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문제 정의
- 질병이다. 본 연구에서는 광견병바이러스에 특이적으로 반응하는 단크론항체를 생산하여 이들의 특성을 규명하고 진단활용 가능성에 대하여 실험하였다.
- 이 연구에서는 광견병바이러스에 대한 특이 단크론항체를 생산하여 특성을 규명하고 광견병의 진단에 있어서 이들 단크론항체의 활용성을 확인하기 위해 실험을 수행하였다.
- 이 과정을 위해 이용되는 간접형광항체법, 면역조직화학법 그리고 혈청학적 방법을 실시하기 위해서는 바이러스에 대한 단크론항체가 필수적이다. 이 연구에서는 광견병바이러스에 대한 특이적인 단크론항체를 생산하여 특성을 규명하고, 광견병의 진단에 있어서 이들 단크론항체의활용성을 확인하였다.
제안 방법
- 1시간 반응 후, PBS로 3회 세척하고 fluorescein labeled goat anti-mouse IgG (H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA)을 첨가하여 다시 30분 동안 같은 온도에서 반응시켰다. 30분 후 세포를 PBS로 세척하고 형광현미경으로 관찰하여 형광을 나타내는 well의 hybridoma를 광견병 바이 러스 특이 단크론항체 양성으로 판정하였다.
- 1:100으로 희석한 각각의 단크론항체에 동량의 광견병바이러스(l()2FFU/ml)를 섞어 37°C에서 1시간 반응 시킨 후 BHK-21 세포가 단층 배양되어 있는 96-well plate에 접종하여 37°C, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 80% acetone을 이용하여 배양세포를 고정하고 광견병바이러스에 특이적인 단크론항체와 fluorescein labeled goat anti-mouse IgG (H+L)을 이용하여 형광염색한 후 결과를 확인하였다.
- 분양받아 사용하였다. 광견병 바이러스는 baby hamster kidney 21 (BHK-21) 세포를 이용하여 증식시켰으며 BHK-21 세포는 5% 소태아혈청 (fetal calf serum, FCS)과 항생제 (200 IU penicillin, 0.4mg streptomycin/ml)가 함유된 alpha minimum essential medium (a-MEM, Sigma, USA)을 사용하여 37°C에서 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 세포융합에 사용된 myeloma 세포는 SP2/0 세포를 이용하였으며 10% FCS가 함유된 RPMI 1640 (Invitrogen, USA)배지를 이용하여 37°C에서 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- 광견병바이러스로 면역시킨 mouse를 사용하여 세포융합을 수행하여 10개의 광견병바이러스 특이 단크론항체를 생산하였다.
- 4㎛ aminopterin, 16jiM thymidine)가 함유된 RPMI 1640 배지에 부유시킨 다음 96-welI plate에 well 당 100㎕씩 분주하여 37°C, 5% CO2 조건 하에서 배양하고 배양 후 3, 5, 7 및 9일에 새로운 배지로 교환하였다. 배지 교환 후 hybridoma 세포가 well의 30% 이상 증식하였을 때 간접형광항체법(IFA)을 이용하여 광견병바이러스 특이 hybridoma를 선별하였다.
- 생산된 단크론항체의 조직 내에서 반응성을 확인하기 위해 광견병바이러스에 감염된 소의 뇌 조직을 이용하여 면 역 조직 화학염 색 법 (immunohistochemistry assay: IHC)을 다음과 같이 실시하였다. 즉, 감염된 조직을 10% neutral buffered formalin 용액으로 48시간동안 고정시킨 후 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 조직 절편을 준비하였다.
- 광견병바이러스를 접종하여 면역된 mouse의 비장과 서혜림프절로부터 준비한 세포와 SP2/O 세포를 polyethylene glycol (PEG) 1500 (Roche Diagnostics GmbH, Germany)을 시- 용하여 일반적 인 세포융합 방법(Kang 등, 1989; Kohler 와 Milstein, 1975)에 따라 실험하였다. 세포융합이 끝난 혼합세포액은 20% FCS와 HAT (50nM hypoxan thine, 0.4㎛ aminopterin, 16jiM thymidine)가 함유된 RPMI 1640 배지에 부유시킨 다음 96-welI plate에 well 당 100㎕씩 분주하여 37°C, 5% CO2 조건 하에서 배양하고 배양 후 3, 5, 7 및 9일에 새로운 배지로 교환하였다. 배지 교환 후 hybridoma 세포가 well의 30% 이상 증식하였을 때 간접형광항체법(IFA)을 이용하여 광견병바이러스 특이 hybridoma를 선별하였다.
