[논문]OCT4와 SOX2에 의한 인간 Nanog 유전자의 전사 조절

석현정; 김영은; 박정아; 이영희

OCT4와 SOX2에 의한 인간 Nanog 유전자의 전사 조절
Transcriptional Regulation of Human Nanog Gene by OCT4 and SOX2 원문보기

Development & reproduction = 발생과 생식, v.14 no.2, 2010년, pp.123 - 129

석현정 (충북대학교 자연과학대학 생화학과) , 김영은 (충북대학교 자연과학대학 생화학과) , 박정아 (충북대학교 자연과학대학 생화학과) , 이영희 (충북대학교 자연과학대학 생화학과)

초록
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배아 줄기세포는 미분화상태에서 자가 재생을 유지할 수 있다. 자가 재생은 OCT4, SOX2와 NANOG와 같은 많은 인자들이 작용한다. 생쥐 배아 줄기세포에서 OCT4와 SOX2가 Nanog 프로모터에 결합하여 Nanog 유전자의 발현을 촉진한다는 사실은 생쥐 promoter에 관한 정밀분석으로 알려져 있다. 본 연구에서는 인간 Nanog promoter를 정밀 분석하기 위해 연속적인 결손 돌연변이를 가진 promoter-reporter construct를 제조하였다. Promoter의 최대 활성은 0.6 kb(-253/+365) promoter-reporter construct에서 발견되었으며, 이 construct에는 OCT4 및 SOX2의 결합부위가 포함된다. OCT4와 SOX2의 기여도를 확인하기 위하여 OCT4 및 SOX2의 결합부위에 자리 특이적 돌연변이를 유도하고 promoter 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, OCT4나 SOX2 어느 한 군데라도 돌연변이가 존재하면 promoter 활성이 현저히 저해되었다. 본 연구 결과를 통해 인간 Nanog 유전자 발현에 있어 OCT4 및 SOX2가 필수적임을 직접적으로 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Embryonic stem (ES) cells can self-renew maintaining the undifferentiated state. Self-renewal requires many factors such as OCT4, SOX2, and NANOG. It is previously known that OCT4 and SOX2 can bind to NANOG promoter and support Nanog gene expression in mouse ES cells by the detailed studies using the mouse Nanog promoter. Here, we constructed serial deletion mutant promoter-reporter constructs to investigate the human Nanog gene promoter in detail. The highest promoter activity was obtained in the 0.6 kb (-253/+365) promoter-reporter construct which includes the binding sites of OCT4 and SOX2. To further confirm contribution of OCT4 and SOX2 in Nanog gene expression, we introduced site- directed mutation(s) in the OCT4 and/or SOX2 binding sites of the human Nanog promoter 0.6 kb (-253/+365) and checked the influence of the mutation on the promoter activity using human EC cell line NCCIT. Mutation either in OCT4 binding site or SOX2 binding site significantly reduced the activity of Nanog promoter which directly confirmed that OCT4 and SOX2 binding is essential in human Nanog gene expression.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

1). 그러므로 미분화상태를 유지하면서 배양한 세포에서 Nanog 유전자 promoter의 활성을 확인하기로 하였다.
그러므로 실제로 인간 Nanog promoter를 cloning하여 site-directed mutagenesis 등을 통해 세밀하게 분석한 결과는 제시되지 않은 셈이다. 본 실험에서는 인간 Nanog promoter의 다양한 mutant construct를 제조하고 인간 배아 암세포주에서 그 활성을 확인함으로써, 인간 Nanog promoter의 조절을 직접 확인하고자 하였다. 본 실험의 결과, 0.
, 2009). 본 연구에서는 인간 Nanog promoter를 cloning하고, 다양한 크기의 deletion을 가진 promoter construct를 제작하여 인간 배아암세포주에서 promoter 활성을 확인함으로써 promoter 부위의 중요성을 확인하였으며, 특히 OCT4/SOX2 결합 부위의 자리 특이적 돌연변이를 유도하고, 그 결과를 비교함으로써 인간 Nanog 유전자의 발현에 대한 기여도를 확인하였다.
1. 인간 배아암세포주에서 Nanog 유전자의 발현 확인

인간 배아줄기세포는 transfection 효율이 매우 낮으므로 promoter 연구가 어려우나, 배아암세포주의 경우에는 이보다 transfection이 훨씬 용이하므로, 본 연구에서는 Nanog 유전자 발현을 확인하기 위하여 인간 배아줄기세포 대신에 인간 배아암세포주를 사용하기로 하였다. 인간 배아암세포주인 NCCIT에는 줄기세포 마커인 OCT4, NANOG 단백질이 발현됨을 단백질 수준에서 확인할 수 있었다.

