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문제 정의
- 둘째, 편측파킨슨병 모델쥐에서 보행활동저하가 병변 반대측 뒷다리근에 미치는 영향을 규명한다.
- 본 연구의 목적은 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 보행활동저하가 나타나는지를 확인하고 보행활동저하가 쥐의 병변 반대측(contralateral)과 병변 동측(ipsilateral) 뒷다리근에 미치는 영향을 파악하는 것으로 그 구체적인 목적은 다음과 같다.
- 셋째, 편측파킨슨병 모델쥐에서 보행활동저하가 병변 동측 뒷다리근에 미치는 영향을 규명한다.
- 위와 같이 활동저하에 의해 근위축이 발생한다는 선행연구 결과를 토대로 파킨슨병에 의한 보행활동저하로 하지 근위축을 유발할 수 있으리라고 가정되나 파킨슨병 환자들의 근위축 발생을 보고한 연구가 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 편측 파킨슨병 모델 쥐를 이용하여 파킨슨병에 의한 보행활동저하가 쥐의 뒷다리근인 가자미근과 족척근에 미치는 영향을 규명하고자 한다.
제안 방법
- 7.6×7.6 cm 격자가 그려진 91×91 cm polyvinyl chloride (PVC)판(open field)에 쥐를 올려놓은 뒤 쥐가 격자의 선을 지나간 횟수를 5분간 기록하였다.
- 편측 파킨슨병 유발 수술 3주 후 amphetamine (3 mg/kg)을 피하 주사하고 30분 후 흰쥐를 직경 40 cm의 투명한 원통에 넣고 관찰하였다. Amphetamine에 의해 도파민 신경세포에서 도파민이 분비되어 선조체를 과도하게 흥분시켜 동물을 병변 반대방향으로 회전운동을 하게 되는 원리로 원통에서 10분간 적응시킨 후 1분 동안 몸 전체가 병변 반대방향으로 회전하는 횟수가 5회 이상인 쥐를 편측 파킨슨병이 유발된 것으로 간주하였다.
- Paxinos과 Watson (2007)의 atlas를 참조하여 좌측 흑질(전정을 중심으로 전방으로 4.4 mm, 오른쪽으로 1.2 mm, 경막에서 밑으로 7.8 mm)에 Hamilton syringe (10 μL, 26G)를 이용하여 5 μL의 수산화 도파민(6-OHDA; 10 μg/mL in normal saline containing 0.2 μg/mL ascorbic acid)을 분당 1 μL의 속도로 주입하였다.
- 광학현미경을 이용하여 흑질의 병변 반대측(우측)과 병변측(좌측)의 TH-면역 양성 반응 세포를 계수하고 백분율로 환산한 뒤 좌우를 비교하여 50% 이상 감소한 경우를 편측 파킨슨병 모델로 확진하였다(Hudson et al., 1993).
- 뇌정위수술후 5 μL의 normal saline containing 0.2 μg/mL ascorbic acid를 주입하여 sham operated rat을 만들어 대조군으로 사용하였다.
- 두 군 모두 뇌정위 수술 전과 수술 21일 후 보행활동을 측정하고 PD군에서 파킨슨병 유발을 확인하는 amphetamine 유발성 행동측정을 하였다. 두 군 모두 뇌정위 수술일로부터 22일 째 뒷다리근인 가자미근과 족척근을 절제하고 뇌를 적출하였다(Figure 1).
- 두 군 모두 뇌정위 수술 전과 수술 21일 후 보행활동을 측정하고 PD군에서 파킨슨병 유발을 확인하는 amphetamine 유발성 행동측정을 하였다. 두 군 모두 뇌정위 수술일로부터 22일 째 뒷다리근인 가자미근과 족척근을 절제하고 뇌를 적출하였다(Figure 1). 편측 파킨슨병 모델쥐에서 파킨슨병유발수술 후에 서서히 흑질치밀부의 도파민성 신경세포의 파괴가 일어나 2주후 그정도가 최대로 나타나고 3주후에 보행장애 및 활동저하가 나타난다(Metz et al.
