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문제 정의
- 자트로파는 가뭄과 열의 스트레스에 내성으로 알려져 있으나 어떠한 기작으로 반응하는지는 알려져 있지 않고 이러한 스트레스에 관한 기초적인 자료가 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 다양한 환경 스트레스 중에서 염과 가뭄 스트레스에 대한 생리적 반응과 아쿠아포린의 발현 양상을 검토하여 자트로파의 환경 스트레스 내성 기작 연구의 기초적 자료를 제공하고자 하였다.
- 열대작물인 자트로파의 염과 가뭄 스트레스에 따른 생리적 반응과 유전자 발현의 연구를 통해 바이오에너지 작물로서의 기초적 자료를 얻고자 본 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 1. 100･200･300 mM NaCl의 염 스트레스와 5･10･20･ 30% PEG의 가뭄 스트레스를 처리하여 잎의 생장, 기공의 전도도, 엽록소 형광, 전해질 유출량을 조사하였다. 자트로파의 잎의 생장, 기공의 전도도, 엽록소 형광, 전해질 유출량을 통한 생육조사 결과 가뭄 스트레스보다 염 스트레스에서 더 많은 피해를 입었다.
- Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)은 JcPIP2, 5 ’ - G A A A C G C A A A C T A C C C A T G C - 3 ’ 와 5’-CTGCGGAAAGATCCCAAAG-3’;JcBD1,5’-ATTACG GTTTAGGTGCTGC-3’와 5’-GCTTTGAAGGAGACTGATAC-3’; 18S rRNA, 5’-AGAAACGGCTACCACATC-3’와 5’-CCAAGGTCCAACTACGAG-3’의 프라이머를 사용하여 실시하였다. PCR reaction은 94℃ 3분; 1cycle, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분; 26 cycles, 72℃ 5분; 1cycle의 조건으로 수행하였다.
- Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)은 JcPIP2, 5 ’ - G A A A C G C A A A C T A C C C A T G C - 3 ’ 와 5’-CTGCGGAAAGATCCCAAAG-3’;JcBD1,5’-ATTACG GTTTAGGTGCTGC-3’와 5’-GCTTTGAAGGAGACTGATAC-3’; 18S rRNA, 5’-AGAAACGGCTACCACATC-3’와 5’-CCAAGGTCCAACTACGAG-3’의 프라이머를 사용하여 실시하였다.
- 처리별로 자트로파의 total RNA를 RNeasy plant mini kit(Qiagen, USA)를 이용하여 추출하였다. cDNA의 합성은 PrimerScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit(Takara)를 이용하여 제작하였다. Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)은 JcPIP2, 5 ’ - G A A A C G C A A A C T A C C C A T G C - 3 ’ 와 5’-CTGCGGAAAGATCCCAAAG-3’;JcBD1,5’-ATTACG GTTTAGGTGCTGC-3’와 5’-GCTTTGAAGGAGACTGATAC-3’; 18S rRNA, 5’-AGAAACGGCTACCACATC-3’와 5’-CCAAGGTCCAACTACGAG-3’의 프라이머를 사용하여 실시하였다.
- 엽장은 엽맥의 직선 길이를 측정하였으며, 엽폭은 잎의 가장 넓은 부분의 직선 길이를 측정하였다. 기공 전도도는 steady state diffusion promoter(Decagon Devices, Inc, USA)를 사용하여 오전 11시에서 오후 1시 사이에 잎의 기공 전도도를 측정하였고, 엽록소 형광은 측정 전에 어댑터를 25분간 미리 부착하였고 CF-1000(Morgan Scientific, USA)으로 측정하였다. 잎의 전해질 유출량은 삼각 플라스크에 60 mL의 3차 증류수를 넣고, 잎의 크기를 균일하게 1 cm로 파쇄하여 0.
- 파종 후 20일째, 본엽의 출수 후에 염과 가뭄 스트레스 처리를 하였다. 염 스트레스는 100, 200, 300 mM NaCl, 가뭄 스트레스는 5, 10, 20, 30% polyethylene glycol(PEG3350)을 처리하여 실험을 실시하였다. 모든 실험은 온도 22 ± 1℃, 습도 65%, 일장 16 h light/8 h dark, 광도 60 μmol･m-2 ･s-1를 유지하는 growth chamber에서 수행됐다.
