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가설 설정
- 가능한 기전으로는 1) glucose 대사 과정 중의 하나인 hexose monophosephate shunt을 통한 NADPH의 공급 증가(Gupte, 2008), 2) 항산화 효소의 발현 또는 활성 증가(Nguyen et al., 2009), 3) 세포 사멸과정을 매개하는 세포신호전달체계의 억제 또는 세포생존과 관련된 세포신호전달체계의 활성화(Raju and Mehta, 2009) 등이 가능할 것이다. 이후 연구는 Po-PG와 T-PG에서 단일 성분을 분리 하여 간접적인 경로를 통한 세포보호효과에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
제안 방법
- 산화적 스트레스의 정도에 따라서 세포는 반응하여 회복하거나 손상을 입을 수 있으며 손상이 심할 경우 세포의 사멸을 초래한다(Spector, 2000). TOSC는 hydroxyl radical, peroxyl radical과 peroxynitrite 3종류의 oxy-radical을 사용하며, 반응계에 도입된 시험물질이 oxy-radical에 의한 ethylene gas 생성을 저해하는 정도를 평가한다. 따라서 기본 반응은 oxy-radical과 α-keto-γ-(methylthio) butyric acid (KMBA)가 반응하여 ethylene gas가 발생하는 것이다.
- 이와 같은 자료들을 토대로 장생도라지의 추출물 중, polysaccharide 분획(Po-PG)과 사포닌 분획(Sa-PG), 그리고 장생도라지의 전체 추출물(T-PG)의 peroxyl radical과 peroxynitrite에 대한 포획능을 TOSC assay를 통해서 평가하였다. 또한 랫트간암 세포주인 H4IIE 세포주에 외부에서 산화성물질인 hydrogen peroxide와 t-BHP을 처리하여 산화적 손상을 유발하고 이 모델에서 장생도라지 분획물의 효과를 평가하였다.
- 이와 같은 자료들을 토대로 장생도라지의 추출물 중, polysaccharide 분획(Po-PG)과 사포닌 분획(Sa-PG), 그리고 장생도라지의 전체 추출물(T-PG)의 peroxyl radical과 peroxynitrite에 대한 포획능을 TOSC assay를 통해서 평가하였다. 또한 랫트간암 세포주인 H4IIE 세포주에 외부에서 산화성물질인 hydrogen peroxide와 t-BHP을 처리하여 산화적 손상을 유발하고 이 모델에서 장생도라지 분획물의 효과를 평가하였다.
- , 1998). 반응은 1 mL의 반응액을 고무마개로 밀폐된 15 mL 용기에 넣어 진행시켰으며 생성된 ethylene은 반응용기의 head space 공기 0.15 mL을 취하여 GC (GC-2010, Shimadzu, Tokyo, Japan)로 분석하여 검출하였다. Oven, injector와 flame ionization detector의 온도를 각각 60℃, 180℃, 180℃로 설정하고 Supelco SPB-1 capillary column (30 m×0.
- SA는 시간에 따른 sample의 적분 값이고, CA는 시간에 따른 control의 적분 값이다. Control로는 3차 증류수를 사용하였으며 시료로는 도라지 추출물들 외에 양성대조군으로 GSH를 사용하였다. 따라서 oxy-radical scavenging capacity를 전혀 갖지 못하는 시료의#이 되며 TOSC=0의 값을 갖는다.
- In vitro 조건에서 oxyradical scavenging capacity를 측정하기 위해 TOSC 법을 적용하였으며, 양성대조군으로 GSH를 사용하였다. 장생도라지의 추출물들을 종류마다 여러 가지의 농도로 설정하여 peroxyl radical과 peroxynitrite에 대한 TOSC assay를 실행하였다. Po-PG, Sa-PG와 T-PG를 사용한 실험에서는 KMBA가 산화되어 발생하는 ethylene gas를 60분간 측정해서, 대조군 60분에서 나오는 최대 ethylene peak height의 값을 기준으로 모든 실험 데이터를 백분율로 환산하여 시간에 따른 ethylene발생량을 계측하였다.