- 실험 동물의 복강에 럼푼(Rompun, 10 mg/kg)과 졸레틸(Zoletil, 50 mg/kg)을 주입하여 마취시키고 머리를 뇌 정위 고정장치(Stoelting instrument, IL, USA)에 고정하였다. 머리의 피부를 절개하여 두개골을 노출시키고 치과용 드릴로 두개골을 천공하였다. Paxinos과 Watson (2007)의 atlas를 참조하여 좌측 흑질(전정을 중심으로 전방으로 4.
- 주 2회 동일한 시간에 모든 군의 체중을 rat digital balance(대종기기, 서울)를 이용하여 측정하였다. 사료섭취량은 주 2회 제공한 사료무게와 섭취하고 남은 사료무게를 측정한 후 제공한 사료무게에서 섭취하고 남은 사료 무게를 빼서 산출하였다.
- 두 군의 체중의 실험 전후 비교와, PD군의 흑질 병변측과 병변 반대측 도파민 신경세포 수의 비교는 paired t-test로 분석하였다. 수집한 자료가 정규분포함을 확인하였고 in vitro가 아닌 동물실험에서 동물실험의 원칙상 대상자수는 통계분석이 가능한 최소수로 해야 하며 rat의 경우 최소수는 5-10마리이고 모수검증이 가능하다 는 원칙에 의해 모수검정 하였다.
- 순수실험연구로 수행되었으며 실험동물을 두 군에 무작위로 배정하였다. 파킨슨병 유발군(Parkinson’s disease, PD; n=17)은 뇌정위 수술(stereotaxic surgery) 후 수산화도파민을 주입하여 파킨슨병을 유발시킨 군이며, 대조군(sham, S; n=8)은 뇌정위 수술은 동일하나 수술 중 5 μL의 normal saline을 주입한 군이다.
- Ungerstedt (1971)의 모델을 이용하여 편측 파킨슨병을 유발시켰다. 실험 동물의 복강에 럼푼(Rompun, 10 mg/kg)과 졸레틸(Zoletil, 50 mg/kg)을 주입하여 마취시키고 머리를 뇌 정위 고정장치(Stoelting instrument, IL, USA)에 고정하였다. 머리의 피부를 절개하여 두개골을 노출시키고 치과용 드릴로 두개골을 천공하였다.
- 실험대상 쥐들은 온도 22±2℃와 습도 50%, 일주기리듬을 위해 12시간은 밝게 12시간은 어둡게 하는 동일한 환경에 수용하고, 모든 연구대상 쥐들에게 고형사료(Samyang Co., Korea)와 물은 마음대로 먹을 수 있게 하였다.
- 실험 마지막 날에 pentobarbital sodium (50 mg/kg)을 복강내 주사로 투여하여 마취하였다. 양쪽 뒷다리에서 가자미근과 족척근을 절제하여 생리식염수로 세척하고 지방조직과 결체조직을 신중히 잘라내어 microbalance (Mettler PE160, USA)에서 무게를 측정하였다.
- 주 2회 동일한 시간에 모든 군의 체중을 rat digital balance(대종기기, 서울)를 이용하여 측정하였다. 사료섭취량은 주 2회 제공한 사료무게와 섭취하고 남은 사료무게를 측정한 후 제공한 사료무게에서 섭취하고 남은 사료 무게를 빼서 산출하였다.
- 첫째, 편측파킨슨병 모델쥐에서 보행활동저하가 나타나는지를 확인한다.