- 즉, 감염된 조직을 10% neutral buffered formalin 용액으로 48시간동안 고정시킨 후 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 조직 절편을 준비하였다. 조직 절편은 0.5% 과산화수소가 함유된 methanol로 30분간 처리하여 조직 내의 pero- xidase의 활성을 제거하고 5% normal goat serum으로 30분 간 처리하여 항체의 비특이적 결합을 제거하였다. 위와 같이 처리된 조직표본에 광견병 특이 단크론 항체를 실온에서 30분 간 반응시 킨 후 washing buffer 로 5회 세척하였다.
- 다음과 같이 접종하였다. 즉, 정제된 항원(50pig/m1)을 Coyle 등(1992)과 Orlik와 Altaner(1988)의 방법을 수정하여 mouse의 foot-pad에 3 일 간격으로 4회 접종하였으며 1차는 Freund's complete adjuvant와 2차부터는 Freund's incomplete adjuvant와 혼합한 항원을 사용하였다.
대상 데이터
- 4mg streptomycin/ml)가 함유된 alpha minimum essential medium (a-MEM, Sigma, USA)을 사용하여 37°C에서 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 세포융합에 사용된 myeloma 세포는 SP2/0 세포를 이용하였으며 10% FCS가 함유된 RPMI 1640 (Invitrogen, USA)배지를 이용하여 37°C에서 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- 세포융합에 사용할 mouse는 4~5주령의 BALB/c strain을 사용하였으며 면역에 사용할 항원은 p- ethyleneimine으로 불활화하여 정제된 바이러스를 사용하여 다음과 같이 접종하였다. 즉, 정제된 항원(50pig/m1)을 Coyle 등(1992)과 Orlik와 Altaner(1988)의 방법을 수정하여 mouse의 foot-pad에 3 일 간격으로 4회 접종하였으며 1차는 Freund's complete adjuvant와 2차부터는 Freund's incomplete adjuvant와 혼합한 항원을 사용하였다.
- 실험에 사용된 광견병바이러스인 Pasteur strain은 (주)중앙백신연구소에서 분양받아 사용하였다. 광견병 바이러스는 baby hamster kidney 21 (BHK-21) 세포를 이용하여 증식시켰으며 BHK-21 세포는 5% 소태아혈청 (fetal calf serum, FCS)과 항생제 (200 IU penicillin, 0.
이론/모형
- 0이 되도록 접종하여 48 시간 동안 배양하였다. Mouse 면역에 사용된 항원은 광견병바이러스가 감염된 배양 상층액을 Aaslestad와 Wiktor (1972)의 ammonium sulfate 방법을 이용하여 농축하고 정제하였다.
- 광.견병바이러스로 면역시 킨 mouse를 사용하여 일반적인 단크론항체 생산방법을 이용하여 세포융합을 실시하고 광견병바이러스에 특이적인 항체를 생산하는 hybridoma를 간접형광항체법을 이용하여 선발하였다. 생산된 10개의 단크론항체는 형광의 정도에 차이는 있었으나 간접형광항체법에서 양성으로 나타났으며, 단백특이성을 확인한 결과, 2개의 단크론항체가 N protein 에 특이 적으로 나타났다.
- 광견병바이러스를 접종하여 면역된 mouse의 비장과 서혜림프절로부터 준비한 세포와 SP2/O 세포를 polyethylene glycol (PEG) 1500 (Roche Diagnostics GmbH, Germany)을 시- 용하여 일반적 인 세포융합 방법(Kang 등, 1989; Kohler 와 Milstein, 1975)에 따라 실험하였다. 세포융합이 끝난 혼합세포액은 20% FCS와 HAT (50nM hypoxan thine, 0.