가설 설정

Changes of the nucleotides are indicated in bold letters. (B) Effect of OCT4 and/or SOX2 binding site mutation on the Nanog promoter activity. NCCIT cells were transfected with the mutant promoter-reporter constructs.

제안 방법

0.4 kb(—61/+365), 0.6 kb(—253/+365), 0.8 kb(—348/+365), 1.0 kb(—651/+365), 1.2 kb(—838/+365), 1.4 kb(—1,053/+365), 1.6 kb(—1,232/+365)의 길이에 해당하는 Nanog promoter 서열은 primer와 인간 genomic DNA를 이용하여 PCR로 증폭시켰다.
16시간 후 Dual-Luciferase® Reporter Assay System(Promega)을 이용하여 세포조액을 얻고 luciferase 활성을 측정한 후, pRL-null 활성을 이용하여 측정치를 보정하였다.
증폭된 DNA는 agarose 전기영동을 통해 크기를 확인하였고, gel extraction kit(Solgent, Daejon, Korea)을 사용하여 순수 분리한 후 TA cloning kit(Solgent)를 사용하여 DH5α competent cell에서 cloning하였다. Cloning한 DNA 서열은 Solgent에 의뢰하여 서열을 분석한 뒤 비교 site(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/)를 통하여 서열 비교분석을 통해 확인하였다. 제한효소인 Kpn I과 Bgl Ⅱ를 이용하여 각 promoter 서열을 promoter가 없는 pGL3-basic 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝하여 promoter-reporter construct를 제조하였다.
3. Construction and analysis of mutant Nanog promoter constructs including site-directed mutation(s) in the OCT4 and/or SOX2 binding sites. (A) Site-directed mutagenesis.
2. Construction and analysis of serially deleted mutant constructs of the Nanog promoter. (A) Schematic illustration of serially deleted mutant promoter constructs cloned in pGL3-basic luciferase reporter plasmid.
16시간 후 Dual-Luciferase^® Reporter Assay System(Promega)을 이용하여 세포조액을 얻고 luciferase 활성을 측정한 후, pRL-null 활성을 이용하여 측정치를 보정하였다. Luciferase 활성은 luminometer(Junior LB 9509, Berthold, Bad Wildbad, Germany)를 이용하여 측정하였다.
Mutation 유도용 primer를 이용하여 1차 PCR을 수행한 후, 얻어진 PCR product를 annealing하여 primer를 추가하지 않고 Taq polymerase를 첨가하여 extension이 되게 한 후, 0.6 kb(—253/+365) 제작을 위해 사용한 primer를 이용하여 mutant promoter 서열을 증폭시켰다.
Nanog promoter의 전사 조절기작을 이해하기 위하여, 1.6 kb promoter에서 시작하여 다양한 길이의 Nanog promoter 서열을 확보하고, deletion mutant construct를 제작하였다 (Fig. 2A). 얻어진 promoter-reporter construct을 NCCIT cell에 transfection시킨 후 promoter 활성을 살펴본 결과, 0.
OCT4, SOX2 단백질의 결합 인자의 중요성을 재확인하기 위하여, 0.6 kb(—253/+365) promoter construct를 기반 으로 하여, OCT4 또는 SOX2 단백질 결합 부위를 한 개만 변형시킨 mutant와, 두 결합 부위 모두를 변형시킨 mutant를 제조하였다.
