자 유생 (pediveliger) 은 수정 후 21일째 foot이 발달되면서, 수조바닥을 기어다니는 행동이 관찰되었으며, 이 때 입수관과 출수관 (siphon) 의 형성이 관찰되었다 (Fig. 4G).
- 바지락 수정란은 19시간의 배 발생과정을 거쳐 21일 후 포복피면자유생 (pediveliger) 으로 발달하였다. 조직학적 방법을 이용하여 바지락의 생식소를 관찰한 결과, 방란, 방정 전 모든 개체는 성적으로 완숙한 상태였고, 산란 후 모든 개체에서 부분산란이 관찰되었다. 효소면역학적 방법 (ELISA) 에 의한 번식량 측정 결과, 암컷 바지락의 생식소 지수는 (GSI) 산란 전 28.
- 조직학적 방법을 이용하여 바지락의 생식소를 관찰한 결과, 방란, 방정 전 모든 개체는 성적으로 완숙한 상태였고, 산란 후 모든 개체에서 부분산란이 관찰되었다. 효소면역학적 방법 (ELISA) 에 의한 번식량 측정 결과, 암컷 바지락의 생식소 지수는 (GSI) 산란 전 28.6%에서 산란 후 17.3%로 11.3% 감소하였으며, 추정된 포란수는 6,998,658 eggs였다. 이 연구서 광학현미경 및 전자현미경을 이용하여 관찰된 바지락 유생 발달 및 번식량은 향후 바지락 인공종묘 산업 및 바지락 자원관리에 있어 중요한 자료로 활용될 것으로 사료된다.
후속연구
- 3% 감소하였으며, 추정된 포란수는 6,998,658 eggs였다. 이 연구서 광학현미경 및 전자현미경을 이용하여 관찰된 바지락 유생 발달 및 번식량은 향후 바지락 인공종묘 산업 및 바지락 자원관리에 있어 중요한 자료로 활용될 것으로 사료된다.
- 11로 선재도 바지락에 비해 선재도 바지락과 비교시, 그 지수가 현저히 낮음을 알 수 있다. 이러듯 제주도 김녕항 바지락의 비만도지수가 다른 지역에 비해 현저히 낮은 것은 주로 먹이생물에 의한 것으로 추정 되나, 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요 시 된다.
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