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문제 정의
- 본 연구는 송이버섯과 공생관계에 있는 소나무 세근의 내생균을 분리하여 동정을 수행하였으며, 공생관계 연구가 부족한 내생균의 다양성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- , 2009). 그리고 ClustalX로 다중정렬을 수행한 후, Lasergene 7과 BioEdit 프로그램을 이용하여 염기서열을 정리하였다. 그리고 내생균주 종들 간에 계통분석은 MEGA 4.
- , 2007). 그리고 PCR (Polymerase Chain Reaction) 조건은 최종농도 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 nM dNTPs이고, 10 pmol의 primer와 0.1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara)를 사용하였으며, 50 ul로 반응용량을 맞추어 사용하였다. 반응조건은 predenaturation (95℃, 2 min), denaturation (95℃, 30 Sec), annealing (54.
- , 2009) Potato Dextrose Broth (PDB)배지에 접종하여 25℃에서 100 rpm의 조건으로 7일간 진탕 배양하였으며, filter paper를 사용하여 배양액을 여과하였다. 그리고 균체는 동결건조 수행 후에 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다(Khan et al., 2008). 추출된 genomic DNA는 universal primer ITS1 (5´-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3´)과 ITS4 (5´-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3´)를 사용하여 rDNA-ITS영역을 증폭하였다(Khan et al.
- 5% agarose gel에서 전기영동 후, EtBr (Ethidium bromide)로 15분 염색하여 UV transilluminator에서 밴드를 확인 하였다. 그리고 증폭된 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였고, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster, CA, USA)와 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다(Seo et al., 2009). 그리고 ClustalX로 다중정렬을 수행한 후, Lasergene 7과 BioEdit 프로그램을 이용하여 염기서열을 정리하였다.
- 1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara)를 사용하였으며, 50 ul로 반응용량을 맞추어 사용하였다. 반응조건은 predenaturation (95℃, 2 min), denaturation (95℃, 30 Sec), annealing (54.5℃, 1 min), extension (72℃, 1 min), total cycles (35 cycles), final extension (72℃, 7 min) 수행하였으며, 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후, EtBr (Ethidium bromide)로 15분 염색하여 UV transilluminator에서 밴드를 확인 하였다. 그리고 증폭된 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)를 사용하여 정제하였고, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster, CA, USA)와 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다(Seo et al.
- 본 연구에서는 경상북도 가창의 산림에서 자생하는 송이버섯과 공생관계인 소나무 세근(Pinus densiflora rootlet)을 채집하였으며, Clay and Holah (1999) 그리고 Fisher 등 (1984)의 연구방법에 따라 소나무 세근의 내생균을 분리하여 rDNA-ITS 영역을 이용하여 동정 및 내생균의 다양성에 대하여 조사 하였다.
- 소나무 세근에서 분리한 내생균의 분자적인 동정을 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 blastn 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 분리된 균류들과 서열 상동성이 가장 높은 균류들을 분석하였다.
대상 데이터
- 그리고 PDA(Potato Dextrose Agar)배지로 옮겨 25℃ 조건하에 계대배양하여 124점의 내생균을 순수 분리하였다. 그리고 형태학(morphology)적으로 다른 내생균을 선별하여 18종을 선별 하였다.
이론/모형
- 그리고 ClustalX로 다중정렬을 수행한 후, Lasergene 7과 BioEdit 프로그램을 이용하여 염기서열을 정리하였다. 그리고 내생균주 종들 간에 계통분석은 MEGA 4.1프로그램 Neighbor-Joining (NJ) 방법으로 분석하였다(Khan et al., 2008).
성능/효과
- 그리고 분리된 내생균은 자낭균문에 속하는 내생균 15종과 털곰팡이 아문 3종이 분리 동정되었고, 자낭균문에 속하는 Penicillium속 내생균이 10종으로 가장 높은 빈도를 나타내었다(Table 2). 그리고 Chaunopycnis속의 Pd-10-2 (JN376153)와 Pd-17-6(JN376161)는 ITS영역을 blastn으로 분석하였을 때, 두 균주는 모두 96% (Pd-10-2, Pd-17-6)의 상동성을 확인 할 수 있었다.
