URP-PCR핵산지문에 의한 눈꽃동충하초 (Paecilomyces japonica.)와 번데기동충하초(Cordypces militaris) 유전적 다양성분석 Genetic Diversity of Paecilomyces japonica and Cordypces militaris Strains by URP-PCR Fingerprinting원문보기
본 연구는 URP-PCR 핵산지문법을 이용한 Paecilomyces spp.와 Cordyceps spp.의 종간, 종내 유전적 다양성분석을 실시 하였다. 12종류의 20mer의 URP primer가적용된 바 URP2F, URP2R, URP9F, URP4R, URP17R는 종간에 특이적인 PCR다형성밴드를 형성하였으며 Cordypces militaris 균주간에는 4가지 type의 PCR 다형성이 관찰되었다. 그러나 Paecilomyces japonica의 균주내에는 동일한 PCR 다형성을 나타내었다. URP-PCR profile을 이용하여 경동시장에서 수집한 미 동정 동충하초를 동정 할 수 있었다.
본 연구는 URP-PCR 핵산지문법을 이용한 Paecilomyces spp.와 Cordyceps spp.의 종간, 종내 유전적 다양성분석을 실시 하였다. 12종류의 20mer의 URP primer가적용된 바 URP2F, URP2R, URP9F, URP4R, URP17R는 종간에 특이적인 PCR다형성밴드를 형성하였으며 Cordypces militaris 균주간에는 4가지 type의 PCR 다형성이 관찰되었다. 그러나 Paecilomyces japonica의 균주내에는 동일한 PCR 다형성을 나타내었다. URP-PCR profile을 이용하여 경동시장에서 수집한 미 동정 동충하초를 동정 할 수 있었다.
This study was carried out to identify the genetic characteristics among isolates of Paecilomyces spp.and Cordyceps spp. by URP-PCR analysis. Twenty URP (universal rice primer) primers of 20 mer which were designed from repetitive sequence of rice, were used for producing PCR DNA fingerprints of the...
This study was carried out to identify the genetic characteristics among isolates of Paecilomyces spp.and Cordyceps spp. by URP-PCR analysis. Twenty URP (universal rice primer) primers of 20 mer which were designed from repetitive sequence of rice, were used for producing PCR DNA fingerprints of the mushrooms. Of them, 5 URP primers, URP2F, URP2R, URP9F, URP4R, and URP17R amplified genomic DNA of the mushrooms with polymorphic PCR patterns. On isolates of Cordyceps militaris, primers URP1F, URP2R, URP6R and URP17R produced PCR polymorphic bands of 4 types. Isolates of Cordypces sp. that are isolated from different area of Korea were identical to isolate of C. militaris, while other species of Cordypces were different to the PCR profiles. However, the URP primers did not identify the polymorphism of PCR profile on isolates of P. japonica.
This study was carried out to identify the genetic characteristics among isolates of Paecilomyces spp.and Cordyceps spp. by URP-PCR analysis. Twenty URP (universal rice primer) primers of 20 mer which were designed from repetitive sequence of rice, were used for producing PCR DNA fingerprints of the mushrooms. Of them, 5 URP primers, URP2F, URP2R, URP9F, URP4R, and URP17R amplified genomic DNA of the mushrooms with polymorphic PCR patterns. On isolates of Cordyceps militaris, primers URP1F, URP2R, URP6R and URP17R produced PCR polymorphic bands of 4 types. Isolates of Cordypces sp. that are isolated from different area of Korea were identical to isolate of C. militaris, while other species of Cordypces were different to the PCR profiles. However, the URP primers did not identify the polymorphism of PCR profile on isolates of P. japonica.
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문제 정의
본 연구는 URP-PCR방법을 이용한 국내 눈꽃동충하초(P. japonica.)와 번데기동충하초 (C. militaris) 종내 계통의 유전적 다양성을 조사하고 표준지표를 제공하여 균주 또는 품종특이성 확인과 육종의 기초자료로 이용 하고자 실시 하였다.
