선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이러한 의문에 대한 하나의 가능성은 phenylalanine 아미노산 분해의 대사산물로부터 유래 할 것으로 추정되었으나 아직 연구보고 된 바 없다. 이에 따라 본 연구에서는 U. maydis균이 phenylalanine을 분해하여 benzoic acid을 생성하는지 알아보고자 방사성 동위 원소 추적을 통하여 대사 경로를 조사하였다.
- maydis 균이 phenylalanine 이나 cinnamic acid를 에너지원으로 사용 할 수 있음을 보여준다. 미생물 중 페닐링을 분해하는 기능이 있는 균들이 그다지 많지 않은데다 특히 진균류에서 페닐링의 분해에 대한 보고가 많지 않은바 본 연구 결과는 U. maydis 균의 대사특성에 대한 새로운 정보를 제공한다.
- 아직 까지 진균에서 C4H와 4CL에 대한 연구가 없는바 U. maydis에서 이들 두 효소의 benzoic acid 형성 가능성에 대한 또 다른 증거를 찾고자 하였다. 현재 GenBank DNA 데이터베이스(www.
- 또한 L-14C-phenylalanine을 대사하여 매우 천천히 공기 중으로 14CO2를 방출함을 확인하여 phenylalanine을 완전히 분해 할 수 있음을 밝혔다. 결론적으로 본 연구는 옥수수깜부기균이 benzoic acid를 생성하고 그 유래는 phenylalanine의 분해에서 만들어지는 증거를 제시하였다.
제안 방법
- 방사성 동위원소 추적 실험을 위해서는 phenylalanine ammonia-lyase 효소활성유도 액체배지(Kim et al., 2001b) 50 ml을 담은 2개의 서로 다른 300 ml 유리플라스크에 균체 1 ml (2 × 108 cells)를 접종하여 25℃ 암 조건에서 분당 200 rpm 속도로 16시간 씩 각각 회전배양 후 하나의 배지에는 5 Ci L-[U-14C]-phenylalanine (sp. act. 474 mCi/mmol)를 첨가하고 다른 하나의 배지에는 2 Ci L-[U-14C]-cinnamic acid (sp. act. 474 mCi/mmol)를 첨가한 후 2시간씩 추가배양을 실시하였다.
- 세포추출물은 95% ethanol에서 10 min 동안 끓여서 준비하였고 배양여액 추출물은 6N HCl로 산성화 시킨 후 diethyl ether로 분별 추출하여 준비하였다. 준비된 이들 2가지 추출물은 질소가스로 농축시킨 후 Thin layer chromatography (TLC: silica gel type, Merk Co.)를 실시하였다. 1차 전개는 n-butanol : ethanol : water = 4 : 1 : 1을 전개용액으로 사용하였고 2차 전개는 toluene : acetic acid = 4 : 1을 전개용액으로 사용하였다.
- 이상의 검출된 결과를 바탕으로 U. maydis에 의하여 phenylalanine이 분해되는 이화과정을 도식하여 Fig. 2에 제시하였다. 미생물에 의한 phenylalanine 분해는 주로 phenylalanine deaminase에 의해 분해되는데 사전 실험에서 U.
- maydis에서 이들 두 효소의 benzoic acid 형성 가능성에 대한 또 다른 증거를 찾고자 하였다. 현재 GenBank DNA 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)에 U. maydis의 유전체 정보가 있는바(genome ID;UM5074) 포플러(GenBank Accession no. Q43054), 아라비돕시스(GenBank Accession no. P92994), 알팔파(GenBank Accession no. P37114) 등으로부터 알려진 C4H 효소 유전자 염기서열을 이용하여 Blast P 검색을 통해 U. maydis genome 으로부터 C4H 효소 유전자 homologous region의 존재를 탐색하였다. 탐색 결과 C4H 효소의 Cytochrome P450 cysteine heme-iron ligand signature 인 [FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]를 가지는 유전자 부위가 존재함을 확인하고 PAUP* software(Swofford, 2002)에 있는 Clustal W 프로그램을 이용하여 multiple alignment를 수행하였다 (Fig.
