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문제 정의
- 따라서 본 연구는 유속세포분리 시 시료와 가장 가까운 환경인 sheath fluid에 HEPES를 농도 별로 처리했을 때 정자 생존율과 더불어 방치 시간과 온도 별 처리도 병행하여 유속 세포 분리에 있어 가장 적합한 조건을 찾아 한우 정자의 성 분리 후 생존율을 개선하고자 실시하였다.
- 본 연구는 유속세포분리 시 sheath fluid에 HEPES를 농도, 처리시간 및 온도 별로 처리했을 때 정자 생존율을 분석하여유속세포분리예 있어 가장 적합한 조건을 찾고 한우 정자의 성 분리 후 생존율을 개선하고자 실시하였다. 그 결과, 정자의 생존율은 HEPES의 농도와 상관없이 시간이 지날수록 낮아지는 경향을 보였다.
제안 방법
- 완충액 제조에 사용된 모든 시 약은 SIGMA(SIGMA-Aldrich corporation, USA)사의 제품을 이용하였다. HEPES를 첨가한 완충액이 정자의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 38°C 항온 수조에서 45초간 융해한 동결정액을 1, 500 rpm에서 5분간 원심분리하여 동결액을 제거하고, 2시0 sperm/ml의 농도로 맞추어 각각 0, 2.5, 5, 7.5 및 10 mM HEPES가 함유된 완충액에 노출시켰다. 또한 농도마다 노출 시간에도 차이를 주어 0, 30, 60 및 120분 동안 방치하고 방치 시간이 길어짐에 따라 정자의 생존율이 어떠한 양상을 보이는지 관찰하였다.
- 5 mM HEPES 완충액에 부유시킨 정자를 다시 원심분리(1, 500 rpm, 5분)로 세척하고, 정자의 농도를 ml당 2xlV개가 되도록 같은 완충액으로 희석하였다. 그리고 Hoe- chst33342로 DNA를 형광 염색하여 전처리를 마친 뒤 강원대학교 공동실험실습관에 의뢰하여 BD FACSAria™ System(BD, USA)을 통해 4, 20 및 37°C로 온도를 설정한 뒤 정자를 성 분리한 후 생존율을 관찰하였다. 반복 실험을 위하여 같은 과정을 3회 거듭하여 실험 결과를 분석하였다.
- 5). 대조구는 성 분리과정 없이 38°C에서 45초간 동결융해한 정자의 생존율을 분석하여 나타낸 것이다. X-정자의 생존율은 Fig.
- 5 및 10 mM HEPES가 함유된 완충액에 노출시켰다. 또한 농도마다 노출 시간에도 차이를 주어 0, 30, 60 및 120분 동안 방치하고 방치 시간이 길어짐에 따라 정자의 생존율이 어떠한 양상을 보이는지 관찰하였다. 한편, 유속세포기를 사용하여 정자 분리실험을 할 때 가장 적정한 온도를 찾기 위해 냉장 온도인 4°C, 실내 온도인 20°C와 한우의 체내 온도와 비슷한 38℃에서 농도 및 시간별 생존율을 검토하였고 총 3희에 걸쳐 반복 실험하였다.
- 염색에 사용될 시약은 각각 DMSO에 Q02 nN의 SYBR-14를 첨가하고 증류수에 2.4 mM의 PI를 혼합하여 원액을 만든 뒤 SYBR-14는 0.187 “M, PI는 38.4 “M을 함유하는 염색약을 만들어 실험하였다. 한우 정액 50“1를 염색약과 함께 빛이 없는 조건으로 37°C에서 30분간 배양한 후 형광현미경(MOO)을 통해 관찰하였다.
- 유속세포분리기를 이용하여 온도를 다르게 설정한 뒤 한우의 정자를 성 분리하였고, 분리된 정자는 X-정자와 Y-정자의 생존율을 각각 비교분석하여 도표로 나타냈다(Fig. 4와 Fig. 5). 대조구는 성 분리과정 없이 38°C에서 45초간 동결융해한 정자의 생존율을 분석하여 나타낸 것이다.