- Ungerstedt와 Arbuthnott (1970)의 amphetamine 유발성 행동측정으로 편측 파킨슨병 유발을 확인하였다. 편측 파킨슨병 유발 수술 3주 후 amphetamine (3 mg/kg)을 피하 주사하고 30분 후 흰쥐를 직경 40 cm의 투명한 원통에 넣고 관찰하였다. Amphetamine에 의해 도파민 신경세포에서 도파민이 분비되어 선조체를 과도하게 흥분시켜 동물을 병변 반대방향으로 회전운동을 하게 되는 원리로 원통에서 10분간 적응시킨 후 1분 동안 몸 전체가 병변 반대방향으로 회전하는 횟수가 5회 이상인 쥐를 편측 파킨슨병이 유발된 것으로 간주하였다.
- 흑질 치밀부를 TH 면역 염색하여 병변측과 병변 반대측으로 구분하여 제시하였다(Figure 2).
- 흑질의 도파민 신경세포 사멸을 확인하기 위해 뇌를 적출하여 조직절편을 만든 후 tyrosine hydroxylase (TH) 면역 염색을 시행하였다. 근육 절제 후 곧바로 흉곽을 열어 좌심실을 통하여 0.
대상 데이터
- 본 연구는 실험동물 자원 관리원 동물실험 윤리 위원회의 승인을 받은 후 규정에 따라 수행하였다. 본 연구에서 체중 189-202 g의 male Sprague-Dawley 쥐 25마리를 PD군과 S군으로 나누어 각각 17마리, 8마리씩 배정하였으나 편측 파킨슨병 유발 수술과 모의수술 후 각각 1마리씩 사망하였고, 파킨슨병 유발 수술일로부터 21일 경과 후 amphetamine 유발성 행동 측정에서 파킨슨병이 유발되지 않은 6마리를 제외하였으며, 뇌 적출 후 흑질의 도파민 신경세포가 사멸하지 않은 것으로 확인된 쥐 2마리를 제외하여 최종적으로 15마리(PD군 8마리, S군 7마리)를 실험대상으로 하였다.
데이터처리
- 두군의체중, 사료섭취량, 보행활동, 뒷다리근의 근육무게 및 Type I, II 근섬유 횡단면적, PD군의 흑질 도파민 신경세포 수는 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었고 두 군 간의 체중, 사료섭취량, 활동량, 근육무게, Type I, II 근섬유 횡단면적의 차이는 t-test로 분석하였다. 두 군의 체중의 실험 전후 비교와, PD군의 흑질 병변측과 병변 반대측 도파민 신경세포 수의 비교는 paired t-test로 분석하였다. 수집한 자료가 정규분포함을 확인하였고 in vitro가 아닌 동물실험에서 동물실험의 원칙상 대상자수는 통계분석이 가능한 최소수로 해야 하며 rat의 경우 최소수는 5-10마리이고 모수검증이 가능하다 는 원칙에 의해 모수검정 하였다.
- 두군의체중, 사료섭취량, 보행활동, 뒷다리근의 근육무게 및 Type I, II 근섬유 횡단면적, PD군의 흑질 도파민 신경세포 수는 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었고 두 군 간의 체중, 사료섭취량, 활동량, 근육무게, Type I, II 근섬유 횡단면적의 차이는 t-test로 분석하였다.
이론/모형
- Choe 등(2004)의 연구에서 제시된 방법에 따라 근섬유 형태를 Type I과 TypeII로 구분하기 위해 myosin-ATPase 조직화학법을 실시하였다.
- Ungerstedt (1971)의 모델을 이용하여 편측 파킨슨병을 유발시켰다. 실험 동물의 복강에 럼푼(Rompun, 10 mg/kg)과 졸레틸(Zoletil, 50 mg/kg)을 주입하여 마취시키고 머리를 뇌 정위 고정장치(Stoelting instrument, IL, USA)에 고정하였다.
- Ungerstedt와 Arbuthnott (1970)의 amphetamine 유발성 행동측정으로 편측 파킨슨병 유발을 확인하였다. 편측 파킨슨병 유발 수술 3주 후 amphetamine (3 mg/kg)을 피하 주사하고 30분 후 흰쥐를 직경 40 cm의 투명한 원통에 넣고 관찰하였다.
