선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 닭 hybridoma의 유전적 불안정성과 항체 발현량의 제한성(Nishinaka, et al., 1996)을 극복하기 위해 같은 Eimeria에 속하는 Eimeria acervulina, Eimeria maxima, Eimeria tenella 포자충(sporozoites) 항원에 특이적으로 결합하는 닭 단일 클론 항체 13C8 hybridoma로부터 ScFv 항체 유전자를 구축하였다. 구축된 닭 13C8 ScFv 항체는 E.
제안 방법
- 5μg의 total RNA와 Oligo d(T)18 primer 그리고 SuperScript Ⅱ reverse transcriptase(Invitrogen, U.S.A.)를 이용하여 First strand cDNA를 합성하였고, 제조된 cDNA를 주형으로 하여 각각의 primer set에 의해 VH와 VL 유전자가 증폭되었다.
- coli를 숙주(host)로 하여 성공적으로 발현 및 정제되어 졌다. ELISA를 통해 제조된 재조합 13C8 ScFv 항체의 항원 결합력을 측정하였고, 13C8 ScFv 항체 유전자의 염기 및 아미노산 배열 분석을 통해 13C8 ScFv 항체 단백질의 3차 구조를 예측해 보았으며, 이미 알려진 닭의 germline 항체 유전자와 비교분석하여 13C8 항체의 VH 및 VL유전자는 gene conversion 기작에 의해 pseudogenes들로부터 유래되어짐을 확인하였다.
- Eimeria spp. sporozoite 항원과 결합하는 단일 클론 항체를 분비하는 닭의 13C8 hybridoma 세포주로부터 TRIzol(Invitrogen, U.S.A.)을 이용해 Total RNA를 추출하였다. 5μg의 total RNA와 Oligo d(T)18 primer 그리고 SuperScript Ⅱ reverse transcriptase(Invitrogen, U.
- )를 이용하여 First strand cDNA를 합성하였고, 제조된 cDNA를 주형으로 하여 각각의 primer set에 의해 VH와 VL 유전자가 증폭되었다. 즉, CK VLB(VL reverse primer)와 CKVLF(VL forward primer)를 이용하여VL유전자를 증폭하였고, CK VHB(VH reverse primer)와 CKVHF(VH forward primer)는 VH 유전자의 증폭을 위해 사용되었다(Table 1). 특히 Splicing by Overlap Extension(SOEing) PCR을 위해 상보적인 linker sequence(italics: GSTSGKPSEGKG)를 CKVLF와 CK VHB primer에 포함시켰다(Table 1).
- 즉, CK VLB(VL reverse primer)와 CKVLF(VL forward primer)를 이용하여VL유전자를 증폭하였고, CK VHB(VH reverse primer)와 CKVHF(VH forward primer)는 VH 유전자의 증폭을 위해 사용되었다(Table 1). 특히 Splicing by Overlap Extension(SOEing) PCR을 위해 상보적인 linker sequence(italics: GSTSGKPSEGKG)를 CKVLF와 CK VHB primer에 포함시켰다(Table 1). PCR products를 1% agarose gel에서 전개하여 증폭된 DNA fragment를 QIAEX Ⅱ gel extraction kit(QIAGEN, Germany)를 이용해 gel로부터 회수하였다.
- 특히 Splicing by Overlap Extension(SOEing) PCR을 위해 상보적인 linker sequence(italics: GSTSGKPSEGKG)를 CKVLF와 CK VHB primer에 포함시켰다(Table 1). PCR products를 1% agarose gel에서 전개하여 증폭된 DNA fragment를 QIAEX Ⅱ gel extraction kit(QIAGEN, Germany)를 이용해 gel로부터 회수하였다. 회수되어진 PCR products는 pGEM-T vector(Promega, U.
- PCR products를 1% agarose gel에서 전개하여 증폭된 DNA fragment를 QIAEX Ⅱ gel extraction kit(QIAGEN, Germany)를 이용해 gel로부터 회수하였다. 회수되어진 PCR products는 pGEM-T vector(Promega, U.S.A.)로 클로닝하여 유전자 염기 배열을 분석하였다. 얻어진 sequencing 결과를 이미 알려진 닭의 heavy chain 및 light chain의 germline sequence(Reynaud et al.