- 광견병에 감염이 확인된 생체조직이 있으면 이들을 동결절편으로 처리한 후 본 연구에서 생산한 단크론항체를 이용하여 간접형광항체법으로 확인할 계획이었으나 생체조직의 확보가 불가능하여 광견병으로 진단되어 포르말린으로 처리된 소의 뇌간 조직을 이용하여 면역조직화학염색 법을 적용하였다. 면역 조직화학염색 결과, 생산된 일부 단크론항체가 광견병바이 러스 감염세포를 특이적으로 검출할 수 있었다.
- 단크론항체의 isotype을 확인하기 위해 monoclonal antibody isotyping kit (Sigma)< 이용하여 제조사의 술식에 따라 실험하였다.
- 생산된 단크론항체의 광견병 바이러스 단 백 특이성을 확인하기 위하여 Towbiii 등(1985)의 방법에 따라 Western blotting법을 적용하였다.
- 이 연구에서 생산된 단크론항체의 진단활용 가능성을 알아보기 위하여 면역조직화학염색법을 적용하였다. 광견병에 감염이 확인된 생체조직이 있으면 이들을 동결절편으로 처리한 후 본 연구에서 생산한 단크론항체를 이용하여 간접형광항체법으로 확인할 계획이었으나 생체조직의 확보가 불가능하여 광견병으로 진단되어 포르말린으로 처리된 소의 뇌간 조직을 이용하여 면역조직화학염색 법을 적용하였다.
성능/효과
- 10개의단크론항체 중 1개 (5B1) 의 isotype은 IgM, 4개 (3B4, 5C1, 5G3, 6H4)는 IgGl, 1 개(2B9)는 IgG2a 그리고 4개 (3F5, 5E7, 7A9, 7F7)는 IgG2b로 확인되 었다.
- IFA 결과, 10개의 단크론항체 중 5B1 와 5C1 을 제외한 8개는 밝은 형광을 보이는 양성을 나타냈으나, 5B1과 5C1 은 다른 단크론항체와 비교하였을 때 약한 형광을 보였다(Fig. 1).
- 광견병바이러스에 대한 중화능을 검사한 결과, 10개의 단크론항체 중 5B1 과 5C1 2개에 대해 바이러스 중화 능을 확인하였다.
- 단크론항체의 증화반응성을 확인한 결과, 2개의 단크론항체가 광견병바이러스를 중화시킴을 확인하였다. 광견병에 감염된 소의 뇌간 조직을 사용하여 일부 단크론항체로 면역조직화학염색법을 수행한 결과, 생산된 단크론항체는 광견병 바이 러스 감염세포를 특이 적으로 검출하였다.
- 구의 침윤부위이 관찰되 었으며 연수(medulla oblon gata) 에 있는 신경세포의 세포질과 neutrophil에서 갈색의 양성반응이 나타나 단크론항체 6H4가 감염 세포를 특이 적으로 검출하는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 생산된 10개의 단크론항체는 형광의 정도에 차이는 있었으나 간접형광항체법에서 양성으로 나타났으며, 단백특이성을 확인한 결과, 2개의 단크론항체가 N protein 에 특이 적으로 나타났다. 단크론항체의 증화반응성을 확인한 결과, 2개의 단크론항체가 광견병바이러스를 중화시킴을 확인하였다. 광견병에 감염된 소의 뇌간 조직을 사용하여 일부 단크론항체로 면역조직화학염색법을 수행한 결과, 생산된 단크론항체는 광견병 바이 러스 감염세포를 특이 적으로 검출하였다.
- 광견병에 감염이 확인된 생체조직이 있으면 이들을 동결절편으로 처리한 후 본 연구에서 생산한 단크론항체를 이용하여 간접형광항체법으로 확인할 계획이었으나 생체조직의 확보가 불가능하여 광견병으로 진단되어 포르말린으로 처리된 소의 뇌간 조직을 이용하여 면역조직화학염색 법을 적용하였다. 면역 조직화학염색 결과, 생산된 일부 단크론항체가 광견병바이 러스 감염세포를 특이적으로 검출할 수 있었다. 이로써 생산된 단크론항체의 진단활용 가능성이 확인되었다’ 또한, 생산된 두개의 단크론항체 5G3와 6H4는 N protein에 단백특이성을 보이고 5B1 과 5C1 은 G pro-tein에 대한 단백특이성이 추정되어 이들 단크론항체들을 이용하여 특이 epitope과 중화관련 epitope의 규명을 실시하여 광견병바이러스의 항원구조분석에 이용이 가능할 것으로 보인다.