- 면역 염색은 free-floating 방법으로 조직을 cryomicrotome을 이용해 40 μm의 두께로 잘라 흑질이 포함된 부위를 사용하였다.
- 보행활동은 수술 전과 수술 후 21일에 open field activity test(Lee et al., 1997)의 방법에 따라 측정하였다. 7.
성능/효과
- Amphetamine 유발성 행동측정 결과 편측 파킨슨병 유발 수술을 한 쥐 16마리 중 7마리가 분당 5회 이상 회전하였고 병변측(lesioned side)으로 3마리가 분당 5회 이상 회전하여 10마리가 편측 파킨슨병이 유발된 것으로 나타났다.
- Amphetamine 유발성 행동측정으로 편측 파킨슨병이 유발되었다고 확인된 10마리의 쥐에서 흑질 치밀부의 TH 양성 신경세포의수를 측정한 결과 10마리 중 8마리에서 병변측은 62.8±8.2개로 병변 반대측의 148.8±11.6개에 비해 57.8% 유의하게 감소한 것으로 나타나(t=29.498, p<.001) 8마리가 파킨슨병 모델로 확진되었다.
- PD군의 병변 반대측 가자미근 Type I 근섬유 횡단면적 3,980.5±564.26 μm2는 S군의 가자미근 Type I 근섬유 횡단면적 4,796.2±1,275.97 μm2에 비해 17.0% 유의하게 작았고(t=-5.55, p<.001), Type II 근섬유 횡단면적도 3,375.3±255.64 μm2로 S군의 가자미근 Type II 근섬유 횡단면적 4,492.0±865.52 μm2에 비해 24.9% 유의하게 작은 것으로 나타났다(t=-3.05, p=.024).
- 본 연구는 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 파킨슨병 유발 수술일로부터 21일 경과 후 PD군이 S군에 비해 보행활동이 저하됨을 확인하고 보행활동저하가 쥐의 병변 반대측 가자미근의 근육 무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적이 작은 것으로 확인되었다. PD군의 병변 반대측 족척근의 근육무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적은 S군에 비해 유의한 차이가 없었고, 병변 동측 가자미근과 족척근의 근육무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적은 S군에 비해 유의한 차이가 없었다. 이상의 연구결과는 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 병변 반대측 뒷다리에 운동장애가 나타나고 그로 인해 보행활동이 감소되었으며, 보행활동의 저하로 인해 PD군의 병변 반대측 가자미근에 근위축이 유발된다는 근거를 제시한다.
- 두 군 간의 병변 동측 뒷다리근의 Type I, II 근섬유 횡단면적을 비교한 결과, Table 5에 제시된 바와 같이 병변 동측 가자미근과 족척근의 Type I, II 근섬유의 횡단면적은 두 군 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(t=-0.59, p=.565; t=-1.59, p=.136; t=-0.85, p=.413; t=-0.56, p=.584).
- 두 군 간의 병변 동측 뒷다리근의 무게를 비교한 결과, Table 4에 제시된 바와 같이 병변 동측 가자미근과 족척근 무게는 두군 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(t=-0.91, p=.381; t=-1.16, p=.266).
- 본 연구결과 편측 파킨슨병으로 인하여 보행활동이 저하되어 PD군의 병변 반대측 가자미근에 근위축이 발생한 것으로 나타났다. 임상적으로 Lee, Joo, Yong과 Huh (2004)는 좌측 하지에 보행장애가 있는 62세의 반파킨슨-반위축 증후군 환자를 10개월 동안 관찰한 결과 보행장애로 인해 활동저하가 나타남을 보고하였다.