- 장생도라지의 추출물들을 종류마다 여러 가지의 농도로 설정하여 peroxyl radical과 peroxynitrite에 대한 TOSC assay를 실행하였다. Po-PG, Sa-PG와 T-PG를 사용한 실험에서는 KMBA가 산화되어 발생하는 ethylene gas를 60분간 측정해서, 대조군 60분에서 나오는 최대 ethylene peak height의 값을 기준으로 모든 실험 데이터를 백분율로 환산하여 시간에 따른 ethylene발생량을 계측하였다. 이 그래프들의 AUC를 가지고 공식을 이용해서 계산한 TOSC value를 농도에 따라 다시 그래프를 도시하여 나온 추세선의 기울기를 구하여 mg/mL당 TOSC value인 specific TOSC value를 산출해서 도표로 도시하여 각 추출물끼리 비교하였다(Table 1, 2).
- Po-PG, Sa-PG와 T-PG를 사용한 실험에서는 KMBA가 산화되어 발생하는 ethylene gas를 60분간 측정해서, 대조군 60분에서 나오는 최대 ethylene peak height의 값을 기준으로 모든 실험 데이터를 백분율로 환산하여 시간에 따른 ethylene발생량을 계측하였다. 이 그래프들의 AUC를 가지고 공식을 이용해서 계산한 TOSC value를 농도에 따라 다시 그래프를 도시하여 나온 추세선의 기울기를 구하여 mg/mL당 TOSC value인 specific TOSC value를 산출해서 도표로 도시하여 각 추출물끼리 비교하였다(Table 1, 2).
- The sTOSC values were obtained from the slope of the linear regression lines for the TOSC curves, and the rTOSC values were determined by dividing the sTOSC value of the sample by that of GSH. The specific TOSC values of GSH against peroxyl radicals were 1233±217 TOSC/ mg/mL.
- 선행 연구결과를 바탕으로 세포에 적용하기 위한 hydrogen peroxide와 tBHP의 농도와 시간은 각각 0.3 mM과 24시간 그리고 40 μM과 3시간으로 설정하였다.
- 먼저, t-BHP에 의한 세포독성에 대한 세포보호효과를 측정하기 위해서, H4IIE 세포에 여러 농도의 Sa-PG, Po-PG, T-PG, 그리고 NAC을 각각 1시간 동안 전처리한 다음, 40μM의 t-BHP를 처리하여 3시간 후에 생존율을 측정하였다.
- 먼저 Sa-PG, Po-PG와 T-PG의 세포독성을 알아보기 위해서, hydrogen peroxide와 t-BHP의 처리없이 Sa-PG, Po-PG와 T-PG 각각을 단독으로 H4IIE 세포에 24시간 동안 처리하였다. 24시간 동안 SaPG, Po-PG와 T-PG를 처리한 결과에서 H4IIE 세포의 생존율은 대조군을 100.
- Sa-PG, Po-PG와 T-PG의 세포독성을 알아본 후, 각 물질의 최대 처리 농도를 설정하고, hydrogen peroxide와 t-BHP에 의한 세포독성에 대한 Sa-PG, Po-PG와 T-PG, 그리고 양성대조군으로서 NAC의 세포보호효과를 측정하였다. 먼저, t-BHP에 의한 세포독성에 대한 세포보호효과를 측정하기 위해서, H4IIE 세포에 여러 농도의 Sa-PG, Po-PG, T-PG, 그리고 NAC을 각각 1시간 동안 전처리한 다음, 40μM의 t-BHP를 처리하여 3시간 후에 생존율을 측정하였다.
- 전통적으로 민간요법으로 사용되어온 식물들이 간 질환을 포함한 여러 질병을 치료하는 효과가 최근 여러 학자들에 의해 보고되고 있다(Luper, 1998). 본 연구에서는 최근 재배법이 개발된 장생도라지의 추출물을 이용하여 TOSC assay를 통해 in vitro에서의 항산화효과를 측정하고, 랫트의 간암세포인 H4IIE 세포에서 MTT assay를 통해 산화적 스트레스를 유발하는 독성물질에 대한 세포보호효과를 실험하였다.