- 견병바이러스로 면역시 킨 mouse를 사용하여 일반적인 단크론항체 생산방법을 이용하여 세포융합을 실시하고 광견병바이러스에 특이적인 항체를 생산하는 hybridoma를 간접형광항체법을 이용하여 선발하였다. 생산된 10개의 단크론항체는 형광의 정도에 차이는 있었으나 간접형광항체법에서 양성으로 나타났으며, 단백특이성을 확인한 결과, 2개의 단크론항체가 N protein 에 특이 적으로 나타났다. 단크론항체의 증화반응성을 확인한 결과, 2개의 단크론항체가 광견병바이러스를 중화시킴을 확인하였다.
- 또한. 생산된 단크론항체의 바이 러스에 대한 중화능을 조사한 결과, 5BI과 5CI 이 광견병 바이러스를 중화시킴을 확인하였다. 이것으로부터 5B1 과 5C1 은 광견병바이러스의 단백질 중 중화항체 생산을 유도하는 G protein에 대한 단크론항체인 것으로 추측할 수 있다(Cox 등, 1977).
- 이 연구에서 생산된 광견병바이러스에 특이적인 10개의 단크론항체(2B9. 3B4, 3F5, 5B1, 5C1, 5E7, 5G3,6H4, 7A9, 7F7)는 형광의 밝음에서 약간의 차이는 있었으나 모두 광견병바이러스에 감염된 세포에서 양성으로 나타났다. 그러나 단백특이성을 확인한 결과,5G3와 6H4만이 N protein에 특이성을 보이고 나머지는 반응성을 보이지 않았다 이는 이들 단크론항체에 의해 인지되는 epitope이 Western 비이ting을 위하여 바이러스 시료를 처리할 때 구조상의 변화를 초래하여 더 이상 단크론항체에 의하여 인지되지 못하기 때문으로 추정할 수 있다.
후속연구
- 국내에서는 감염 위험성이 있는 동물에 대한 광견병 예방접종 실시, 미끼예방약을 이용한 야생동물에 대한 예방접종실 시, 감염 위험지역의 혈청학적 감시를 통해 국가적으로 광견병에 대한 방역을 실시하여 광견병의 발생 빈도가 현저히 줄었지만, 그럼에도 불구하고 발생이 지속되고 있다. 광견병으로 인한 피해를 최소화하기 위해서 지속적인 방역정책의 실시가 필요할 것이다.
- 단크론항체를 이용한 광견병의 진단법을 실용화하고 민감도와 특이도를 높이기 위하여 국내에서 분리된 여러 가지 광견병바이러스와의 교차반응성 확인과 가검물에 대한 추가 적용실험이 필요할 것으로 사료된다.
- Western blotting 실험결과 음성으로 나타난 8개의 단크론항체(2B9, 3B4, 3F5, 5B1, 5C1, 5E7, 7A9, 7F7)는 본 연구에서 광견병바이러스 단백특이성을 확인하지 못하였는데 중화능력이 없는 6개의 단크론항체(2B9,3B4, 3F5, 5E7, 7A9, 7F7)는 광견병바이러스의 N pro- tein이나 M protein에 특이적이거나 G protein에서 중화항체 형성과 관계가 없는 epitope에 대한 항체로 추정할 수 있다. 이들 단크론항체의 단백특이성을 보다 확실하게 확인하기 위하여 감염된 세포를 [35S] cysteine [35S] methionine으로 표지한 후 immunopre cipitation 방법을 실시하면 어느 정도 확인이 가능할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로부터 이 연구에서 생산된 단크론항체들은 광견병의 진단에 유용하게 사용될 것으로 사료된다 .
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