- 4 “M을 함유하는 염색약을 만들어 실험하였다. 한우 정액 50“1를 염색약과 함께 빛이 없는 조건으로 37°C에서 30분간 배양한 후 형광현미경(MOO)을 통해 관찰하였다. 살아있는 정자는 SYBR-14가 염색되어 녹색을 띄고, 죽은 정자는 PI가 투과하여 붉은색을 나타낸다(Thomas 등, 1997).
- 또한 농도마다 노출 시간에도 차이를 주어 0, 30, 60 및 120분 동안 방치하고 방치 시간이 길어짐에 따라 정자의 생존율이 어떠한 양상을 보이는지 관찰하였다. 한편, 유속세포기를 사용하여 정자 분리실험을 할 때 가장 적정한 온도를 찾기 위해 냉장 온도인 4°C, 실내 온도인 20°C와 한우의 체내 온도와 비슷한 38℃에서 농도 및 시간별 생존율을 검토하였고 총 3희에 걸쳐 반복 실험하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 이용된 HEPES 완충액은 3차 증류수에 111.9 mM NaCl, 4.96 mM KCI, 5 mM NaHCO3, 0.95 mM CaCl, - H2O, 1.05 mM MgCl2 . 6H2O, 0.
- 본 연구에 사용된 정액은 횡성축산협동조합의 종모우로부터 인공 질 법을 통해 채취하였다. 정액 채취 시 인공질의 내부 온도는 36〜40℃(평균 38°C)로 유지될 수 있도록 하였다.
- 2). 완충액 제조에 사용된 모든 시 약은 SIGMA(SIGMA-Aldrich corporation, USA)사의 제품을 이용하였다. HEPES를 첨가한 완충액이 정자의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 38°C 항온 수조에서 45초간 융해한 동결정액을 1, 500 rpm에서 5분간 원심분리하여 동결액을 제거하고, 2시0 sperm/ml의 농도로 맞추어 각각 0, 2.
- 정액 채취 시 인공질의 내부 온도는 36〜40℃(평균 38°C)로 유지될 수 있도록 하였다. 채취된 원정액은 희석액(TRILADYL®, KRUUSE, Cat. no. 340244)과 1:1 비율로 혼합한 뒤 4°C로 유지된 스티로폼 상자에 담아 1시간 이내에 실험실로 운반하였다. 운반된 정액은 최종 농도를 5xn)7sperm/ml로 맞춘 뒤, 0.
데이터처리
- 실험을 통해 얻은 수치 결과는 각각의 평균에 대하여 SAS (version 9.1)에서 다양한 형태의 분산분석(ANOVA)을 수행할 수 있는 GLM(General Linear Models) 프로시저를 적용하였고, 던칸다중검정법(Dimcarfs multiple range test)을 이용하여 통계학적으로 분석했다. 유의차는 신뢰도 95%(p<0.
이론/모형
- 정자의 생존율을 검사하기 위해서 Maxwell과 Johnson] 1997b) 및 Lee 등(2005)의 방법에 준하여 Live/Dead Sperm viability kit(Molecular probes, USA, L-7011)의 SYBR-14/P1 염색법으로 분석하였다. 염색에 사용될 시약은 각각 DMSO에 Q02 nN의 SYBR-14를 첨가하고 증류수에 2.
성능/효과
- 농도실험과 달리 유속세포분리를 통한 실험에서 온도를 37笆로설정한 이유는 기계 설정에 38°C가 없었기 때문이다. 그러나 3 7笆에서 유속세포분리를 실시해도 생존율에 있어서 대조 구와 유의차는 없는 것으로 보아 5 mM의 H/PES가 포함된 sheath fhiid를 이용하여 37"C에서 성 분리를 할 경우, 유속 세포 분리로 인한 피해가 줄어들어 동결융해 후 정자의 생존율과 차이가 없는 것으로 판단된다
- 5 mM HEPES를 아!邸h fluid로 시용하여 성 분리한 후의 생존율은 *정자가 Y-정자보다 온도에 민감하게 반응하였으며, 따라서 X-와 Y-정자 모두 대조구와 유의차가 없었던 37°C 에서 분리하는 것이 가장 적당한 조건이라고 생각된다. 농도실험과 달리 유속세포분리를 통한 실험에서 온도를 37笆로설정한 이유는 기계 설정에 38°C가 없었기 때문이다.