- 증폭된 13C8 ScFv DNA는 DNA 제한 효소 SfiI과 NotI에 의해 5'-pelB leader sequence와 3'-hexahistidine tag을 가진 pUC119 벡터로 클로닝하였다.
- 2XTY 액체 배지를 이용해 한번 세척해 주고, 100μg의 ampicillin과 0.25 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside를 포함한 2XTY 액체배지에 bacteria pellet을 재현탁하여 25℃, 5.5시간 동안 배양하여 단백질 발현을 유도하였다.
- 25% coomassie brilliant blue R-25 용액을 이용해 염색하였다. Western blot 분석을 위해 정제된 13C8 ScFv 단백질은 전기영동방법으로 SDS-PAGE하고 PVDF membrane(Millipore, U.S.A.)으로 transfer 하였다. 그리고 transfer되어진 membrane을 2%(w/v) skim milk를 포함한 PBS-T buffer를 이용하여 실온에서 1시간동안 blocking한 다음, PBS-T로 2회 세척하였다.
- 분석된 13C8 ScFv 항체 유전자로부터 아미노산 배열 정보를 결정한 다음 WAM(http://antibody.bath.ac.kr/) 프로그램을 이용하여 3차 구조 모델링을 실시하였다. 결정된 13C8의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 입력하고, 이미 3차 구조가 밝혀진 항체들 중에서 가장 유사한 아미노산 서열을 갖고 있는 항체를 RCSB protein data bank(http://www.
- 13C8 ScFv 항체의 Eimeria sporozoites antigen과의 결합력을 확인하기 위해 2μg의 항원을 4℃에서 밤새 coating시킨 96-well maxisorp plate(Nunc, Denmark)를 이용한 ELISA를 수행하였다.
- 2μg의 13C8 ScFv 항체를 포함한 blocking buffer를 처리하여 실온에서 1시간 동안 항체가 결합할 수 있도록 한 후, PBS-T를 이용한 3번의 세척 후 horseradish peroxidase가 conjugated된 polyhistidine monoclonal antibody(Sigma-Aldrich, U.S.A.)를 처리하여 ABTS로 발색하여 Microplate reader(Expert 96, Asys, Austria)로 492 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 증폭된 ScFv 유전자는 Sfi I 및 Not I의 두 제한 효소를 이용하여 박테리아 발현 벡터로 클로닝 되어졌다. 본 연구에서 이용된 발현 벡터는 IPTG에 의한 전사(transcription)를 활성화시키기 위해 lac Z promoter를 사용하였고, N-terminus에 pel B leader peptide(Kim et al., 1994)를 첨가하여 발현된 단백질을 E. coli의 periplasmic space로 이동시켜 분비를 촉진시켰다. 또한 C-terminus에는 6개의 histidine을 첨가시켜 Ni-NTAAgarose affinity column를 사용하여 발현된 단백질의 정제를 가능케 하였다(Fig.
- coli의 periplasmic space로 이동시켜 분비를 촉진시켰다. 또한 C-terminus에는 6개의 histidine을 첨가시켜 Ni-NTAAgarose affinity column를 사용하여 발현된 단백질의 정제를 가능케 하였다(Fig. 2A).
- 2C). 또한 재조합 13C8 ScFv는 C-terminus에 6개의 histidine을 포함하므로 이 histidine에 결합하는 항체를 이용한 Western blot를 실시하여 13C8 ScFv의 발현을 재확인하였다(Fig. 2D). 13C8의 VH와 VL 유전자의 염기배열은 CB strain의 닭으로부터 분석된 ger- mline sequence(Reynaud et al.
- 2D). 13C8의 VH와 VL 유전자의 염기배열은 CB strain의 닭으로부터 분석된 ger- mline sequence(Reynaud et al., 1987, 1989)와 비교 분석하였고, Framework region(FR)과 complementarity determining re- gions(CDRs)는 Kabat sequence에 따라 결정되었다(Kabat et al., 1991). Germline sequence와 13C8 항체의 염기배열상의 차이는 주로 CDRs region에서 발견되었다(Fig.
