선진 각국에서는 항생제 등 동물용의약품의 사용을 엄격하게 규제하고 있으며, 식품 중 동물용의약품의 잔류허용기준(Maximum Residue Levels, MRLs)을 설정하여 과다한 사용을 억제토록 정책을 유지하고 있다. 우리나라에서도 CODEX 기준을 바탕으로 식품 중 동물용의약품에 대한 MRLs 및 시험방법을 설정하여 식품공전에 제시하고 있으며 HPLC, LC/MS/MS 또는 GC/MS 등 기기의 발달, 분석법의 개발 등으로 기존의 시험법을 대체하거나 효율적인 시험법을 확립함으로써 지속적인 시험법의 개발, 개선향상 및 관리로 안전한 식품관리의 신뢰성 확보가 요구되고 있다. 본 연구에서는 기존의 HPLC/UVD나 유도체화 분석 등을 통해 검출이 어려운 네오마이신과 겐타마이신에 대해 LC/MS를 이용한 동시분석방법을 검토하였으며, 몇 가지 수산물 검체에 대한 적용성을 평가하였다. 대상 수산물은 광어, 우럭, 장어, 대하 등 4종이었으며 전처리 방법으로 추출용매는 2% 아세트산을 함유한 20% 아세토나이트릴과 HLB 카트리지와 WCX 카트리지를 연결하여 사용하였다. LC/MS 동시분석 조건은 이동상으로 용매 A: 5 mM heptafluorobutyric acid, 용매 B: 아세토나이트릴을 이용하여 gradient로 유속은 0.4 mL/min로 하였다. 그 결과, 각 정량기준농도의 0.5, 1, 2, 4배 농도에서 검량선의 직선성($r^2$)은 네오마이신 0.989, 겐타마이신 0.989이었으며 네오마이신의 회수율과 CV는 0.25~1.00 mg/kg에서 각각 92~115% 및 1.3~5.6%, 각 수산물에 대한 LOD와 LOQ는 각각 0.0005~0.0007 mg/kg 및 0.0017~0.0023 mg/kg이었다. 겐타마이신의 회수율과 CV는 0.05~0.20 mg/kg에서 각각 99~116% 및 3.0~22.1%, 각 수산물에 대한 LOD와 LOQ는 각각 0.0017~0.0100 mg/kg 및 0.0056~0.0333 mg/kg이었다. 향후 이들 수산물에 대한 대상 동물용의약품의 MRLs 설정 시 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
선진 각국에서는 항생제 등 동물용의약품의 사용을 엄격하게 규제하고 있으며, 식품 중 동물용의약품의 잔류허용기준(Maximum Residue Levels, MRLs)을 설정하여 과다한 사용을 억제토록 정책을 유지하고 있다. 우리나라에서도 CODEX 기준을 바탕으로 식품 중 동물용의약품에 대한 MRLs 및 시험방법을 설정하여 식품공전에 제시하고 있으며 HPLC, LC/MS/MS 또는 GC/MS 등 기기의 발달, 분석법의 개발 등으로 기존의 시험법을 대체하거나 효율적인 시험법을 확립함으로써 지속적인 시험법의 개발, 개선향상 및 관리로 안전한 식품관리의 신뢰성 확보가 요구되고 있다. 본 연구에서는 기존의 HPLC/UVD나 유도체화 분석 등을 통해 검출이 어려운 네오마이신과 겐타마이신에 대해 LC/MS를 이용한 동시분석방법을 검토하였으며, 몇 가지 수산물 검체에 대한 적용성을 평가하였다. 대상 수산물은 광어, 우럭, 장어, 대하 등 4종이었으며 전처리 방법으로 추출용매는 2% 아세트산을 함유한 20% 아세토나이트릴과 HLB 카트리지와 WCX 카트리지를 연결하여 사용하였다. LC/MS 동시분석 조건은 이동상으로 용매 A: 5 mM heptafluorobutyric acid, 용매 B: 아세토나이트릴을 이용하여 gradient로 유속은 0.4 mL/min로 하였다. 그 결과, 각 정량기준농도의 0.5, 1, 2, 4배 농도에서 검량선의 직선성($r^2$)은 네오마이신 0.989, 겐타마이신 0.989이었으며 네오마이신의 회수율과 CV는 0.25~1.00 mg/kg에서 각각 92~115% 및 1.3~5.6%, 각 수산물에 대한 LOD와 LOQ는 각각 0.0005~0.0007 mg/kg 및 0.0017~0.0023 mg/kg이었다. 겐타마이신의 회수율과 CV는 0.05~0.20 mg/kg에서 각각 99~116% 및 3.0~22.1%, 각 수산물에 대한 LOD와 LOQ는 각각 0.0017~0.0100 mg/kg 및 0.0056~0.0333 mg/kg이었다. 향후 이들 수산물에 대한 대상 동물용의약품의 MRLs 설정 시 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
This paper describes a simultaneous method for the determination of two aminoglycosides (neomycin and gentamicin) using solid phase extraction followed by liquid chromatograph-mass spectrometry. The extract was applied to an WCX and HLB solid phase extraction cartridge. The cartridges were washed wi...