- Ustilago maydis(옥수수깜부기균)에 있어서 동포자 melanin 의 구성성분으로 catecol 계 알려진바 이 물질의 전구체인 benzoic acid의 생성 여부와 그 유래 원천을 추적하고자 phenylalanine의 분해 과정을 조사하였다. 방사성 동위원소가 표지된 L-14C-phenylalanine 및 14C-trans-cinnamic acid를 첨가한 액체배지에서 균체와 배양액을 대상으로 대사산물을 추적 조사한 결과 trans-cinnamic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid와 hydroxybenzoic acid derivatives 추정되는 물질 등이 검출되었다.
- 전개된 TLC plate는 후두에서 휘발성 유기용매를 건조시킨 후 X-Omat AR film (Kodak)에 1주일간 감광시켰다. Phenylalanine으로부터 유래하는 대사물질들의 동정을 위해서는 film에 전개되어 나타나는 물질의 Rf 값을 측정하고 동시에 같은 Rf 값을 가지는 알려진 물질을 함께 전개하여 확인하였다. U.
- Phenylalanine으로부터 유래하는 대사물질들의 동정을 위해서는 film에 전개되어 나타나는 물질의 Rf 값을 측정하고 동시에 같은 Rf 값을 가지는 알려진 물질을 함께 전개하여 확인하였다. U. maydis가 배양 중에 phenylalanine을 대사하면서 최종 분해산물로서 14CO2를 발생시키는지 알아보기 위해서는 앞서와 같이 준비된 배양배지에 0.25 Ci의 L-[U-14C]-phenylalanine을 첨가하여 같은 조건으로 16시간 배양하면서 발생하는 CO2 호흡산물을 Hyaminehydroxide를 통해 흡수시킨 후 액체섬광계수기 (LS-6500/Beckman Coulter, Inc. Germany)를 사용하여 흡수된 산물에 14C 방사성 원소의 존재 유무를 조사하였다.
대상 데이터
- Phenylalanine 분해산물의 분석을 위해서는 효모형태로 자라는 U. maydis 518 균을 complete media(Holliday, 1974)에 접종하고 25℃에 배양하여 유지하면서 사용하였다. 방사성 동위원소 추적 실험을 위해서는 phenylalanine ammonia-lyase 효소활성유도 액체배지(Kim et al.
- 1에 나타내었다. 검출된 물질로는 trans-cinnamic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid 등이 있었고 그 밖에 hydroxybenzoic acid derivatives 추정되는 다른 benzoic acid 유래 물질 등이 검출되었다. 이러한 물질들은 균체세포 추출물과 배양여액 모두에서 검출되었다.
데이터처리
- maydis genome 으로부터 C4H 효소 유전자 homologous region의 존재를 탐색하였다. 탐색 결과 C4H 효소의 Cytochrome P450 cysteine heme-iron ligand signature 인 [FW]-[SGNH]-x-[GD]-{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD]를 가지는 유전자 부위가 존재함을 확인하고 PAUP* software(Swofford, 2002)에 있는 Clustal W 프로그램을 이용하여 multiple alignment를 수행하였다 (Fig. 3). 유사부위는 U.
성능/효과
- 이러한 물질들은 균체세포 추출물과 배양여액 모두에서 검출되었다. 검출된 물질을 자세히 살펴보면 L-14C-phenylalanine을 첨가한 배지에서 자란 균체로부터 trans-cinnamic acid 가 만들어짐을 알 수 있었고 (Fig. 1A) 배양액에 benzoic acid가 존재함을 알 수 있었다 (Fig. 1B). 한편 14C-trans-cinnamic acid을 첨가한 배지에서 자란 균체로부터 benzoic acid의 존재와 그 밖의 밝혀지지 않은 산물들이 존재함을 알 수 있었고 (Fig.