제안 방법
와 2종 8균주 Paecilomyces spp을 분양 받아 공시 하였다.(Table 1) Genomic DNA를 분리 하기위하여 7일간 PDA (potato dextrose agar)에서 배양한다음 직경 5 mm의 균사체를 50 ml의 PD broth 배지에서 옮긴후 진탕배양 (120 rpm)으로 균주에 따라 20℃에서 30일간 배양 하여 균사체를 여지에 걸러낸다음 동결 건조를 하였다. 동결 건조한 균사체를 이쑤시게로 곱게 마쇄한 다음 100 µg정도를 1.
PCR 반응 용액은 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin, 100 ng prime, 50 ng template DNA, 200 dNTP(dCTP, dTTP, dATP, dGTP), 및 2.5 unit Taq polymerase(Promega)를 넣고 전체 반응용액은 50 µl 가 되게 하였다.
5 unit Taq polymerase(Promega)를 넣고 전체 반응용액은 50 µl 가 되게 하였다. PTC-200(MJ. Reasearch사)의 PCR기기를 이용하여 처음 DNA변성을 위하여 94℃에서 5분간, 그 후 cycle에서 DNA변성은 94℃에서 1분, annealing은 55℃에서 1분 및 DNA합성은 72℃에서 2분으로 총 36 cycle을 실시하였으며, 최종 DNA합성은 5분으로 하였다. 증폭된 PCR 산물은 TBE 완충액(45mM Tris-borate, 1 mM EDTA pH 8.
japonica 균주는 종내 특징적인 PCR 다형성밴드를 형성 함으로서 PCR profile을 이용한종 동정이 가능 할것으로 생각 되었으며 특히 URP2R primer 는 종내 다형성밴드를 형성하여 균주간 strain typing에 유효할것으로 사료 되었다. URP-PCR profile를 이용한 동충하초 균주 동정을 test하기 위하여 동충하초를 경동시장에서 무작위로 수집하여 genomic DNA를 추출하고 URP2R primer 로 PCR증폭하여 C. militaris와 P. japonica의 URP2R-PCR 다형성 밴드와 비교 하였다 (Fig. 3). 경동시장에서 수집한 동충하초는 각각 전형적인 C.
의 PCR핵산지문 분석을 수행 하였다. 우선 다양한 생물종의 핵산지문에 적용 가능한 12종류의 URP primer의 유용성 여부를 알아보기 위하여 P. japonica균주의 genomic DNA를 이용하여 PCR증폭을 실시하였다. 그 결과 URP1F, URP2R, URP17R, URP6R 2.
와 Cordypces spp.의 PCR 다형성 밴드를 조사하고 종간, 또는 종내 계통간 band 유무에 따라 NTSYS-pc의 UPGMA program을 이용하여 dendrogram 을 작성 하였다 (Fig. 2). 그 결과 Cordyceps militaris균주들은 90%이상의 유전적 근연관계를 보이면서 1개 group으로 분류 되었으며 C.
와 Paecilomyces spp.의 PCR핵산지문 분석을 수행 하였다. 우선 다양한 생물종의 핵산지문에 적용 가능한 12종류의 URP primer의 유용성 여부를 알아보기 위하여 P.
와 8균주의 Paecilomyces spp.의 genomic DNA를 증폭하여 종간 균주간 PCR profile을 비교 하였다. Cordypces spp.
와 Cordyceps spp.의 종간, 종내 유전적 다양성분석을 실시 하였다. 12종류의 20mer의 URP primer가적용된 바 URP2F, URP2R, URP9F, URP4R, URP17R는 종간에 특이적인 PCR다형성밴드를 형성하였으며 Cordypces militaris 균주간에는 4가지 type의 PCR 다형성이 관찰되었다.