- 염과 가뭄 스트레스는 식물 내에서 수분 스트레스로 작용하므로 수분 수송과 관련된 아쿠아포린의 발현 양상을 조사하였다. 자트로파는 선행 연구에서 아쿠아포린 유전자인 JcPIP2(ABM54183)가 밝혀져 있었고(Zhang et al.
- 잎의 생장률과 기공전도도, 엽록소 형광 측정을 2일 간격 으로 8일까지 제 1 본엽을 선택하여 조사하였다. 엽장은 엽맥의 직선 길이를 측정하였으며, 엽폭은 잎의 가장 넓은 부분의 직선 길이를 측정하였다. 기공 전도도는 steady state diffusion promoter(Decagon Devices, Inc, USA)를 사용하여 오전 11시에서 오후 1시 사이에 잎의 기공 전도도를 측정하였고, 엽록소 형광은 측정 전에 어댑터를 25분간 미리 부착하였고 CF-1000(Morgan Scientific, USA)으로 측정하였다.
- 잎의 생장률과 기공전도도, 엽록소 형광 측정을 2일 간격 으로 8일까지 제 1 본엽을 선택하여 조사하였다. 엽장은 엽맥의 직선 길이를 측정하였으며, 엽폭은 잎의 가장 넓은 부분의 직선 길이를 측정하였다.
- 기공 전도도는 steady state diffusion promoter(Decagon Devices, Inc, USA)를 사용하여 오전 11시에서 오후 1시 사이에 잎의 기공 전도도를 측정하였고, 엽록소 형광은 측정 전에 어댑터를 25분간 미리 부착하였고 CF-1000(Morgan Scientific, USA)으로 측정하였다. 잎의 전해질 유출량은 삼각 플라스크에 60 mL의 3차 증류수를 넣고, 잎의 크기를 균일하게 1 cm로 파쇄하여 0.5 g을 담고 26℃에서 2시간 교반 후 전기전도도(Model 4070, ELE, England)를 측정하였다.
- 염과 가뭄 스트레스는 식물 내에서 수분 스트레스로 작용하므로 수분 수송과 관련된 아쿠아포린의 발현 양상을 조사하였다. 자트로파는 선행 연구에서 아쿠아포린 유전자인 JcPIP2(ABM54183)가 밝혀져 있었고(Zhang et al., 2007), 본 논문에서는 애기장대와 자트로파의 amino acid alignment를 실시하였다. 그 결과 AtPIP2;7(AT4G35100)과 AtPIP2;8(AT2G16850)이 89, 90%로 높은 상동성을 보였고(Fig.
- 유전자 발현을 살펴보기 위해 자트로파의 뿌리, 줄기, 떡잎, 잎은 채취하여 바로 액체질소에 넣고 분석하기 전까지 -80℃에 보관하였다. 처리별로 자트로파의 total RNA를 RNeasy plant mini kit(Qiagen, USA)를 이용하여 추출하였다. cDNA의 합성은 PrimerScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit(Takara)를 이용하여 제작하였다.
- 파종 10일 후에 1/2배 Hoagland solution으로 옮겨 5일 동안 수경재배 조건에서 순화시킨 후 1배 Hoagland solution으로 재배하였다. 파종 후 20일째, 본엽의 출수 후에 염과 가뭄 스트레스 처리를 하였다. 염 스트레스는 100, 200, 300 mM NaCl, 가뭄 스트레스는 5, 10, 20, 30% polyethylene glycol(PEG3350)을 처리하여 실험을 실시하였다.
대상 데이터
- 자트로파 종자(Biji jarak; 인도네시아산)를 상업용 vermiculite에 파종하여, 22 ± 1℃의 온도조건과 60 μmol･m-2 ･s-1의 광조건에서 발아시켰다.
성능/효과
- 2A). 10% 이상의 PEG 처리 구에서는 2일째부터 기공전도도가 60 mmol･m-2s-1 이하로 감소하고, 반면에 5% PEG 처리구는 대조구와 비슷한 수준 으로 실험기간 동안 유지되었다(Fig. 2B). 기공전도도의 측정 결과는 자트로파 잎의 생장 측정 결과(Fig.