- TOSC assay는 in vitro에서 peroxyl radical과 peroxynitrite에 대한 Po-PG, Sa-PG와 T-PG의 정량적인 항산화효과를 평가하였다. Peroxyl radical을 사용한 TOSC assay 결과에서 Sa-PG의 specific TOSC value는 Po-PG와 T-PG보다 훨씬 큰 값을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용한 GSH의 약 0.
- Oven, injector와 flame ionization detector의 온도를 각각 60℃, 180℃, 180℃로 설정하고 Supelco SPB-1 capillary column (30 m×0.32 mm×0.25 μm)를 장착한 gas chromatograph 장치를 사용하였다.
- 장생도라지의 추출물인 Po-PG, Sa-PG와 T-PG의 산화적 스트레스에 의한 세포독성 억제효과를 측정하고자, 랫트의 간암 세포인 H4IIE 세포를 사용해서 MTT assay를 실행하였다. 산화적 스트레스를 유발하기 위해서 hydrogen peroxide와 유기 과산화물인 t-BHP를 사용하였다.
- Hydrogen peroxide에 의한 세포독성에 대한 세포보호효과를 측정하기 위해서, H4IIE 세포에 여러 농도의 Sa-PG, Po-PG, T-PG를 각각 1시간 동안 전 처리한 다음, 0.3 mM의 hydrogen peroxide를 처리하여 24시간 후에 생존율을 측정하였다. Sa-PG의 경우, 대조군이 100.
- 세포에서의 산화적 스트레스에 대한 장생도라지의 세포보호효과를 알아보기 위해서 hydrogen peroxide와 t-BHP를 사용한 MTT assay를 실행하였다. Hydrogen peroxide는 in vivo에서 peroxisome이나 glucose oxidase, amino acid oxidase 같은 여러 산화 효소들, 또는 superoxide dismutase에 의한 superoxide radical의 dismutation에 의해서 생성된다(Magalhães et al.
- MTT assay를 이용하여 t-BHP 또는 hydrogen peroxide에 의해 유발된 산화적 손상 모델에서 PoPG, Sa-PG와 T-PG의 세포보호효과를 평가하였다. t-BHP에 의해 유도된 세포독성에서 Po-PG와 TPG가 유의성 있는 세포보호효과를 나타내었으나 hydrogen peroxide에 의해 유도된 세포독성에서 동일한 효과가 관찰되지 않았다.
대상 데이터
- 세포배양을 위한 DMEM과 fetal bovine serum (FBS)은 HyClone (Logan, UC)에서 구입하였으며 항생제는 Gibco (Invitrogen Corporation, CA)의 100 U/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 사용하였다.
- 사포닌 분획, 다당류 분획, 그리고 전체 추출물들은 한국생명공학연구원에서 제공받았다. 장생도라지(22년생)는 경상남도 진주시 인근에서 재배된 것으로 장생도라지(주)로부터 공급받았다.
- 사포닌 분획, 다당류 분획, 그리고 전체 추출물들은 한국생명공학연구원에서 제공받았다. 장생도라지(22년생)는 경상남도 진주시 인근에서 재배된 것으로 장생도라지(주)로부터 공급받았다. In vitro 항산화효과를 측정하기 위한 실험에서, glutathione(GSH), N-acetylcysteine (NAC), alpha-keto-gamma-(methylthio)butyric acid (KMBA)와 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1)는 Sigma (St.
- 세포배양을 위한 DMEM과 fetal bovine serum (FBS)은 HyClone (Logan, UC)에서 구입하였으며 항생제는 Gibco (Invitrogen Corporation, CA)의 100 U/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 사용하였다. 이외에 30% hydrogen peroxide (H2O2)는 MERCK (Darmstadt, Germany)의 것을 사용하였다.