- 재조합 13C8 ScFv 항체의 주된 기능인 항원 결합 능력을 측정하기 위해 ELISA 분석을 시도하였다. 같은 Eimeria에 속하는 Eimeria acervulinar, Eimeria maxima 그리고 Eimeria tenella 포자충(sporozoite) 항원이 고정된 plate에 재조합 13C8 ScFv 항체를 처리하여 항원 결합력을 측정한 결과, 사용되어진 세가지 Eimeria 종류의 포자 충항원을 모두 인지하는 것으로 확인되었다(Fig.
- 그러나 닭 하이브리도마 유전자의 불안정성 때문에 분비되는 항체의 생산량이 낮은 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 hybridoma로부터 항체의 중사슬 가변 부위(VH)유전자와 경사슬 가변 부위(VL) 유전자를 증폭하여 linker peptide로 연결해준 재조합 ScFv 항체 유전자를 구축하고, E. coli를 형질 전환시켜 재조합 단백질로 발현 정제하였다. ELISA 분석 결과 재조합 13C8 ScFv 항체는 세 종류의 Eimeria spp.
- 결정된 13C8의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 입력하고, 이미 3차 구조가 밝혀진 항체들 중에서 가장 유사한 아미노산 서열을 갖고 있는 항체를 RCSB protein data bank(http://www.rcsb.org/pdb/)에서 찾아내어 이를 주형으로 항원 결합부위인 complementarity determining region(CDR)의 loop와 항체의 구조적인 안정화 역할을 하는 framework region(FR)의 β-sheet의 3차 구조를 결정하였다.
데이터처리
- )로 클로닝하여 유전자 염기 배열을 분석하였다. 얻어진 sequencing 결과를 이미 알려진 닭의 heavy chain 및 light chain의 germline sequence(Reynaud et al., 1987)와 배열하여 비교분석하였다.
- org/pdb/)에서 찾아내어 이를 주형으로 항원 결합부위인 complementarity determining region(CDR)의 loop와 항체의 구조적인 안정화 역할을 하는 framework region(FR)의 β-sheet의 3차 구조를 결정하였다. 추정된 3차 구조는 PyMol(Delano Scientific, U.S.A.) 프로그램을 통해 형상화 하여 분석하였다.
성능/효과
- coli를 형질 전환시켜 IPTG에 의해 단백질 발현을 유도하였다. 발현된 단백질은 Ni-NTA affinity column에 의해 정제되어지고 SDS-PAGE를 수행한 결과 약 32 kDa의 13C8 ScFv 항체 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 2C). 또한 재조합 13C8 ScFv는 C-terminus에 6개의 histidine을 포함하므로 이 histidine에 결합하는 항체를 이용한 Western blot를 실시하여 13C8 ScFv의 발현을 재확인하였다(Fig.
- 한편 CB strain으로부터 알려진 다수의 pseudogenes 정보(Reynaud et al., 1987, 1989)를 이용하여 13C8 항체의 VH 및 VL 유전자가 유래된 pseudogenes을 추정한 결과 13C8 항체의 VH 및 VL 유전자는 모두 고유한 특정pseudogene에서 유래되 었음을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 따라서 무수히 많은 항원에 대한 특이성을 나타내기 위한 닭 항체 유전자의 다양성은 다수의 pseudogenes이 gene conversion이라고 하는 특정 recombination 기작에 의해 다양한 형태로 변화되어 닭 항체 유전자의 다양성을 유지한다는 것을 확인할 수 있었다(McCor- mack and Thompson, 1990).
- 재조합 13C8 ScFv 항체의 주된 기능인 항원 결합 능력을 측정하기 위해 ELISA 분석을 시도하였다. 같은 Eimeria에 속하는 Eimeria acervulinar, Eimeria maxima 그리고 Eimeria tenella 포자충(sporozoite) 항원이 고정된 plate에 재조합 13C8 ScFv 항체를 처리하여 항원 결합력을 측정한 결과, 사용되어진 세가지 Eimeria 종류의 포자 충항원을 모두 인지하는 것으로 확인되었다(Fig. 6).
