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문제 정의
- 이렇듯 차전초의 안전성은 확보되어 있고, 오래전부터 한방 및 민간요법에서 꾸준히 이용되어 왔으나 아직 그 기능성에 대한 연구는 많이 미흡한 실정이기 때문에, 본 연구진은 차전초의 다양한 생리활성 가능성을 가진 차전초 추출물을 랫드에 투여하여 Fe-NTA로 전립선에 유발된 산화 스트레스에 대해 어떠한 영향을 미치고, 보호효과를 가질 수 있는지를 규명하여 기능성 소재 후보로서 차전초잎 주정에탄올 추출물(PLE)의 가능성을 연구하였다.
- 이에 본 연구진은 랫드에 차전초잎 주정에탄올 추출물(F asiatica leaf ethanolic extract; PLE)의 산화적 스트레스에 대한 전립선 보호 효과를 과학적으로 확인하기 위한 시험을 실시하였다. Matos 등은 ferric nitrilotriacetate (Fe-NTA)를 랫드에 복강투여하여 DNA 손상 지표인 8-oxodGuo의 수치를 측정함으로써 Fe-NTA가 전립선에 산화 스트레스를 일으키는 것을 확인하였으며#, 본 실험에서도 Fe-NTA를 이용하여 전립선에 산화 스트레스를 유발하여 PLE를 투여한 후 전립선 보호효과를 확인하였다.
제안 방법
- 각 그룹의 랫드는 무작위적으로 배정하였다. PLE투여는 임상적용경로와 같이 경구로 투여하였으며, PLE를 농도별로 1일 1회 7일간 같은 시각에 투여하였고, 마지막 날인 7일째 되는 날 Fe-NTA (0.24 mmol Fe/kg b.w.)를 복강 주사하여 급성 전립선 독성을 유발하였다. 대조군 그룹에는 Fe-NTA 대신 생리식염수를 복강 주사하였다.
- )를 복강 주사하여 급성 전립선 독성을 유발하였다. 대조군 그룹에는 Fe-NTA 대신 생리식염수를 복강 주사하였다.
- 01)를 보이며 MDA 생성을 감소시켜 PLE의 조직 내 지질과산화물 생성 억제 효과를 확인 하였으며, 이는 앞선 항산화 바이오 마커들과 더불어 PLE의 산화 스트레스 대한 전립선 보호 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 본 연구진은 차전초 추출물의 신장 보호 연구를 수행하였으며, 이 연구에서 차전초 추출물은 산화적 손상을 입은 신장 조직의 GSH, GR, GST level 을 증가시켰고, 또한 신장 조직의 지질과산화물 생성을 억제하였다29). 이는 치-전초 추출물이 전립선 조직뿐만 아니라 신장에서도 높은 항산화 효과를 보이며 조직보호 활성을 나타내는 것으로서, 차전초에 함유된 높은 항산화 활성을 지닌 plantamajoside에 의한 것으로 판단된다9).
- 랫드에 복강 주사 후 18시간이 경과하였을 때 랫드를 C0로 마취시킨 후 희생시켜 전립선 조직을 적출하였다. 전립선 조직은 생화학적 분석을 위해 액체 질소로 급속 냉동 한 후 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.
- 먼저 1주일간 검역 및 순화를 실시한 후 건강하다고 판정된 것 중 체중이 260±5g인 것을 선별하여 시험에 사용하였다. 사육 조건은 온도 23±3℃ 상대 습도 50±10%, 조명 시간 12시간(08:00 점등 ~20:00소등), 조도 150 ~ 300 Lux, 환기 회수 10 ~ 20 회/hr로 설정된 환경에서 랫드 사육상자(225 Wx200Lx 180 H mm)당 1마리를 사육하였다. 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 실험 그룹은 총 5개의 그룹으로, 아무것도 처리하지 않은 대조군, Fe-NTA를 처리하여 산화스트레스를 유발한 음성 대조군, PLE 1, 2, 4g/kg b.w. 의 농도로 경구 투여 후 Fe-NTA를 처리한 그룹이다. 각 그룹의 랫드는 무작위적으로 배정하였다.
- 4)를 더한 후 100mM 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)를 잘 혼합하고 5분후에 412nm에서 분광광도계를 이용하여 측정하였디,. 이때 상등액 대신 GSH 표준품의 농도별 값을 구하여 검량곡선을 그린 후 샘플의 GSH 함량을 측정하였다.
