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문제 정의
- 따라서 동백의 체세포배 발생을 통한 식물체 대량증식이나 형질전환체 생산 연구를 성공적으로 수행하기 위해서는 기내 배양과정에서 발생되는 체세포배의 형태적 변이와 발생빈도를 파악해야 할 것이고, 각 비정상적인 체세포배의 식물체 재생빈도와 자엽의 형태적 변이와의 상관관계를 이해해야 할 것이다. 본 연구에서는 동백나무 미숙배 배양으로부터 발생되는 체세포배의 자엽변이 형태, 발생빈도 및 식물체로의 발아율을 대두 (Buchheim et al. 1989)와 더덕 (Soh et al. 2001)에서 제시한 기준에 따라 조사함으로 그 상관관계를 이해하고자 수행하였다.
제안 방법
- 또한 동백 배발생 캘러스로부터 형성된 2개의 자엽을 갖는 체세포배와 1개, 3개, 4개 이상 및 Cup 모양의 자엽을 갖는 비정상적인 체세포배를 각각 분리하여 MS기본배지, ½MS배지, 0.1 mg/L GA3가 첨가된 ½MS배지 및 0.1 mg/L IBA와 GA3가 조합첨가된 ½MS배지에 치상하여 식물체 재생빈도를 측정하였다.
- 미숙배는 70% 알코올로 3회 표면 살균한 열매로부터 무균적으로 조심스럽게 분리하여 배발생 캘러스 유도배지 (MS salts, Eriksson’s vitamins, Thiamine-HCl, 1 mg/L 2,4-D, 3% sucrose, 100 mg/L myo-inositol, 0.8% Phyto agar, pH 5.8)에 치상한 후 24℃에서 4주 이상 암 배양 하면서 배발생 캘러스를 유도하였다.
- 동백의 배발생 캘러스는 1 mg/L 2,4-D가 첨가된 MS배지에서 미숙배 배양을 통해 유도하였으며, 동일배지에 계대 배양하여 4주 이상 증식시켰다. 배발생 캘러스로부터 자엽기 체세포배를 생산하기 위하여 2,4-D가 첨가되지 않은 MS기본배지 배양하였다. 동백 미숙배로부터 체세포배 발생율은 25.
- 배양 8주 후 배발생 캘러스로부터 자엽기의 체세포배를 유도하기 위하여 2,4-D가 첨가되지 않은 MS기본배지 (MS salts, Eriksson’s vitamins, Thiamine-HCl, 3% sucrose, 100 mg/L myo-inositol, 0.8% Phyto agar, pH 5.8, Murashige & Skoog 1962)에 옮겨 24℃로 조절되는 배양실에서 광주기 (46 μmol m-2s-1의 16 hr)하에서 약 3주 이상 배양하였으며, 배양 4주째 각 배발생 캘러스로부터 발생된 자엽기 체세포배에서 (300개 이상/회) 2개의 자엽을 갖는 정상적인 체세포배와 비정상 자엽형태를 갖는 체세포배, 즉 1개 자엽, 3개자엽, 4개 이상의 자엽 그리고 Cup모양 자엽을 갖는 체세포배로 분류하여 (Buchheim et al. 1989; Soh et al. 2001) 각각의 발생빈도를 조사하였다.
- 1 mg/L IBA와 GA3가 조합첨가된 ½MS배지에 치상하여 식물체 재생빈도를 측정하였다. 식물체 재생 기준은 1차엽을 갖는 유경과 유근이 발생되었을 때 그리고 배양 6 주 후 조사하였다. 배양은 24℃로 조절되는 배양실에서 광도 46 μmol m-2s-1의 16 시간 광주기하에서 배양 하였고, 유식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 순화하였다.
- 8)에 치상한 후 24℃에서 4주 이상 암 배양 하면서 배발생 캘러스를 유도하였다. 이때 동백나무 미숙배로부터 형성된 배발생 캘러스 및 체세포배를 갖는 미숙배 절편 수를 조사하여 체세포배 형성빈도를 조사하였다. 미숙배 배양은 3회 이상 반복하여 수행하였다.