- 첫 번째 그룹은 자낭균문(Ascomycota)에 속하였으며, Trichocomaceae과에 속하는 Penicillium속과 Aspergillus속 그리고 Talaromyces속을 확인 하였고, 분류체계가 명확하지 않은 Helotiales목에 속하는 Phialocephala속을 동정하였다. 그리고 Clavicipitaceae과에 속하는 Chaunopycnis속과 Dermateaceae과에 속하는 Cryptosporiopsis속이 동정 되었다. 두 번째 그룹은 털곰팡이 아문(Mucoromycotina)으로서 Mortierellaceae과에 속하는 Mortierella속과 Umbelopsis속을 동정 하였다.
- 소나무 세근에서 분리된 내생균의 빈도는 자낭균문에 속하는 Penicillium속 10 종, Aspergillus속 1종, Talaromyces속 1종, Phialocephala속 1종, Chaunopycnis속 1종, Cryptosporiopsis속 1종이 동정되었고, 털곰팡이 아문에 속하는 Mortierella속 2종과 Umbelopsis속 1종이 분리 및 동정되었다. 그리고 분리된 내생균은 자낭균문에 속하는 내생균 15종과 털곰팡이 아문 3종이 분리 동정되었고, 자낭균문에 속하는 Penicillium속 내생균이 10종으로 가장 높은 빈도를 나타내었다(Table 2). 그리고 Chaunopycnis속의 Pd-10-2 (JN376153)와 Pd-17-6(JN376161)는 ITS영역을 blastn으로 분석하였을 때, 두 균주는 모두 96% (Pd-10-2, Pd-17-6)의 상동성을 확인 할 수 있었다.
- 그리고 Clavicipitaceae과에 속하는 Chaunopycnis속과 Dermateaceae과에 속하는 Cryptosporiopsis속이 동정 되었다. 두 번째 그룹은 털곰팡이 아문(Mucoromycotina)으로서 Mortierellaceae과에 속하는 Mortierella속과 Umbelopsis속을 동정 하였다. 소나무 세근에서 분리된 내생균의 빈도는 자낭균문에 속하는 Penicillium속 10 종, Aspergillus속 1종, Talaromyces속 1종, Phialocephala속 1종, Chaunopycnis속 1종, Cryptosporiopsis속 1종이 동정되었고, 털곰팡이 아문에 속하는 Mortierella속 2종과 Umbelopsis속 1종이 분리 및 동정되었다.
- 분리된 내생균을 rDNA-ITS 영역으로 동정한 결과 18종이 확인 되었으며, 이중에는 자낭균류 15종, 털곰팡이아문 3종이 포함되어 있음이 확인 되었다. 본 연구의 내생균 중에는 Penicillium속 균주가 가장 높은 빈도로 생육하고 있음이 확인되었다.
- 송이버섯 생육지의 소나무세근으로부터 내생균이 분리되었다. 분리된 내생균을 rDNA-ITS 영역으로 동정한 결과 18종이 확인 되었으며, 이중에는 자낭균류 15종, 털곰팡이아문 3종이 포함되어 있음이 확인 되었다. 본 연구의 내생균 중에는 Penicillium속 균주가 가장 높은 빈도로 생육하고 있음이 확인되었다.
- 두 번째 그룹은 털곰팡이 아문(Mucoromycotina)으로서 Mortierellaceae과에 속하는 Mortierella속과 Umbelopsis속을 동정 하였다. 소나무 세근에서 분리된 내생균의 빈도는 자낭균문에 속하는 Penicillium속 10 종, Aspergillus속 1종, Talaromyces속 1종, Phialocephala속 1종, Chaunopycnis속 1종, Cryptosporiopsis속 1종이 동정되었고, 털곰팡이 아문에 속하는 Mortierella속 2종과 Umbelopsis속 1종이 분리 및 동정되었다. 그리고 분리된 내생균은 자낭균문에 속하는 내생균 15종과 털곰팡이 아문 3종이 분리 동정되었고, 자낭균문에 속하는 Penicillium속 내생균이 10종으로 가장 높은 빈도를 나타내었다(Table 2).
- 1). 첫 번째 그룹은 자낭균문(Ascomycota)에 속하였으며, Trichocomaceae과에 속하는 Penicillium속과 Aspergillus속 그리고 Talaromyces속을 확인 하였고, 분류체계가 명확하지 않은 Helotiales목에 속하는 Phialocephala속을 동정하였다. 그리고 Clavicipitaceae과에 속하는 Chaunopycnis속과 Dermateaceae과에 속하는 Cryptosporiopsis속이 동정 되었다.
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