This paper describes a simultaneous method for the determination of two aminoglycosides (neomycin and gentamicin) using solid phase extraction followed by liquid chromatograph-mass spectrometry. The extract was applied to an WCX and HLB solid phase extraction cartridge. The cartridges were washed with water and methanol, and analytes were eluted with TCA buffer-acetonitrile mixture. The aminoglycosides were separated by ion-pairing reversed phase mode prior to ESI-LC/MS. Under the conditions applied neomycin was almost separated from all the gentamicin compounds. No interfering peaks from endogenous compounds of matrix were noted at the elution position of the analytes. Recoveries of neomycin fortified at levels of 0.25, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg seafood samples ranged from 92 to 115%. Recoveries of gentamycin fortified at levels of 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/kg seafood samples ranged from 99 to 116%. Method detection limits in four seafood sample matrices were between 0.002 and 0.033 mg/kg.
This paper describes a simultaneous method for the determination of two aminoglycosides (neomycin and gentamicin) using solid phase extraction followed by liquid chromatograph-mass spectrometry. The extract was applied to an WCX and HLB solid phase extraction cartridge. The cartridges were washed with water and methanol, and analytes were eluted with TCA buffer-acetonitrile mixture. The aminoglycosides were separated by ion-pairing reversed phase mode prior to ESI-LC/MS. Under the conditions applied neomycin was almost separated from all the gentamicin compounds. No interfering peaks from endogenous compounds of matrix were noted at the elution position of the analytes. Recoveries of neomycin fortified at levels of 0.25, 0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg seafood samples ranged from 92 to 115%. Recoveries of gentamycin fortified at levels of 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/kg seafood samples ranged from 99 to 116%. Method detection limits in four seafood sample matrices were between 0.002 and 0.033 mg/kg.
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문제 정의
최근 Oertel 등[Oertel 등, 2004]은 치료 약제의 모니터링과 임상적 및 약리동태학적 연구를 위한 목적으로, 상기의 이온쌍 시약 대신에, hydrophilic interaction chromatography(HILIC)를 사용하여 인체 혈장에서 겐타마이신, 네오마이신을 포함한 6종의 아미노글리코사이드계 동시분석법을 제안한 바 있다. 본 연구에서는 기존의 HPLC/UVD나 유도체화 분석 등을 통해 검출이 어려운 네오마이신과 겐타마이신에 대해 LC/MS를 이용한 동시분석방법을 검토하였으며, 몇 가지 수산물 검체에 대한 적용성을 평가하였다.
본 연구에서는 네오마이신과 겐타마이신에 대한 고상흡착 효율을 위해 이온성 물질을 흡착할 수 있는 양이온교환 충진제인 WCX와 지용성 및 수용성 물질을 흡착할 수 있는 HLB를 2단으로 하여 고상추출 시험을 수행하였으며, 그 결과 수산물 검체에 대해 양호한 회수율 과 재현성 있는 결과를 얻을 수 있었던 것으로 사료된다.
제안 방법
5. 1, 2, 4 STD로 하였다. 각 농도는 네오마이신 정량기준농도를 함유한 시료 2g을 시험절차에 따라 수행하여 시험액 4 mL로 하였을 경우 시험액의 1 STD는 0.
000 mg/L가 된다. 검량선 작성은 0.5, 1, 2, 4 STD를 이용하였다. 검량선의 직선성은 0.
광어, 우럭, 장어 대하의 가식부(머리, 지느러미, 골격, 비늘, 내장 제외)를 적당한 크기로 자른 후 분쇄기에 넣어 균질화 하였다.