- 자엽기의 체세포배를 해부현미경하에서 2개, 1개, 3개, 4개 이상 및 cup모양의 자엽을 갖는 체세포배를 분류하여 MS기본배지, ½MS배지, 0.1 mg/L GA3 가 단독첨가된½MS배지 그리고 0.1 mg/L IBA와 GA3가 조합 첨가된 ½MS배지에서 각각 식물체 재생빈도를 조사하였다.
대상 데이터
- 광주광역시 남부대학교 캠퍼스에 자라고 있는 동백나무로부터 2010년 8~9월경에 열매를 채취하여 > 10 mm크기의 미숙배를 얻어 실험재료로 사용하였다.
- 동백나무 미숙배로부터 왕성하게 자라는 연한 노란색의 배발생 캘러스를 선발하여 동일배지에 4주 간격으로 계대 배양하면서 증식하였다. 배양 8주 후 배발생 캘러스로부터 자엽기의 체세포배를 유도하기 위하여 2,4-D가 첨가되지 않은 MS기본배지 (MS salts, Eriksson’s vitamins, Thiamine-HCl, 3% sucrose, 100 mg/L myo-inositol, 0.
성능/효과
- 1C). 3회의 반복실험을 통하여 총 1,057개의 미숙 배를 배양한 결과 배발생 캘러스를 갖는 미숙배의 수는 265개로 약 25.1%의 체세포배 발생빈도를 보여 주었다 (데이터 미제시). 식물에 따라 체세포배 발생빈도는 식물의 종, 식물재료, 성숙도, 배지, 호르몬의 조건에 따라 달라질 수 있다.
- 배발생 캘러스로부터 자엽기 체세포배를 생산하기 위하여 2,4-D가 첨가되지 않은 MS기본배지 배양하였다. 동백 미숙배로부터 체세포배 발생율은 25.1%였으며, 형성된 대부분의 체세포배 중에서 48.3%가 cup모양, 12.6%가 1개 자엽, 9.4%가 3개 자엽, 1.9%가 4개 자엽을 갖는 비정상적인 형태의 체세포배였으며, 반면 2개의 자엽을 갖는 정상적인 체세포배는 27.5%였다. 정상 및 비정상형태의 체세포배를 MS기본배지, ½MS배지, 0.
- 1 mg/L IBA와 GA3가 식물체 재생에 효과적임을 알 수 있었다. 또한 2개의 자엽을 갖는 정상 체세포배는 1개, 3개, 4개 이상 및 cup모양의 자엽을 갖는 비정상 체세포배에 비하여 모든 배지에서 높은 식물체 재생빈도를 보여주었으며, 특히 cup모양은 최대 4.2%, 1개 자엽은 8.3%, 3개 자엽은 5.8%로 낮은 식물체 재생빈도를 나타냈다 (Fig. 3). 유경과 유근이 발달된 유식물체는 토양으로 옮겼을 때 정상적인 건강한 식물체로 자랐다 (Fig.
- 배양 3주 후 2개의 자엽을 갖는 정상 체세포배와 비정상 체세포배 모두 0.1 mg/L IBA와 GA3가 조합첨가된 ½ MS배지에서 가장 높은 식물체 재생빈도를 보여 주었고, MS기본배지에서는 거의 식물체로의 재생이 이루어지지 않아 0.1 mg/L IBA와 GA3가 식물체 재생에 효과적임을 알 수 있었다.
- 2%) 보다 높았다. 이러한 결과로 볼 때 비정상 자엽을 갖는 체세포배 빈도가 높을수록 식물체 재생빈도가 감소될 수 있음을 알 수 있었다.