- 2. 수분 수송과 관련된 아쿠아포린 중에서 JcPIP2가 뿌리, 줄기, 떡잎 그리고 잎에서 모두 고르게 발현하고 있음을 확인하였다. 잎의 JcPIP2는 대조구와 가뭄 스트레스 처리구에서 모두 발현하는 반면, 200･300 mM NaCl 처리구에서는 잎에서 발현하지 않았다.
- 5A). 200과 300 mM NaCl 염 스트레스 처리구의 뿌리에서는 JcPIP2의 발현이 각각 62, 61%로 증가하였고(Fig. 5B), 이와 동일하게 줄기에서도 JcPIP2의 발현이 각각 20, 15%로 증가하였다(Fig. 5C). 그러나 떡잎에서는 각각 77, 78%로 감소하였고(Fig.
- 3. 염과 가뭄 스트레스에서 JcPIP2가 상반되는 반응을 보이는 것은 JcPIP2가 염 스트레스 관련 주요 내재 단백질과 같은 기능을 하는 것으로 판단된다.
- 4. 자트로파는 염 스트레스보다 가뭄 스트레스에 더 내성을 보이므로 간척지보다는 가뭄지역에서 재배하는 것이 더 유리할 것으로 보인다.
- 고로 JcPIP2의 발현 양상을 관찰하는 것이 스트레스와 아쿠아포린의 관련성을 밝히는데 적합할 것으로 판단되었다.
- , 2007), 본 논문에서는 애기장대와 자트로파의 amino acid alignment를 실시하였다. 그 결과 AtPIP2;7(AT4G35100)과 AtPIP2;8(AT2G16850)이 89, 90%로 높은 상동성을 보였고(Fig. 4A), 계통발생학적 분석에 따라서는 AtPIP2;7과 가장 가까웠다(Fig. 4B). AtPIP2;7는 원형질막 내재 단백질 3(plasma membrane intrinsic protein 3)으로 염 스트레스 관련 주요 내재 단백질로 알려져 있다(Baiges et al.
- 식물은 일반적으로 가뭄과 염 스트레스 둘 다 수분 스트레스로 인식하여 신호 전달 체계가 똑같고 경로의 선택은 그 이후에 일어난다 (Zhu, 2002). 그러나 본 실험의 결과에서는 자트로파가 염에는 피해를 많이 입고 가뭄에는 피해를 덜 입는 생육양상을 나타내었다. 본래 식물은 가뭄과 염 스트레스를 둘 다 수분 스트레스로 인식하지만, 자트로파의 경우에는 가뭄과 염에 의한 수분 스트레스를 인식하는 데 있어 다른 전달 체계가 있을 것이라고 생각된다(Maesa et al.
- 결론적으로 자트로파는 가뭄에 의한 수분 스트레스를 인식하는 정도가 일반 식물보다 덜 민감한 것으로 판단되며, 앞으로 자트로파의 스트레스 조건에 따른 생리반응 신호전달 체계에 보다 구체적인 검토가 필요할 것으로 사료되었다. 따라서 이와 같이 상반되는 특성을 이용하여 자트로파를 바이오 에너지 작물로 재배할 때에는 간척지보다는 가뭄 지역이나 또는 사막화가 진행되고 있는 척박한 땅에서 재배하는 것이 더 유리할 것으로 판단된다.
- 또 엽록소 형광의 측정은 염 스트레스 처리구나 가뭄 스트레스 처리구에서 큰 차이를 보이지는 않았지만, 고농도의 염 스트레스 처리구인 300 mM NaCl에서는 처리 4일째부터 암 적응된 PSII 반응 중심의 엽록소 형광 값(Fv/Fm)이 0.7 이하로 떨어졌고, 8일째에는 0.45로 떨어져 제 2 광계에 피해를 입은 것을 알 수 있었다(Fig. 2C, 2D). 엽록소 형광의 측정은 광합성 초기 광화학반응에 사용되지 못한 빛 에너지의 일부가 다시 빛으로 방출되는 형광값을 측정하는 것이다.
- 5E). 또한, 10, 20, 30% PEG 가뭄 스트레스 처리구의 뿌리에서는 농도 순으로 각각 62, 67, 62%로 JcPIP2의 발현이 증가하였고(Fig. 5B), 줄기에서도 마찬가지로 12, 14, 7%로 증가하였다(Fig. 5C). 그러나 염 스트레스 처리구와 달리 떡잎에서는 발현이 유지되었고(Fig.