Reasearch사)의 PCR기기를 이용하여 처음 DNA변성을 위하여 94℃에서 5분간, 그 후 cycle에서 DNA변성은 94℃에서 1분, annealing은 55℃에서 1분 및 DNA합성은 72℃에서 2분으로 총 36 cycle을 실시하였으며, 최종 DNA합성은 5분으로 하였다. 증폭된 PCR 산물은 TBE 완충액(45mM Tris-borate, 1 mM EDTA pH 8.0)에 녹인 1.8%의 agarose gel에 loading한후 5 vol/cm로 전기영동 하였으며, Ethidium bromide용액에 염색 하여 UV lamp하에서 DNA밴드를 확인 하였다.
대상 데이터
10mg/ml RNase 2 µl를 넣어 37℃에서 30분 처리하여 그 용액속에 함유된 RNA를제거 하였다. DNA함량을 측정하기위하여 DNA를 100배로 희석하여 spectrophotometer의 260 nm의 파장에서 실시하였다.
japonica균주의 genomic DNA를 이용하여 PCR증폭을 실시하였다. 그 결과 URP1F, URP2R, URP17R, URP6R 2.0 kb에서 0.3 kb사이5개에서 10여개의 PCR 다형성밴드를 증폭 하였으며 본 연구의 유용 primer로서 이용 되었다. 4종류의 URP primer (URP1, URP2R, URP6R, URP17)로 16균주의 Cordypces spp.
URP-PCR 다형성밴드를 유무로 하여 database 한 후 유사도 (similarity coefficient)를 산출하고 하고, Dendrogram은 위의 유사도의 값을 근거로 UPGA (unweighted paired group methods with arithmatic average)법을 이용 작성 하였다. 유연관계분석을 위한 program은 Ntsys (numerical taxonomy system using multivariate statiscal programs Ver. 1.60)을 이용 하였다.
이론/모형
PCR 핵산지문 분석은 URP-PCR 핵산지문 Kit (JK BioTech)에서 구입하여 제공된 방법에 준하여 실시하였다 PCR 핵산지문 분석은 URP -PCR 핵산지문 Kit(JK BioTech.) 에서 구입하여 제공된 프로토콜에 준하여 수행하였다. PCR 반응 용액은 10 mM Tris-HCl (pH 8.
URP-PCR 다형성밴드를 유무로 하여 database 한 후 유사도 (similarity coefficient)를 산출하고 하고, Dendrogram은 위의 유사도의 값을 근거로 UPGA (unweighted paired group methods with arithmatic average)법을 이용 작성 하였다. 유연관계분석을 위한 program은 Ntsys (numerical taxonomy system using multivariate statiscal programs Ver.
, 1990) 버섯 품종과같은 종내의 유전형 판별에는 한계점이 있다. 따라서, RAPD (random amplified polymorphic DNA)법 등과 같은 PCR핵산지문법이 적용되어 미생물의 종내 계통 또는 품종간 특이적 DNA 다형성을 검출하는데 이용 하였다 (강, 2003; Welsh and McClelland, 1990; Williams et al., 1990). 그러나, RAPD방법은 재현성에 있어 문제점이 지적 되고 있어 이를 개선하고자 Kang 등 (2002)은 벼 반복배열 DNA로부터 식물, 동물 및 미생물 등의 PCR 핵산지문 분석에 다범위로 이용 할 수 있는 20 mer 의 염기로 구성된 URP (universal rice primer)을 개발하였다.
성능/효과
의 종간, 종내 유전적 다양성분석을 실시 하였다. 12종류의 20mer의 URP primer가적용된 바 URP2F, URP2R, URP9F, URP4R, URP17R는 종간에 특이적인 PCR다형성밴드를 형성하였으며 Cordypces militaris 균주간에는 4가지 type의 PCR 다형성이 관찰되었다. 그러나 Paecilomyces japonica의 균주내에는 동일한 PCR 다형성을 나타내었다.
그러나 Paecilomyces japonica의 균주내에는 동일한 PCR 다형성을 나타내었다. URP-PCR profile을 이용하여 경동시장에서 수집한 미 동정 동충하초를 동정 할 수 있었다.