- 후 생존율을 개선하고자 실시하였다. 그 결과, 정자의 생존율은 HEPES의 농도와 상관없이 시간이 지날수록 낮아지는 경향을 보였다. 특히 한 마리의 정액을 모두 성 분리하는데 소요되는 시간인 60에서 [가)분 사이를 기준으로 농도 별 생존율에서 2.
- 마지막으로 38°C에서 처리시간이 경과함에 따른 생존율이 다른 온도에 비해 완만하게 하락하는 경향을 보였으나, HEPES를첨가하지 않은 집단에서는 120분 처리 시 급격하게 생존율이 낮아지는 양상을 보였다(p<0Q5). 또한 10 mM의 HEPES를 첨가한 처리구는 0, 30 및 60분에서 모두 유의적으로 낮은 생존율을 보였다(p<0.05). 비록 2.
- 5 mM 처리구와 유의적인 차이는 인정되지 않았으나, 5 mM의 HEPES를 혼합한 집단이 가장 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다. 마지막으로 38°C에서 처리시간이 경과함에 따른 생존율이 다른 온도에 비해 완만하게 하락하는 경향을 보였으나, HEPES를첨가하지 않은 집단에서는 120분 처리 시 급격하게 생존율이 낮아지는 양상을 보였다(p<0Q5). 또한 10 mM의 HEPES를 첨가한 처리구는 0, 30 및 60분에서 모두 유의적으로 낮은 생존율을 보였다(p<0.
- 3까지 나타냈다. 모든 온도에서 HEPES의 처리 시간이 길어질수록 정자의 생존율은 낮아지는 경향을 보였다. Fig.
- 본 연구의 결과 정자의 생존율은 HEPES의 농도와 상관없이 시간이 지남에 따라 감소하는 양상을 보였으나, 38°C에서는 다른 온도에 비해 완만하게 감소하는 것으로 나타났다. 한편, 38°C에서 HEPES를 첨가하지 않은 대조구는 HEPES가 첨가된 그룹에 비해 60분에서 120분 사이에 생존율이 매우 급격하게 하락했다.
- 05). 비록 2.5 mM HEPES와 유의적 차이를 보이지는 않았지만, 5 mM HEPES는 60분에서 가장 높은 생존율을 나타냈다.
- 5 mM과 유의적 차이는 인정되지 않았지만 5 mM HEPES를 첨가했을 때 생존율이 가장 높게 나타났다. 온도별 실험에서는 소의 체내 온도와 비슷한 38°C 에서 다른 온도와는 다르게 시간에 따른 생존율 감소가 완만하게 나타났다. 또한 같은 온도에서 HEPES를 첨가하지 않은 완충액을 사용한 처리구는 HEPES를 사용한 모든 처리구보다 60에서 !20분 사이에서 매우 급격하게 생존율이 감소하였다3<005).
- 유속세포분리 시 한 마리의 정액을 모두 성 분리하는데 소요되는 시간은 60분에서 120분 사이이다. 이와 같이 정자의 성 분리에 소요되는 시간을 기준으로 비교했을 때 5 mM 의 HEPES가 첨가된 배양액을 사용하였을 경우 생존율이 유의적으로 높게 나타났고(pO.05), 특히 38 °C 에서 처리 시간에 따른 생존율의 감소폭이 적게 나타나 유속세포분리 시 적용할 수 있는 적정 온도라 여겨진다.
- . 총 120분 동안 처리한 정자에서는 생존율에 유의차가 인정되지 않았고, 30분에서는 HEPES를 첨가하지 않은 대조구에서 유의적으로 가장 높은 생존율을 나타냈다(p<0.05). 한편, 60분간 처리한 경우, 2.
- 05). 한편, 60분간 처리한 경우, 2.5 mM 처리구와 유의적인 차이는 인정되지 않았으나, 5 mM의 HEPES를 혼합한 집단이 가장 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다. 마지막으로 38°C에서 처리시간이 경과함에 따른 생존율이 다른 온도에 비해 완만하게 하락하는 경향을 보였으나, HEPES를첨가하지 않은 집단에서는 120분 처리 시 급격하게 생존율이 낮아지는 양상을 보였다(p<0Q5).
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