시료 분석은 LC/MS(LCMS-2010EV, Shimadzu, Japan)를 사용하였으며, 분석용 컬럼은 ODS 컬럼(FC-ODS, 2.0 mm×150 mm I.D., 3 µm, Shimadzu, Japan), 이 동상으로는 용매 A: 5 mM heptafluorobutyric acid-water, 용매 B: 아세토나이트릴을 이용하여 Gradient(10% B 용매를 15분 동안 40%까지 증가시키고 5분간 유지하였으며 1분간 다시 10%로 감소시킨 후 4분간 유지)를 이용하였으며 유속은 0.4 mL/ min로 하였다.
정제과정은 메탄올 5 mL와 물 5 mL을 1~3 mL/min의 유속으로 HLB 카트리지와 WCX 카트리지를 각각 활성화하고 이를 직렬로 연결하여 사용하였다. 연결된 카트리지에 추출액을 1~3 mL/min의 속도로 천천히 주입하여 흡착시키고, 물 5 mL를 넣어 같은 유속으로 세척하였다.
질량분석기는 ESI 방식으로 이온화시켜 측정하였으며, Spray voltage 4.5 kV, Nebulizer gas(N2) flow 1.5 L/min, Drying gas(N2) pressure 0.1 MPa, Capillary temperature 200℃에서 SIM mode를 이용하여 Neomycin(m/z 308), Gentamicin C1(m/z 478), Gentamicin C2/C2a(m/z 464), Gentamicin C1a(m/z 450)를 정량하여 합한 값으로 나타내었다.
대상 데이터
추출용매는 KH2PO4에 Na2EDTA와 TCA를 첨가하고, pH 4로 조정한 10 mM 인산완충용액 으로 하였다. 고상추출카트리지는 Waters사의 HLB(200 mg, 6 mL) 카트리지와 WCX(150 mg, 6 mL) 카트리지를 이용하였으며, vacuum manifold는 Restek사 제품을 이용하여 각각의 동물용의약품을 흡착시키고, TCA와 아세토나이트릴을 첨가한 증류수를 용출용액으로 하여 용출시켰다. 네오마이신과 겐타마이신의 물리화학적 특성은 Table 1과 같다.
네오마이신, 겐타마이신 각 표준품은 SigmaAldrich사의 제품을 구입하였다. 추출용매는 KH2PO4에 Na2EDTA와 TCA를 첨가하고, pH 4로 조정한 10 mM 인산완충용액 으로 하였다.
네오마이신, 겐타마이신 표준물질 적당량을 각각 정밀히 달아 희석용매(물:아세토나이트릴:아세트산=78:20:2의 부피비)에 녹여 100 µg/mL 표준원액으로 하였다.
네오마이신, 겐타마이신의 동시분석을 위해 ESI-LC/MS를 이용하여 SIM 모드로 수행하였다. 네오마이신은 m/z 308로 정량하였으며, 겐타마이신은 C1, C2/C2a, C1a에 대하여 m/z 478, 464, 450의 각 이온량의 합을 이용하여 정량하였다. 상기의 시험방법에 대한 각 수산물 검체의 정량한계를 확인하기 위하여, 0.
대상 수산물은 광어, 우럭, 대하, 장어로 선정하였으며, 시료는 서울시 소재 수산시장을 방문하여 광어, 우럭, 장어는 활어, 대하는 냉장된 것을 구입하였다. 양식지역은 광어, 우럭, 장어의 경우 남해안이며, 대하는 동남아 국가나 아프리카에서 수입된 것을 사용하였다.
대상 수산물은 광어, 우럭, 대하, 장어로 선정하였으며, 시료는 서울시 소재 수산시장을 방문하여 광어, 우럭, 장어는 활어, 대하는 냉장된 것을 구입하였다. 양식지역은 광어, 우럭, 장어의 경우 남해안이며, 대하는 동남아 국가나 아프리카에서 수입된 것을 사용하였다.
이론/모형
네오마이신, 겐타마이신의 동시분석을 위해 ESI-LC/MS를 이용하여 SIM 모드로 수행하였다. 네오마이신은 m/z 308로 정량하였으며, 겐타마이신은 C1, C2/C2a, C1a에 대하여 m/z 478, 464, 450의 각 이온량의 합을 이용하여 정량하였다.
성능/효과
네오마이신은 m/z 308로 정량하였으며, 겐타마이신은 C1, C2/C2a, C1a에 대하여 m/z 478, 464, 450의 각 이온량의 합을 이용하여 정량하였다. 상기의 시험방법에 대한 각 수산물 검체의 정량한계를 확인하기 위하여, 0.05 mg/kg 수준의 표준물질을 시료에 첨가하여 분석한 결과, 네오마이신은 0.002 mg/kg 수준이었으며, 겐타마이신은 0.006~0.033 mg/kg 수준이었다(Table 2).