- 1B). 한편 14C-trans-cinnamic acid을 첨가한 배지에서 자란 균체로부터 benzoic acid의 존재와 그 밖의 밝혀지지 않은 산물들이 존재함을 알 수 있었고 (Fig. 1C) 배양액으로 부터는 trans-cinnamic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid와 그 밖에 다른 hydroxybenzoic acid derivatives 추정물질이 존재함을 볼 수 있었다 (Fig. 1D). 이로 볼 때 첨가된 L-14C-phenylalanine 및 14C-trans-cinnamic acid를 균체 내에서 대사하여 균체의 세포 밖으로 이들의 대사산물인 trans-cinnamic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid 등의 유기산을 배양배지에 배출하는 것을 확인하였다.
- 1D). 이로 볼 때 첨가된 L-14C-phenylalanine 및 14C-trans-cinnamic acid를 균체 내에서 대사하여 균체의 세포 밖으로 이들의 대사산물인 trans-cinnamic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid 등의 유기산을 배양배지에 배출하는 것을 확인하였다. L-14C-phenylalanine 보다14C-trans-cinnamic acid를 첨가한 배지에서 더 다양하게 유기산이 배출되었는데 이는 U.
- cinnamic acid를 첨가한 경우는 이물질이 농도가 높으면 균체에 독성이 될 수 있는바 빨리 분해 대사하여 세포 밖으로 내보내는 것으로 사료된다. 한편 L-14C-phenylalanine이 첨가된 배지에서 6시간 동안 배양하면서 포집한 공기 중의 호흡대사물질로 부터는 액체섬광계수기를 이용하여 측정한 결과 배양액에 첨가하였던 방사선량인 0.25 Ci의 0.2% 수준에 달하는 소량의 방사성 탄소가 존재함을 확인할 수 있었다. 이는 첨가해준 L-14C-phenylalanine 을 대사하여 매우 천천히 공기 중으로 CO2를 방출함을 시사한다.
- 이는 첨가해준 L-14C-phenylalanine 을 대사하여 매우 천천히 공기 중으로 CO2를 방출함을 시사한다. 이것으로 볼 때 U. maydis 균은 phenylalanine을 분해하면서 구조적으로 육각형의 페닐링 구조를 분해시켜 최종적으로 완전히 대사하여 CO2를 방출 할 수 도 있음을 알 수 있다. 이는 U.
- 3). 유사부위는 U. maydis와 포플러, 알팔파, 아라비돕시스간에 상당히 보존되어 있음을 알 수 있었다. 같은 방법으로 4CL 유전자 homologous region의 존재를 아라비돕시스(GenBank Accession nos.
- 결론으로서 본 연구에서는 U. maydis균이 phenylalanine 을 분해하여 benzoic acid을 생성하고 CO2 분해까지 되는 것을 확인하였다. 현재까지 U.
- Ustilago maydis(옥수수깜부기균)에 있어서 동포자 melanin 의 구성성분으로 catecol 계 알려진바 이 물질의 전구체인 benzoic acid의 생성 여부와 그 유래 원천을 추적하고자 phenylalanine의 분해 과정을 조사하였다. 방사성 동위원소가 표지된 L-14C-phenylalanine 및 14C-trans-cinnamic acid를 첨가한 액체배지에서 균체와 배양액을 대상으로 대사산물을 추적 조사한 결과 trans-cinnamic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid와 hydroxybenzoic acid derivatives 추정되는 물질 등이 검출되었다. 또한 L-14C-phenylalanine을 대사하여 매우 천천히 공기 중으로 14CO2를 방출함을 확인하여 phenylalanine을 완전히 분해 할 수 있음을 밝혔다.