- 등이 쥐에게 Fe-NTA를 복강 주사하여 전립선 조직에 산화 스트레스에 의한 DNA damage * 유발하였다14). 전립선 조직은 특히 산화 스트레스에 취약한 조직으로 알려져 있으므로7), 전립선에 유발된 산화 스트레스를 보호하는 효과를 활성산소를 제거하는데 중요한 역할을 하는 GSH, GST, 및 GR 과 세포 손상의 지표인 MDA를 통해 확인하였다.
대상 데이터
- (주) 약초장터를 통해 충청북도 제천산의 다 자란 차전초 잎을 구매하였다. 먼저, 차전초 잎을 1차 동결건조 한 후 분쇄하여 주정에탄올로 3시간 동안 3번 반복 환류 냉각 하여 추출 한 후, 원심분리기를 이용하여 7000 rpm, 15분, 4℃로 원심분리 후 상등액을 Whatman No.
- 4로 보정하여 제조하였다. Fe-NTA 용액은 신선하게 준비된 상태로 시험에 즉시 사용하였다.
- 시험 동물은 7~8 주령의 Wistar rat을 (주) 샘타코에서 구입하여 사용하였다. 먼저 1주일간 검역 및 순화를 실시한 후 건강하다고 판정된 것 중 체중이 260±5g인 것을 선별하여 시험에 사용하였다. 사육 조건은 온도 23±3℃ 상대 습도 50±10%, 조명 시간 12시간(08:00 점등 ~20:00소등), 조도 150 ~ 300 Lux, 환기 회수 10 ~ 20 회/hr로 설정된 환경에서 랫드 사육상자(225 Wx200Lx 180 H mm)당 1마리를 사육하였다.
- 시험 동물은 7~8 주령의 Wistar rat을 (주) 샘타코에서 구입하여 사용하였다. 먼저 1주일간 검역 및 순화를 실시한 후 건강하다고 판정된 것 중 체중이 260±5g인 것을 선별하여 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며 SigmaStat version 10 (Systat Software Inc., Point Richmond, CA, USA)을 사용하여 Holm-Sidak 방법을 이용하여 일원 분산분석으로 유의차 검정을 실시하였고 p<0 .05 이상의 경우에만 그룹 간 유의차가 있는 것으로 인정하였다.
이론/모형
- Fe-NTA 용액은 Khan and Sultana15^] 방법을 이용하여, ferric nitrate (0.24 mmol/kg body weight(b.w.)) 용액을 NTA (0.96 mmol/kg b.w.) 용-액과 혼합한 후 sodium bicarbonate로 pH를 7.4로 보정하여 제조하였다. Fe-NTA 용액은 신선하게 준비된 상태로 시험에 즉시 사용하였다.
성능/효과
- 01)를 보이며 GSH 생성을 회복시키는 것으로 나타났다.Table 1에서 보는 바와 같이 PLE 1, 2 또는 4g/kg b.w. 투여 한 그룹은 119.0077 ± 1.2277, 150.7950 ± 341097, 182.9910 ± 10.8874 mmol GSH/g tissue로 Fe-NTA 단독 처리군에 비해 GSH 함량이 약 1.2, 1.5, 1.8배 증가한 것으로 나타나 PLE 가 Fe-NTA에 의해 유발된 산화 스트레스에 대한 전립선 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이는 PLE가 항산 화물질로 작용하는 GSH 생성을 회복시켜 산화스트레스에 대한 방어 효과를 나타내는 것으로 추정할 수 있다.
- 75%가 감소하여 FeNTA에 의한 전립선의 손상을 보였다. 그러나 PLE 1, 2 또는 4g/kg b.w. 을 각각 투여한 그룹에서 Table 1과 같이 19.2360 ±80.5326, 19.1665 ± 3.3053, 26.8816 ± 4.3994 Units/ g tissue으로 GN] 함량이 농도 의존적으로 다시 증가하는 것을 확인 하였다. 심지어 GR 함량이 4g/kg b.
- 이는 PLE가 항산 화물질로 작용하는 GSH 생성을 회복시켜 산화스트레스에 대한 방어 효과를 나타내는 것으로 추정할 수 있다. 또한 본 연구에서는 아무것도 처리하지 않은 정상대조군과 PLE 4 g/kg b.w. 투여군이 유의적 차이를 나타내지 않으며 비슷한 GSH 함량을 나타내 항산화 효과를 기본으로 한 차전초의 전립선 보호 효과가 매우 높음을 확인할 수 있었다•.
- (Table 1). 반면, 차전초 주정에탄올 추출물 처리군에서는 음성 대조군에 비해 GSH 함량이 농도 의존적으로 증가했 으며 4g/kg b.w.의 농도 투여군 에서는 유의적 차이(**P< ( 0.01)를 보이며 GSH 생성을 회복시키는 것으로 나타났다.Table 1에서 보는 바와 같이 PLE 1, 2 또는 4g/kg b.