OCT4나 SOX2 binding site 중 하나 혹은 두 부위에 돌연변이를 유도한 promoter mutant를 제조하기 위하여 mutation 도입용 primer를 제작하였다. 사용한 primer 서열은 Table 1에 제시하였다.
실험에 사용한 primer는 Table 1에 제시하였다. PCR 조건으로서 denaturation 94℃ 1 min, annealing 58℃ 1 min, extension 72℃ 1 min 과정을 35 cycle 반복하였으며, HiPi Plus Taq polymerase(ELPIS-Biotech, Daejon, Korea)를 이용하였다. 증폭된 DNA는 agarose 전기영동을 통해 크기를 확인하였고, gel extraction kit(Solgent, Daejon, Korea)을 사용하여 순수 분리한 후 TA cloning kit(Solgent)를 사용하여 DH5α competent cell에서 cloning하였다.
PBS-T 용액으로 세척한 후, 2차 항체(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로 한 시간 동안 반응시켰다. West-Zol^TM Plus(iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)를사용하여 면역반응성을 확인하였다.
배아 암세포는 2～3일마다 계대 배양을 해주었다. 배양 접시에 자라고 있는 배아암세포를 1X PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄)로 두 번 세척한 후 TrypLE Express(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂, 습윤한 incubator에서 5분간 두었다. 단일 세포로 분리된 세포는 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin과 0.
전기영동으로 분리한 단백질은 nitrocellulose membranes (Millipore Corp, Bedford, MA, USA)로 옮겼다. 비특이적인 단백질의 결합을 방지하기 위해 5% skim milk가 첨가된 1X PBS-Tween 20(PBS-T) 용액으로 1시간 동안 반응한 후 1차 OCT4(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NANOG(Millipore Corp) 또는 GAPDH에 특이적인 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 한 시간 동안 반응시켰다. PBS-T 용액으로 세척한 후, 2차 항체(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로 한 시간 동안 반응시켰다.
fr/multalin/)를 통하여 서열 비교분석을 통해 확인하였다. 제한효소인 Kpn I과 Bgl Ⅱ를 이용하여 각 promoter 서열을 promoter가 없는 pGL3-basic 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝하여 promoter-reporter construct를 제조하였다. 확인된 reporter vector는 midi prep kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 순수분리한 후 transfection 실험에 사용하였다.
증폭된 DNA는 agarose 전기영동을 통해 크기를 확인하였고, gel extraction kit(Solgent, Daejon, Korea)을 사용하여 순수 분리한 후 TA cloning kit(Solgent)를 사용하여 DH5α competent cell에서 cloning하였다.
6 kb(—253/+365) 제작을 위해 사용한 primer를 이용하여 mutant promoter 서열을 증폭시켰다. 증폭된 서열을 TA cloning 및 DNA sequencing을 통해 서열을 확인하고, pGL3-basic 벡터로 subcloning하여 mutant promoter를 완성하였다.
제한효소인 Kpn I과 Bgl Ⅱ를 이용하여 각 promoter 서열을 promoter가 없는 pGL3-basic 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝하여 promoter-reporter construct를 제조하였다. 확인된 reporter vector는 midi prep kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 순수분리한 후 transfection 실험에 사용하였다.