한편, Paecilomyces japonica 균주는 모두 95%이상의 유사계통으로 분류 되었다. URPPCR결과에서 C. militaris와 P. japonica 균주는 종내 특징적인 PCR 다형성밴드를 형성 함으로서 PCR profile을 이용한종 동정이 가능 할것으로 생각 되었으며 특히 URP2R primer 는 종내 다형성밴드를 형성하여 균주간 strain typing에 유효할것으로 사료 되었다. URP-PCR profile를 이용한 동충하초 균주 동정을 test하기 위하여 동충하초를 경동시장에서 무작위로 수집하여 genomic DNA를 추출하고 URP2R primer 로 PCR증폭하여 C.
결론적으로 본 연구에서 적용한 동충하초 Cordypces spp와 Paecilomyces spp.는 URP-PCR로 종간, 종내 특이적인 PCR다형성을 검출 할 수 있었으며 PCR profile은 C.
3). 경동시장에서 수집한 동충하초는 각각 전형적인 C. militaris와 P. japonica와 유사한 PCR 다형성 밴드를 형성 하여 C. militaris와 P. japonica로 동정 할 수 있어 동충하초의 종 동정을 위한 PCR profile로 이용 가능 할 것으로 사료 되었다.
2). 그 결과 Cordyceps militaris균주들은 90%이상의 유전적 근연관계를 보이면서 1개 group으로 분류 되었으며 C. scarabaeicola와 P. farinosa는 원연관계의 side group으로 분류 되었다. 한편, Paecilomyces japonica 균주는 모두 95%이상의 유사계통으로 분류 되었다.
결론적으로 본 연구에서 적용한 동충하초 Cordypces spp와 Paecilomyces spp.는 URP-PCR로 종간, 종내 특이적인 PCR다형성을 검출 할 수 있었으며 PCR profile은 C. militaris 와 P. japonica의 종 동정을 위하여 효율적으로 적용 가능할 것으로 생각 되었다.
후속연구
또한 종이 결정되지 않아 Cordypces sp.로 명명한 균주들은 모두 C. militaris의 PCR profile의 4가지 type에 속하여 본 PCR profile은 종 동정에 기초자료로 이용될 수 있을것으로 사료 되었다.
경우는 종간에는 명백히 다른 PCR다형성이 검출되었으나 균주간에 특징적인 PCR profile 이 관찰되지 않아 균주간 유전형을 나눌 수 없었다. 이는 국내에 존재하는 Paecilomyces japonica 균주가 한계통으로 유통되고 있는지 또는 균주들은 유전적 변이가 낮게 나타나는지를 확인 할 수 없어 더 많은 균주를 확보하여 검정하는 것이 타당 할 것으로 사료 되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
URP-PCR 핵산 지문법을 이용한 Paecilomyces spp.와 Cordyceps spp.의 종간, 종 내 유전적 다양성 분석을 시행한 결과는 무엇인가?
의 종간, 종내 유전적 다양성분석을 실시 하였다. 12종류의 20mer의 URP primer가적용된 바 URP2F, URP2R, URP9F, URP4R, URP17R는 종간에 특이적인 PCR다형성밴드를 형성하였으며 Cordypces militaris 균주간에는 4가지 type의 PCR 다형성이 관찰되었다. 그러나 Paecilomyces japonica의 균주내에는 동일한 PCR 다형성을 나타내었다. URP-PCR profile을 이용하여 경동시장에서 수집한 미 동정 동충하초를 동정 할 수 있었다.
동충하초의 생활사는 어떠한가?
동충하초는 곤충의 유충, 번데기, 성충 등의 전생육기에 외피에 침입 하여 충내에서 생장을 지속하여 자실체를 형성하거나 충체위에 포자과를 형성 한다. 현재까지 800여종이전 세계적으로 분포하는 것으로 보고 있다 (남 등 1999; Sung et al.
기주특이성, 자실체, 포자, 색 등의 형태적 특성과 단백질 양상에 따른 동충하초의 분류에 문제점이 있는 이유는 무엇인가?
, 1995; Sung et al., 1995) 환경적 요인과 생리적 조건에따라 형태적, 생리적 특성 변화가 심하여 정확한 종 분류에 문제점이 있다.
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