- 본 실험에서 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(3132493.8508 Unit/g tissue)에 비해 Fe-NTA에 의해 전립선에 산화 스트레스가 유발된 그룹의 GR 함량이 15.7394±2.9244 Units/g tissue로 정상 그룹 대비 49.75%가 감소하여 FeNTA에 의한 전립선의 손상을 보였다. 그러나 PLE 1, 2 또는 4g/kg b.
- Khan and Sultana15)는 Fe-NTA에 의한 산화스트레스 때문에 GST가 감소하는 것을 보였으며, 이에 isoHavone을 투여하여 GST가 다시 회복이 되는 결과를 보였다. 본 저자 도 랫드의 전립선에서 GST가 정상대조군(96.1090±6.2256 units/g tissue)에 비해 Fe-NTA를 처리한 그룹이 44.56% 감 소(53.2861 ± 11.4480units/g tissue)한 결과를 보여 전립선에 산화 스트레스가 가해졌다는 것을 추정할 수 있었다. 하지만 PLE를 1, 2, 4g/kg b.
- PLE는 이러한 산화적 손상에 대응하여 GSTW GR을 정상 대조군 수준까지 회복시킴으로써 전립선 기관을 보호하고, 회복된 GR의 수준은 산화스트레스로부터 전립선 내의 정자를 보호하는데 큰 역할을 담당하는 GSH의 환원을 유도했다. 요약하면, 전립선에 유발된 산 화 스트레스에 대해 대표적인 항산화 바이오마커들인 GSH, GR, GST는 차전초 추출물 4g/kg b.w. 의 농도에서 정상 수준의 회복을 보임으로써 전립선의 손상 억제 효과를 나타내었다.
- 1220 mmol/g tissue의 MDA 생성량을 보였다. 이는 음성대조군에 비해 약 28.49, 35.07, 55.39%의 감소효과를 보이며 Fe-NTA 산화스트레스에 의해 유발된 전립선 세포 인지질 막의 손상을 보호하는 효과를 확인할 수 있었다. 특히 지질과산화물에 대해서는 1 ggkg b.
- 39%의 감소효과를 보이며 Fe-NTA 산화스트레스에 의해 유발된 전립선 세포 인지질 막의 손상을 보호하는 효과를 확인할 수 있었다. 특히 지질과산화물에 대해서는 1 ggkg b.w. 농도 투여군 부터 유의적 차이(**P< 0.01)를 보이며 MDA 생성을 감소시켜 PLE의 조직 내 지질과산화물 생성 억제 효과를 확인 하였으며, 이는 앞선 항산화 바이오 마커들과 더불어 PLE의 산화 스트레스 대한 전립선 보호 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 본 연구진은 차전초 추출물의 신장 보호 연구를 수행하였으며, 이 연구에서 차전초 추출물은 산화적 손상을 입은 신장 조직의 GSH, GR, GST level 을 증가시켰고, 또한 신장 조직의 지질과산화물 생성을 억제하였다29).
- 4480units/g tissue)한 결과를 보여 전립선에 산화 스트레스가 가해졌다는 것을 추정할 수 있었다. 하지만 PLE를 1, 2, 4g/kg b.w. 을 투여한 그룹에서는 각각 65.7473 ± 9.7903, 76.5387 ± 4.4407, 91.6616 ± 5.5282 units/g tissue로 유의적 차이(*P<0.05, **P< 0.01)를 보이며 GST 함량이 증가하는 양상을 확인하였고, 특히 PLE 4 g/kg b.w. 을 투여한 그룹은 정상 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이는 PLE가 우리 몸에 항산화 작용 및 외부 독성 물질 제거에 관여하는 phase II 효소인 GST를 증진시켜 FeNTA에 의해서 유발된 산화 스트레스 및 세포 손상을 억제 하여 준다고 판단된다.
후속연구
- 이는 치-전초 추출물이 전립선 조직뿐만 아니라 신장에서도 높은 항산화 효과를 보이며 조직보호 활성을 나타내는 것으로서, 차전초에 함유된 높은 항산화 활성을 지닌 plantamajoside에 의한 것으로 판단된다9). 이후의 연구에서는 차전초 추출물에서 전립선 보호 효과를 가지는 활성 물 질을 증명하기 위하여 단일 물질인 piatamajoside를 통한 조직에서의 보호 활성을 연구하는 것이 필요할 것이다.
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