- 이러한 배발생 캘러스로부터 체세포배를 유도하기 위하여 호르몬이 첨가되지 않은 MS기본배지에 옮겨 3주 이상 배양한 결과 자엽기의 체세포배를 대량으로 얻을 수 있었다. 자엽기 체세포배의 자엽 수를 관찰 한 결과 2개의 자엽을 갖는 정상적인 체세포배외에도 1개, 3개, 4개 이상 및 cup모양의 자엽을 갖는 비정상적인 체세포배가 관찰되었으며 (Fig. 1 E-I), 전체 903개의 체세포배중에서 2개의 자엽을 갖는 체세포배는 27.5%였고, 나머지 비정상 형태의 체세포배가 72.5%였다. 특히 비정상 체세포배중에서 1개 자엽은 12.
- 정상 및 비정상형태의 체세포배를 MS기본배지, ½MS배지, 0.1 mg/L GA3가 첨가된 ½MS배지 및 0.1 mg/L IBA와 GA3가 조합 첨가된 ½MS배지에 치상하였을 때 2개의 자엽을 갖는 정상체세포배의 식물체 재생율이 11.1%로 0.0 ~ 8.3%를 나타내는 1개 자엽 (0.0 ~ 8.3%), 3개 자엽 (0.0 ~ 5.8%), 4개 자엽 (0.0%) 및 cup 모양 (0.3 ~ 4.2%) 보다 높았다.
- 5%였다. 특히 비정상 체세포배중에서 1개 자엽은 12.6%, 3개 자엽은 9.4%, 4개 이상의 자엽은 1.9%로 자엽의 수가 증가함에 따라 점점 감소하였고, cup모양의 자엽을 갖는 체세포배는 48.3%로 가장 높은 빈도를 나타냈다 (Fig. 2). 일반적으로 식물 조직배양과정에서 발생되는 체세포배 중에는 자엽의 형태적 변이가 발생될 수 있음을 보고 하였고 (Ammirato 1987), 그 원인은 배지에 첨가되는 식물호르몬의 종류와 농도, 탄수화물, 오옥신 이동억제제 등이 원인이 될 수 있다 (Komatsuda 1992; Liu et al.
- 1A, B). 해부 현미경하에서 자엽부위로부터 형성된 배발생 캘러스를 조심스럽게 선발한 후 동일배지에 옮겨 8주 이상 배양한 결과 초기 배발생 캘러스보다는 약간 부드럽고 구형기의 체세포배를 포함한 배발생 캘러스가 왕성하게 증식되었다 (Fig. 1C). 3회의 반복실험을 통하여 총 1,057개의 미숙 배를 배양한 결과 배발생 캘러스를 갖는 미숙배의 수는 265개로 약 25.
후속연구
- 이와 같이 기존의 연구와 마찬가지로 2개의 자엽을 갖는 정상 체세포배에 비하여 비정상 체세포배가 식물체로의 낮은 재생율을 보여 준 것은 비정상적인 정단분열조직의 발달에 기인한것으로 추정되며, 이는 근본적으로 배양액 첨가는 탄수화물이나 식물호르몬의 불균등한 분포에 의하여 일어난 현상으로 추정할 수 있었다. 따라서 동백을 포함한 많은 식물에서 고빈도의 식물체체 재생빈도를 증가시키고, 향후 식물형질전환을 위한 재분화시스템으로 이용하고자 할 때는 비정상 체세포배의 발생빈도를 줄일 수 있는 배양조건의 규명이 선행 되어야 할 것으로 사료된다.
- 1993) 시킬 수 있다고 보고하였다. 따라서 동백의 체세포배 발생을 통한 식물체 대량증식이나 형질전환체 생산 연구를 성공적으로 수행하기 위해서는 기내 배양과정에서 발생되는 체세포배의 형태적 변이와 발생빈도를 파악해야 할 것이고, 각 비정상적인 체세포배의 식물체 재생빈도와 자엽의 형태적 변이와의 상관관계를 이해해야 할 것이다. 본 연구에서는 동백나무 미숙배 배양으로부터 발생되는 체세포배의 자엽변이 형태, 발생빈도 및 식물체로의 발아율을 대두 (Buchheim et al.
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