- 랫트의 hepatoma cell line인 H4IIE cell을 10% heat-inactivated FBS와 100 units/mL의 penicillin, 100 μg/mL의 streptomycin을 포함하는 DMEM을 배지로 이용하여 온도 37℃와 5% CO2 조건에서 배양했다.
- 예비실험을 통해 tBHP는 40 μM 그리고 과산화수소는 300 μM을 선정하였다.
- 반응 후 배지를 제거하고 DMSO를 처리한 후 micro plate reader (TECAN)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정했다. 양성대조군으로 Nacetylcysteine (NAC)를 사용하였다.
- 장생도라지의 추출물인 Po-PG, Sa-PG와 T-PG의 산화적 스트레스에 의한 세포독성 억제효과를 측정하고자, 랫트의 간암 세포인 H4IIE 세포를 사용해서 MTT assay를 실행하였다. 산화적 스트레스를 유발하기 위해서 hydrogen peroxide와 유기 과산화물인 t-BHP를 사용하였다. 선행 연구결과를 바탕으로 세포에 적용하기 위한 hydrogen peroxide와 tBHP의 농도와 시간은 각각 0.
- TOSC assay에서 사용되는 radical에는 hydroxyl radical, peorxyl radical, peroxynitrite 3종류가 있으나(Regoli and Winston, 1999), 본 연구에서는 peroxyl radical과 peroxynitrite를 사용하였다. Peroxyl radical은 지질산화연쇄반응(lipid oxidation chain reaction)에 의해 형성된다.
- In vitro 항산화효과를 측정하기 위한 실험에서, glutathione(GSH), N-acetylcysteine (NAC), alpha-keto-gamma-(methylthio)butyric acid (KMBA)와 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1)는 Sigma (St. Louis, MO)의 제품을 사용하였으며, potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)와 dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4)는 Junsei (Tokyo, Japan)의 제품을 사용하였고, 2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (ABAP)와 t-BHP는 Aldrich (St. Louis, MO)의 제품을, Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)는 Fluka (St. Louis, MO)의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 통계적 유의성은 ANOVA test 후 Newman-Keuls multiple comparison test 또는 Dunnett’s test를 이용하여 유의성을 확인하였다.
- 반대로 #일 때는 TOSC 값은 100에 접근한다. Specific TOSC 값은 얻어진 TOSC 값을 시험물질에 농도에 따라 좌표화하고 선형회귀분석(linear regression analysis)을 통해 기울기를 얻은 후 이 값을 시험물질의 농도로 나누어 구하였다. TOSC 값은 대조군에서의 값과 비교하게 되므로 이론적으로 기기의 감도나 사용시약, 기타 반응조건에 영향을 받지 않는다.
- 모든 결과는 평균과 표준 편차로 표시하였다. Specific TOSC value를 구하기 위해서 농도변화에 따른 TOSC value의 점 그래프에서 선형회귀분석을 수행하였다.
- 모든 결과는 평균과 표준 편차로 표시하였다. Specific TOSC value를 구하기 위해서 농도변화에 따른 TOSC value의 점 그래프에서 선형회귀분석을 수행하였다. 선형회귀분석에서 얻어진 기울기로부터 specific TOSC value를 계산하였다.
- Specific TOSC value를 구하기 위해서 농도변화에 따른 TOSC value의 점 그래프에서 선형회귀분석을 수행하였다. 선형회귀분석에서 얻어진 기울기로부터 specific TOSC value를 계산하였다. 통계적 유의성은 ANOVA test 후 Newman-Keuls multiple comparison test 또는 Dunnett’s test를 이용하여 유의성을 확인하였다.
- Values with different superscripts (a, b) are significantly different from each other (ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test, P<0.001).
- *,**,***Significantly different from levels monitored in cells treated with H2O2 only, control cells, <0.05, P<0.01 or P<0.001, respectively (ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test).
- *,**,***Significantly different from levels monitored in cells treated with H2O2 only, control cells, P<0.05, P<0.01 or P<0.01, respectively (ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test).