- 고로 JcPIP2의 발현 양상을 관찰하는 것이 스트레스와 아쿠아포린의 관련성을 밝히는데 적합할 것으로 판단되었다. 먼저 RT-PCR를 통하여 유전자의 전사 단계에서 JcPIP2가 자트로파의 뿌리, 줄기, 떡잎, 잎 등 모든 기관에서 발현하는 것을 확인하였다(Fig. 4D). 뿌리는 더욱 세분화하여 주근, 측근, 뿌리끝 1 cm 별로 분류하여 유전자의 발현 양상을 조사한 결과 주근과 측근에서 모두 발현하였고, 뿌리 끝에서는 발현하지 않았다(Fig.
- 잎의 기공 전도도는 염과 가뭄 처리구에서 심각한 영향을 받았다. 모든 염 처리구에서 대조구와 비교하여 기공전도도가 현저하게 감소하였다(Fig. 2A). 10% 이상의 PEG 처리 구에서는 2일째부터 기공전도도가 60 mmol･m-2s-1 이하로 감소하고, 반면에 5% PEG 처리구는 대조구와 비슷한 수준 으로 실험기간 동안 유지되었다(Fig.
- JcPIP2가 염 스트레스에는 발현이 감소하였고, 가뭄 스트레스에는 아무런 변화가 없는 것은 앞의 alignment 결과에 따라 AtPIP2;7과 높은 상동성을 가졌기 때문에 염 스트레스 관련 주요 내재 단백질과 같은 기능을 한 것으로 보여진다. 염과 가뭄 스트레스에 따른 아쿠아포린 발현량 조사를 통해서 자트로파가 염 스트레스보다 가뭄 스트레스에 덜 피해를 입는 것을 알 수 있었다. 이는 열대작물의 특징으로써 자트로파가 가뭄 스트레스에 더 내성을 보여주는 것으로 사료된다
- 이러한 결과들을 종합하면 잎의 생장률과 기공전도도의 측정을 통하여 5% PEG 처리에서는 오히려 생장이 촉진되는 것을 확인하였고, 엽록소 형광과 전해질 유출량의 측정을 통하여 10, 20, 30% PEG 처리에서는 식물체가 큰 피해를 입지 않는 것을 보여주었다. 염 스트레스 처리에서도 100 mM NaCl 농도까지는 식물의 생장에 피해가 크지 않았으나, 200 mM NaCl 처리부터 피해가 심각함을 확인하였다.
- 이를 통해 기공전도도가 감소한 100, 200, 300 mM NaCl 처리구와 10, 20, 30% PEG 처리구의 식물은 광합성에 피해를 입었다는 것을 알 수 있었다.
- 4E). 이를 통해 자트로파는 조직 특이적이 아닌 모든 부위에서 동일하게 수분이나 양분을 수송한다는 것을 발견하였다.
- 자트로파에 100, 200, 300 mM NaCl의 염 스트레스와 5, 10, 20, 30% PEG의 가뭄 스트레스를 8일간 처리한 잎과 뿌리 상태는 가뭄 스트레스보다 염 스트레스에서 피해 증상이 심각함을 알 수 있었다(Fig. 1A). 특히 200, 300 mM NaCl 처리 후 1일째부터 바로 잎이 위조되었고 300 mM NaCl 처리구에서는 뿌리가 갈변하여, 가장 심한 피해 증상을 보였다.
- 100･200･300 mM NaCl의 염 스트레스와 5･10･20･ 30% PEG의 가뭄 스트레스를 처리하여 잎의 생장, 기공의 전도도, 엽록소 형광, 전해질 유출량을 조사하였다. 자트로파의 잎의 생장, 기공의 전도도, 엽록소 형광, 전해질 유출량을 통한 생육조사 결과 가뭄 스트레스보다 염 스트레스에서 더 많은 피해를 입었다.
후속연구
- 결론적으로 자트로파는 가뭄에 의한 수분 스트레스를 인식하는 정도가 일반 식물보다 덜 민감한 것으로 판단되며, 앞으로 자트로파의 스트레스 조건에 따른 생리반응 신호전달 체계에 보다 구체적인 검토가 필요할 것으로 사료되었다.
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