후속연구
또한, heptafluorobutyric acid와 ESI-LC/MS를 이용하여 대상 물질을 동시에 분리하여 정량할 수 있었으며, 정량한계는 약 최대 0.04 mg/kg 이하로 향후, 수산물에 대한 네오마이신과 겐타마이신의 규제기준을 마련하는데 있어서 참고자료가 될 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동물용의약품이 사용되는 이유는?
농수축산업 등에서 생선 또는 사육동물의 건강증진, 생산성향상, 자가 치료 및 예방을 목적으로 필수불가결하게 사용되는 동물용의약품은 질병 및 해충의 확산을 방지하고 그로 인한 경제적 손실의 절감효과가 상당할 것으로 추정되고 있으며, 사료생산업체에서 사용하는 많은 항생제는 동물의 내장에 잘 흡착 되지 않고, 대부분 그대로 대변이나 소변으로 배설된다. 또한 많은 국가에서는 비료 보조제로 동물 배설물을 원료로 사용하고 이를 토양에 뿌리고 있어 환경 중 동물용의약품 잔류물질의 영향에 대해서 국제적으로도 관심이 증가하고 있는 추세이다.
농수축산업 등에서 필수불가결하게 사용되는 동물용의약품의 이점은 무엇인가?
농수축산업 등에서 생선 또는 사육동물의 건강증진, 생산성향상, 자가 치료 및 예방을 목적으로 필수불가결하게 사용되는 동물용의약품은 질병 및 해충의 확산을 방지하고 그로 인한 경제적 손실의 절감효과가 상당할 것으로 추정되고 있으며, 사료생산업체에서 사용하는 많은 항생제는 동물의 내장에 잘 흡착 되지 않고, 대부분 그대로 대변이나 소변으로 배설된다. 또한 많은 국가에서는 비료 보조제로 동물 배설물을 원료로 사용하고 이를 토양에 뿌리고 있어 환경 중 동물용의약품 잔류물질의 영향에 대해서 국제적으로도 관심이 증가하고 있는 추세이다.
대부분의 수산용 항생제가 수의사 처방 없이 사용이 가능하기 때문에 나타날 수 있는 문제는?
국내에서 수산용 항생제 판매량은 연간 250톤이 넘으며 매년 증가하는 추세로 수산용 항생제는 수의사의 처방 없이도 대부분 사용이 가능하다[Statiscs Korea, 2007; MFAFF, 2007]. 따라서 예방 및 자가 치료의 목적으로 일반인도 동물약품판매 대리점에서 특별한 구비서류나 절차 필요 없이 자유로이 구입이 가능하여 오남용의 우려가 높다[KAHPA].
참고문헌 (15)
Arnold LS, Robert SD, George RS, David WS, Vassiliki P and Syriopoulou (1988) Gentamicin Penetration into Cerebrospinal Fluid in Experimental Haemophilus influenzae Meningitis, Antimicrob Agents Chemother 32, 1034-1039.
Cohen M, Harrison PF, and Lederberg J (1998) Antimicrobial Resistance: Issues and Options. Division of Health Sciences Policy, pp. 41, Institute of Medicine, National Academy Press, Washington DC.
Korea Animal Health Products Association (KAHPA) http://www.kahpa.or.kr/.
Korea Food and Drug Administration (KFDA) (2007) The Criteria and Specifications of Food. KFDA notice 2007-71, 2007a, Korea.
Korea Food and Drug Administration (KFDA) (2006a) Veterinary drug residue monitoring, pp. 530, KFDA, Volume 10, Korea.
Korea Food and Drug Administration (KFDA) (2006b) Development of an analytical method for the determination of veterinary drug residues in food, pp. 861, KFDA, Volume 10, Korea.
Kummerer K (2004) Resistance in the environment, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 54, 311-320.
Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries (2007) Annual report on Fisheries trends in 2007, Korea.
Ministry of Health, Labour and Welfare (MHLW) (2005) Analytical Methods for Residual Compositional Substances of Agricultural Chemicals, Feed Additives, and Veterinary Drugs in Food. The director notice no.0124001, Japan.
National Veterinary Research & Quarantine Service (NVRQS) (2007) Guidelines on safe use of Veterinary Drugs. The director notice no.2007-25, Korea.
Oertel R, Neumeister V, and Kirch W (2004) Hydrophilic interaction chromatography combined with tandem-mass spectrometry to determine six aminoglycosides in serum, Journal of Chromatography A 1058, 197-201.
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