대상 데이터

인간 배아암세포주 NCCIT는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 배아 암세포는 2～3일마다 계대 배양을 해주었다.

성능/효과

3A에 제시하였다. Mutant promoter construct을 NCCIT cell에 transfection 시킨 후 promoter 활성을 살펴본 결과, OCT4, SOX2 단백질 결합 부위 중 하나만 돌연변이 시켜도 Nanog promoter의 활성이 급격히 감소하여 pGL-basic vector control과 유사한 수준이 되는 것을 확인할 수 있다(Fig. 3B). 두 부위 모두에 돌연변이가 유도된 경우에도 동일한 결과를얻었다.
그러므로 이들 promoter construct 사이에서 보이는 promoter 활성의 차이는 OCT4, SOX2의 존재 여부에 의해 결정되는 것임을 예측할 수 있다. Promoter construct 에서 upstream 서열이 더 길어질 경우(0.8 kb, 1.0 kb, 1.2 kb, 1.4 kb, 1.6 kb)에는 promoter 활성이 오히려 감소하는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 negative element의 존재 가능성을 제시하고 있다(Fig. 2).
본 실험의 결과, 0.6 kb(—253/+365) promoter construct가 minimal promoter로 작동할 수 있음을 확인하였으며(Fig. 2), 자리 특이적 돌연 변이를 통해 OCT4와 SOX2 단백질의 결합 부위가 모두 다 중요하다는 사실을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
얻어진 promoter-reporter construct을 NCCIT cell에 transfection시킨 후 promoter 활성을 살펴본 결과, 0.4 kb promoter(—61/+365)에서는 활성이 매우 낮으나, 0.6 kb promoter(—253/+365)에서는 promoter construct 중에서가장 강한 활성을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).
3). 인간 Nanog promoter construct를 생쥐 배아암세포주인 F9에 transfection 하여 동일한 실험을 수행한 경우에도 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었는데, 이를 통해 종에 무관하게 Nanog promoter 가 작동할 수 있으며, 특히 OCT4, SOX2의 중요성은 마찬가지임을 직접적으로 확인할 수 있었다(결과 제시하지 않음).
인간 배아줄기세포는 transfection 효율이 매우 낮으므로 promoter 연구가 어려우나, 배아암세포주의 경우에는 이보다 transfection이 훨씬 용이하므로, 본 연구에서는 Nanog 유전자 발현을 확인하기 위하여 인간 배아줄기세포 대신에 인간 배아암세포주를 사용하기로 하였다. 인간 배아암세포주인 NCCIT에는 줄기세포 마커인 OCT4, NANOG 단백질이 발현됨을 단백질 수준에서 확인할 수 있었다. 이는 기존의 보고와 일치하는 결과이다(http://stemcells.
gov/info/2001 report). 한편, 배아줄기세포 및 배아암세포에서 분화를 유도하는 물질로 알려진 retinoic acid를 처리한 후 OCT4 및 NANOG의 발현을 살펴본 결과, 분화유도 기간이 경과할수록 이들 단백질의 발현이 점차 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 그러므로 미분화상태를 유지하면서 배양한 세포에서 Nanog 유전자 promoter의 활성을 확인하기로 하였다.

후속연구

이외에도 다른 promoter 부위의 중요성 및 관련 단백질에 관한 연구 결과가 향후에 더 나올 것으로 예상된다. 본 연구에서 제작한 promoter-reporter construct는 향후 인간 Nanog promoter 활성을 조절하는 인자를 검색하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
p53이 Nanog promoter에 결합하면 Nanog 유전자의 발현이 저해되며, 분화에 따른 p53의 활성화는 분화 과정에서 Nanog의 발현이 저하되는데 기여하는 것으로 알려져 있다. 이외에도 다른 promoter 부위의 중요성 및 관련 단백질에 관한 연구 결과가 향후에 더 나올 것으로 예상된다. 본 연구에서 제작한 promoter-reporter construct는 향후 인간 Nanog promoter 활성을 조절하는 인자를 검색하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	대표적인 다능성 줄기세포는 무엇인가?	, 2001). 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 대표적인 다능성 줄기세포이다. 배아줄기세포의 자가 재생 유지에는 많은 요인(OCT4, SOX2, FOXD3와 NANOG)이 작용한다(Niwa et al.
	다능성 줄기세포란 무엇인가?	다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)는 자가 재생(selfrenewal)을 통한 수적 증가와 다양한 조직세포로 분화할 수있는 능력을 가지고 있는 줄기세포로서, 향후 세포치료를 위한 다양한 세포의 공급원으로 활용할 수 있을 것으로 예측되며, 많은 과학자들이 줄기세포의 자가 재생에 관련된 mechanism에 대해 연구 중에 있다(Evans & Kaufman. 1981; Thomson et al.
	배아 줄기세포의 자가 재생에 어떠한 인자가 작용하는가?	배아 줄기세포는 미분화상태에서 자가 재생을 유지할 수 있다. 자가 재생은 OCT4, SOX2와 NANOG와 같은 많은 인자들이 작용한다. 생쥐 배아 줄기세포에서 OCT4와 SOX2가 Nanog 프로모터에 결합하여 Nanog 유전자의 발현을 촉진한다는 사실은 생쥐 promoter에 관한 정밀분석으로 알려져 있다.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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