- Wijemanne와 Jankovic (2007)는 반파킨슨-반위축증후군 환자 30명 중 6명의 환자에서 편측 하지에 근위축이 발생하였음을 보고하였다. 본 연구결과와 환자에서의 증례보고를 직접적으로 비교해 볼 수는 없지만 반파킨슨-반위축 증후군 환자에서 병변 반대측 하지근에 위축이 발생하였다는 점에서 본 연구에서 이용한 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 병변 반대측 가자미근에 위축이 발생한다는 연구결과를 지지한다고 생각한다.
- 본 연구는 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 파킨슨병 유발 수술일로부터 21일 경과 후 PD군이 S군에 비해 보행활동이 저하됨을 확인하고 보행활동저하가 쥐의 병변 반대측 가자미근의 근육 무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적이 작은 것으로 확인되었다. PD군의 병변 반대측 족척근의 근육무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적은 S군에 비해 유의한 차이가 없었고, 병변 동측 가자미근과 족척근의 근육무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적은 S군에 비해 유의한 차이가 없었다.
- 본 연구에서 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 파킨슨병 유발 21일 후 보행활동이 감소하여 병변 동측 뒷다리에도 근위축이 발생될 것이라고 가정하였으나 병변 동측 가자미근의 무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적, 족척근의 Type I 근섬유 횡단면적이 감소하는 경향만 보였다. 이러한 결과는 병변 동측 다리는 파킨슨병에 의한 운동장애의 영향을 적게 받고, 자세 유지와 보행 시에 병변 동측 다리를 더 많이 사용한다는 Miklyaeva 등(1995)의 선행연구 결과를 토대로, 편측 파킨슨병 모델 쥐의 보행활동은 감소하였지만 보행 시 병변 반대측 뒷다리근의 수축작용이 유지되어 근위축이 발생하지 않은 것으로 이해된다.
- 본 연구에서는 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 파킨슨병 유발 수술일로부터 21일 경과 후 병변 반대측 가자미근의 근육 무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적이 대조군에 비해 작은 것으로 나타나 PD군의 병변 반대측 가자미근에 근위축이 유발되었음을 제시한다. 이러한 근위축은 본 연구에서 PD군의 보행활동이 S군에 비하여 유의하게 작은 것으로 나타났고 사료섭취량은 P군과 S군 간에 차이가 없었으므로 보행활동저하가 근위축을 발생시켰을 것이라고 생각한다.
- 두 군의 실험시작 시 체중과 근육절제 직전 체중은 Table 1에 제시된 바와 같다. 실험시작 시 체중과 근육절제 직전 체중은 두 군 간에 차이가 없었다(t=-1.21, p=.248, t=0.16, p=.874). PD군의 근육절제 직전 체중 346.
- PD군의 병변 반대측 족척근의 근육무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적은 S군에 비해 유의한 차이가 없었고, 병변 동측 가자미근과 족척근의 근육무게와 Type I, II 근섬유 횡단면적은 S군에 비해 유의한 차이가 없었다. 이상의 연구결과는 편측 파킨슨병 모델 쥐에서 병변 반대측 뒷다리에 운동장애가 나타나고 그로 인해 보행활동이 감소되었으며, 보행활동의 저하로 인해 PD군의 병변 반대측 가자미근에 근위축이 유발된다는 근거를 제시한다.
후속연구
- 이러한 결과는 파킨슨병 발병 후 활동에 지속적인 관심을 기울여야 할 필요성을 제시한다. 또한 앞으로 파킨슨병 발병 후 활동을 증가시키는 것이 하지근 위축 발생을 감소시키는지에 대한 연구가 이루어 져야 할 것으로 본다.
- 본 연구의 제한점은 수술 자체가 근육무게와 Type I, II 근섬유 단면적에 어떻게 영향을 미쳤는지를 알 수 없으므로 non sham operation군을 포함하지 않았다는 점이다.
- 이상의 결론을 토대로 임상실무에서 간호사는 파킨슨병 환자의 하지근육에 근위축이 발생하는지를 사정해야 하며 파킨슨병으로 인한 하지근육의 근위축을 경감시키는 간호중재 개발이 필요함을 제언한다.
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