이론/모형
- TOSC assay는 Regoli와 Winston (1999)에 의해 제안된 방법을 사용하여 실시했다. Peroxyl radical은 ABAP를 35℃에서 thermal homolysis시켜 발생시켰다(Winston et al.
- In vitro 조건에서 oxyradical scavenging capacity를 측정하기 위해 TOSC 법을 적용하였으며, 양성대조군으로 GSH를 사용하였다. 장생도라지의 추출물들을 종류마다 여러 가지의 농도로 설정하여 peroxyl radical과 peroxynitrite에 대한 TOSC assay를 실행하였다.
성능/효과
- 또한 in vitro에서 수행된 연구에서 사포닌에 의한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical과 superoxide radical의 포획능이 보고되었다. In vivo 실험에서 장생도라지 사포닌 성분을 전처리한 후 tBHP를 투여하였을 때 혈청 중의 ALT와 AST의 증가를 막았으며, 간에서의 산화적 스트레스를 감소시키는 것으로 관찰되었다. 이상의 결과는 장생도라지의 사포닌 성분이 oxygen free radical을 제거할 수 있고, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있다는 것을 시사한다(Lee et al.
- Peroxynitrite에 대한 Po-PG, Sa-PG, T-PG과 GSH의 specific TOSC value는 각각 51.6±21.5 TOSC/ mg/mL, 982.4±69.1 TOSC/mg/mL, 348.0±24.1 TOSC/mg/mL과 352±42 TOSC/mg/mL로 측정되었다.
- Peroxyl radical에 대한 Po-PG, Sa-PG, T-PG과 GSH의 specific TOSC value는 각각 172.4±49.1 TOSC/mg/mL, 706.7±144.6 TOSC/mg/mL, 144.6±33.1 TOSC/mg/mL과 1233±217 TOSC/mg/mL로 측정되었다.
- PoPG과 T-PG의 peroxyl radical 포획능은 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 1). 장생도라지 추출물은 모두 GSH에 비하여 0.57에서 0.12의 rTOSC 값을 보여 GSH에 비해 미약한 peroxyl radical 포획능을 나타내었다.
- 또한 이들 물질을 3시간 동안 처리하고 독성을 관찰한 결과 SaPG는 5 μg/mL부터 농도의존적으로 유의적인 세포독성을 보였으며 반면 Po-PG와 T-PG는 10 μg/mL 까지 세포생존율에 변화를 유발하지 않았다(data not shown).
- 24시간 동안 SaPG, Po-PG와 T-PG를 처리한 결과에서 H4IIE 세포의 생존율은 대조군을 100.0±7.3%로 할 경우, PoPG는 100 μg/mL에서 102.7±5.2% (P>0.05)의 결과가 나왔고, T-PG는 100 μg/mL에서 106.6±5.5% (P>0.05)의 결과가 나와서 두 물질의 경우 유의성이 있는 세포독성을 나타내지 않았으나, Sa-PG의 경우 세포 생존율이 1 μg/mL에서 100.8±5.9% (P>0.05), 5 μg/mL에서 102.0±4.5% (P>0.05), 10 μg/ mL에서 91.8±6.1% (P<0.01), 25 μg/mL에서 65.7±3.8% (P<0.001), 50 μg/mL에서 56.1±3.9% (P<0.001), 100 μg/mL에서 32.0±4.1% (P<0.001)의 결과를 나타내어 10 μg/mL 이상에서는 유의성이 있는 세포독성을 나타내었다(Fig. 1).
- 종합적으로 t-BHP에 의해 유도된 세포독성에서 Po-PG와 T-PG가 0.1μg/mL 이상의 농도에서 유의성 있는 세포보호효과를 나타냈다.
- TOSC assay는 in vitro에서 peroxyl radical과 peroxynitrite에 대한 Po-PG, Sa-PG와 T-PG의 정량적인 항산화효과를 평가하였다. Peroxyl radical을 사용한 TOSC assay 결과에서 Sa-PG의 specific TOSC value는 Po-PG와 T-PG보다 훨씬 큰 값을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용한 GSH의 약 0.57배의 값을 나타냈다. 반면에, Po-PG와 T-PG의 specific TOSC value는 각각 GSH의 약 0.