- 방사성 동위원소가 표지된 L-14C-phenylalanine 및 14C-trans-cinnamic acid를 첨가한 액체배지에서 균체와 배양액을 대상으로 대사산물을 추적 조사한 결과 trans-cinnamic acid, benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid와 hydroxybenzoic acid derivatives 추정되는 물질 등이 검출되었다. 또한 L-14C-phenylalanine을 대사하여 매우 천천히 공기 중으로 14CO2를 방출함을 확인하여 phenylalanine을 완전히 분해 할 수 있음을 밝혔다. 결론적으로 본 연구는 옥수수깜부기균이 benzoic acid를 생성하고 그 유래는 phenylalanine의 분해에서 만들어지는 증거를 제시하였다.
- 2001a)가 있는바 확실한 초기 분해 단계로 볼 수 있다. 본 연구에서는 Fig. 1A 결과에서 L-14C-phenylalanine 로부터 14C-trans-cinnamic acid가 생성된 것을 확인 할 수 있다. 두 번째 단계는 trans-cinnamic acid가 para-coumaric acid(4-coumaric acid)로 전환하고 para-coumaric acid가 para-coumaryl Co A(4-coumarorl Co A)로 변하는 단계인데 본 연구에서는 이물질이 검출되지 않았다.
- maydis와 포플러, 알팔파, 아라비돕시스간에 상당히 보존되어 있음을 알 수 있었다. 같은 방법으로 4CL 유전자 homologous region의 존재를 아라비돕시스(GenBank Accession nos. 4CL : Q42524, 4CL2 : Q9S725, 4CL3 : Q9S777, 4CL4 : Q9LU36), 테다소나무(GenBank Accession no. P41636), 담배(GenBank Accession no. AAB18638) 등의 알려진 4CL 효소의 유전자를 이용하여 U. maydis genome 정보를 탐색한 결과 3개의 homologous 서열 (GenBank Accession nos. EAK81955, CBQ69176, EAK85592)을 발견하였다. 이들 염기서열을 단백질 서열로 변환시킨 결과 4CL 효소의 부위에 특징적으로 존재하는 AMP binding domain signature 인 LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR]를 가지고 있었다 (Fig.
후속연구
- 이 두 효소의 활성을 위해서는 ATP hydrolysis가 요구되며 산화환원 반응을 수행하는 연유로 대사진행이 매우 빠르게 진행되는 것으로 식물에서는 알려져 있다. 어쩌면 이러한 연유로 방사성을 띤 L-14C-phenylalanine이나 14C-trans-cinnamic acid를 주었을 때 세포내에 존재하는 cinnamic acid를 빠르게 다른 물질로 전환시켜 대사를 진행하였기 때문에 본 연구에서 실시한 배양 6시간 이후의 시기에는 벌써 다른 물질로 변화하여 검출되지 않았을 가능성이 높다고 사료된다. 사실 Fig.
- maydis에서 검출된 3개의 4CL homologous가 모두 4CL 효소 유전자일 가능성도 있다. 그러나 4CL 효소는 반응 기질로서 4-coumaric acid 외에도 다른 phenolic acids 를 기질로 이용할 수 있는바(Allina et al., 1998) 이들의 기질특이성에 대해서는 향 후 단백질 수준에서의 후속 연구를 통하여 확인하는 것이 필요하다. Fig.
- Phenylpropanoid는 방향족환에 탄소가 3개로된 사슬이 달린 phenol성 물질로서 C6-C3 화합물이며, 여러 형태의 유도체(derivatives)로도 많이 존재하고 식물의 성장, 분화, 발달, 그리고 외부환경에의 저항을 위하여 중대한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Hahlbrock and Scheel, 1989). 이에 반하여 진균에서는 이들 화합물의 역할에 대한 연구가 매우 미진함으로 본 연구는 향 후 U. maydis균에서 phenylalanine 로부터 생성되는 다양한 cinnamic acid와 benzoic acid 유도체 물질들이 어떠한 역할을 하는지 연구하는데 중요한 기반을 제공한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.