- 이 결과는 13C8 ScFv 항체가 세 종류의 Eimeria strain에 공통적으로 존재하는 항원에 결합하는 가능성을 제시해 주고 있으므로, 13C8 ScFv 항체는 언급된 세 종류 Eimeria가 일으키는 조류 콕시듐증에 공통적으로 사용할 수 있는 진단 및 치료목적의 항체로 개발되어질 수 있는 잇점을 가지게 될 것이다. 또한 13C8 항체가 인지하는 항원을 탐지해내는 연구를 통해 재조합 vaccine 개발 또한 가능할 것이다.
- coli를 형질 전환시켜 재조합 단백질로 발현 정제하였다. ELISA 분석 결과 재조합 13C8 ScFv 항체는 세 종류의 Eimeria spp.에 대해 모두 항원 결합력을 나타내었으며, 염기서열 분석을 수행하여 ger- mline sequence와 비교한 결과 닭 항체유전자의 다양성(diversity)은 pseudogene들의 gene conversion 기작에 의해 이루어짐을 제시해 주었다.
- ELISA 분석 결과 재조합 13C8 ScFv 항체는 세 종류의 Eimeria spp.에 대해 모두 항원 결합력을 나타내었으며, 염기서열 분석을 수행하여 ger- mline sequence와 비교한 결과 닭 항체유전자의 다양성(diversity)은 pseudogene들의 gene conversion 기작에 의해 이루어짐을 제시해 주었다.
후속연구
- 이 방법에 의하면 hybridoma 배양에 의한 단일 클론 항체의 제조보다 짧은 시간에 대량의 단일 클론 항체 제조가 가능하며, 또한 유전자 조작이 용이해서 무작위 돌연변이(random mutation)을 이용하여 인위적으로 재조합 항체의 항원에 대한 결합친화력을 증가시킬 수 있는 잇점이 있다. 또한 높은 친화력을 갖는 닭의 재조합 ScFv를 이용한 affinity chromatography 또는 immunoprecipitation 등을 통해, 인지되는 항원의 탐지 및 정제가 용이해져서 정제된 항원을 이용하여 Coccidiosis를 예방할 수 있는 subunit vaccine 개발 가능성 또한 제시해 줄 것이다. 한편, phage-displayed antibody technology를 이용하여 닭의 비장 조직을 항체유전자의 naive repertoire source로 이용 가능하기 때문에 닭항체의 유전자도서관(gene library)을 제조, hybridoma technology에 의한 단일 클론 항체 제조 방법에 의해서는 거의 불가능한 다양한 항원에 대해 특이성을 갖는 재조합 단일 클론 항체의 개발 또한 가능하게 될 것이다.
- 또한 높은 친화력을 갖는 닭의 재조합 ScFv를 이용한 affinity chromatography 또는 immunoprecipitation 등을 통해, 인지되는 항원의 탐지 및 정제가 용이해져서 정제된 항원을 이용하여 Coccidiosis를 예방할 수 있는 subunit vaccine 개발 가능성 또한 제시해 줄 것이다. 한편, phage-displayed antibody technology를 이용하여 닭의 비장 조직을 항체유전자의 naive repertoire source로 이용 가능하기 때문에 닭항체의 유전자도서관(gene library)을 제조, hybridoma technology에 의한 단일 클론 항체 제조 방법에 의해서는 거의 불가능한 다양한 항원에 대해 특이성을 갖는 재조합 단일 클론 항체의 개발 또한 가능하게 될 것이다.
- 이 결과는 13C8 ScFv 항체가 세 종류의 Eimeria strain에 공통적으로 존재하는 항원에 결합하는 가능성을 제시해 주고 있으므로, 13C8 ScFv 항체는 언급된 세 종류 Eimeria가 일으키는 조류 콕시듐증에 공통적으로 사용할 수 있는 진단 및 치료목적의 항체로 개발되어질 수 있는 잇점을 가지게 될 것이다. 또한 13C8 항체가 인지하는 항원을 탐지해내는 연구를 통해 재조합 vaccine 개발 또한 가능할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.