- 12배를 나타냈다. Peroxynitrite를 사용한 TOSC assay 결과에서는 Sa-PG의 specific TOSC value가 Po-PG와 T-PG보다 훨씬 큰 값을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용한 GSH의 약 2.8배의 값을 나타냈다. T-PG의 specific TOSC value는 GSH의 약 1.
- 1배를 나타냈다. 이를 통해서 도라지의 추출물 분획 중 사포닌 분획이 in vitro에서 항산화효과가 큰 것을 알 수 있었다.
- 장생도라지 추출물을 이용한 in vitro TOSC 결과와 t-BHP에 의해 유도된 산화적 손상에서 세포보호 효과는 차이를 보였다. Sa-PG의 경우에는 radical을 scavenging하는 효과는 컸지만, t-BHP나 hydrogen peroxide을 처리하여 유발시킨 산화적 손상 모델에서 랫트 간암세포인 H4IIE 세포를 보호하지 못 하였다.
- 또한 간암세포에서의 세포독성 효과는 추후 장생도라지의 사포닌 분획이 항암 또는 항암보조제로 사용될 수 있음을 시사한다. Po-PG와 T-PG의 경우에는, 직접적인 항산화효과는 크지 않지만 효과적으로 t-BHP의 독성을 억제하였다. 본 연구에서 기전을 규명하기 위한 실험은 수행되지 않았으나 Po-PG와 T-PG의 성분 중일부가 직접적인 oxy-radical 포획능은 낮으나 다른 기전을 통해 산화적 손상을 억제할 가능성이 있는 것으로 보인다.
- Po-PG와 T-PG의 경우에는, 직접적인 항산화효과는 크지 않지만 효과적으로 t-BHP의 독성을 억제하였다. 본 연구에서 기전을 규명하기 위한 실험은 수행되지 않았으나 Po-PG와 T-PG의 성분 중일부가 직접적인 oxy-radical 포획능은 낮으나 다른 기전을 통해 산화적 손상을 억제할 가능성이 있는 것으로 보인다. 가능한 기전으로는 1) glucose 대사 과정 중의 하나인 hexose monophosephate shunt을 통한 NADPH의 공급 증가(Gupte, 2008), 2) 항산화 효소의 발현 또는 활성 증가(Nguyen et al.
- Sa-PG는 Po-PG와 T-PG 모두와 비교할 때, 유의성(모두 P<0.001)이 있는 차이를 보이며 보다 월등하게 높은 활성을 보였다.
- 또한 peroxyl radical의 결과와 다르게, T-PG가 Po-PG에 비해 유의성(P<0.001)이 있는 큰 차이를 보이며 큰 값을 나타냈다(Table 2).
- 001)이 있는 큰 차이를 보이며 큰 값을 나타냈다(Table 2). 양성대조군인 GSH와 비하여 T-PG는 동등한 peroxynitrite 포획능을 Sa-PG는 2.8배의 포획능을 그리고 Po-PG는 약 10%의 포획능을 보였다.
후속연구
- 이 결과는 in vitro 실험과 달리 세포 배양계에서는 다양한 요인이 산화적 스트레스 및 항산화활성에 작용함을 시사한다. 또한 간암세포에서의 세포독성 효과는 추후 장생도라지의 사포닌 분획이 항암 또는 항암보조제로 사용될 수 있음을 시사한다. Po-PG와 T-PG의 경우에는, 직접적인 항산화효과는 크지 않지만 효과적으로 t-BHP의 독성을 억제하였다.
- , 2009), 3) 세포 사멸과정을 매개하는 세포신호전달체계의 억제 또는 세포생존과 관련된 세포신호전달체계의 활성화(Raju and Mehta, 2009) 등이 가능할 것이다. 이후 연구는 Po-PG와 T-PG에서 단일 성분을 분리 하여 간접적인 경로를 통한 세포보호효과에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
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