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문제 정의
- Lactose-based 희석액은 pellets으로 동결보존으로 이용하 고자 하였고(Seager 등, 1975), Tris-citric acid 희석 액은 straws에 동결정액을 제조하고자 하였다(Battista 등, 1988). 따라서 본 연구에서는 Tris-citric acid 희 석액을 이용해 straws에서 개의 동결보존을 실시하 고자 하였다.
- 공사견은 총 4두로 생후 12~24개월령의 혈통관리된 종견이 었으며 사육장의 견방당 1마리씩 단독사육을 원칙 으로 사육 관리하였다. 본 연구결과를 토대로 진 도개의 선발은 진도군에서 사육되고 있는 진도개 순종중에서 외모심사규정에 의해 우수한 진도개를 선발하여 장차 인공수정 및 유전자원보존 등에 이 용할 수 있는 종견으로 활용하기로 하였다.
제안 방법
- 48), Osmonality(280, 1, 370mOsm/kg)로 조정되었다. 원정액의 정자수(농도), 활력과 생존율 등을 조사하여 동결정액 제조의 가능 여부를 판단하여 동결이 가능한 정액을 Ext I으로 희석하여 5℃ cold room에서 2시간 정도 방치하여 5"C까지 냉각 시켜 같은 온도의 동량 Ext n를 약 1시간에 걸쳐 희석, 평형을 유도하였다. 평형후 최종농도가 50 X 106 cells/ml 되 게 조정후 0.
- 동결정액 제조를 위한 Tris-buffere Rota 등 (1997)의 방법에 준하여 제조하였는데 이의 조성 표는 Table 1과 같다. Ext II에만 8% 이ycerol(최종 4%)과 1% Equex STM paste(최종농도 0.5%)를 첨 가하였다. 이렇게 제조된 Ext I, Ⅱ의 최종 pH(6.
- 단당류인 fructose와 Xylose 및 2당류인 Trehalose의 첨가농도는 최종적으로 70 mM이 되도록 조정하였다. Fru + Tre, Fru + Xyl, Tre + Xyl의 이중조합군은 각각 35 mM씩 70 mM 로, Fru + Tre + Xyl의 3중 조합군은 25 + 25 + 20 mM씩 최종 70 mM로 조정하였다.
- 다양한 희성액이 개 정액의 안전한 동결보존을위하여 보고되었다(Foote, 1964; Hay 등, 1997; Ivanova-Kicheva, 등, 1997; Olar 등, 1989). Lactose-based 희석액은 pellets으로 동결보존으로 이용하 고자 하였고(Seager 등, 1975), Tris-citric acid 희석 액은 straws에 동결정액을 제조하고자 하였다(Battista 등, 1988). 따라서 본 연구에서는 Tris-citric acid 희 석액을 이용해 straws에서 개의 동결보존을 실시하 고자 하였다.
- 동결된 정액의 현미경검사는 주관적인 판단 및 평가가 수반되므로 보다 정확하고 객관적인 평가가 가능한 CASAs(Computer-assisted semen analysis: Hamilton)# 이용한 정액의 운동성을 조사하였다. 검사정액 10ul를 취하여 microcell slide에 넣 고 현미경검사를 하였으며, 조사항목은 MOT(운동 정자 비율, %), PROG(전진운동정자비율, %), VAP (정자의 초당 평균이동속도, um/sec), VCL(정자의 초당 평균곡선이동속도, um/sec), VSL(정자의 초 당 평균직선이동속도, um/sec), ALH(측두거리, um)등으로 정액의 운동성을 종합적으로 조사 평가하였다.
- Tris-buffor에 첨가되는 당의 종류와 조성비율은 Table 2에서와 같다. 단당류인 fructose와 Xylose 및 2당류인 Trehalose의 첨가농도는 최종적으로 70 mM이 되도록 조정하였다. Fru + Tre, Fru + Xyl, Tre + Xyl의 이중조합군은 각각 35 mM씩 70 mM 로, Fru + Tre + Xyl의 3중 조합군은 25 + 25 + 20 mM씩 최종 70 mM로 조정하였다.
- 동결된 정액의 현미경검사는 주관적인 판단 및 평가가 수반되므로 보다 정확하고 객관적인 평가가 가능한 CASAs(Computer-assisted semen analysis: Hamilton)# 이용한 정액의 운동성을 조사하였다. 검사정액 10ul를 취하여 microcell slide에 넣 고 현미경검사를 하였으며, 조사항목은 MOT(운동 정자 비율, %), PROG(전진운동정자비율, %), VAP (정자의 초당 평균이동속도, um/sec), VCL(정자의 초당 평균곡선이동속도, um/sec), VSL(정자의 초 당 평균직선이동속도, um/sec), ALH(측두거리, um)등으로 정액의 운동성을 종합적으로 조사 평가하였다.
- 예비동결된 straw는 액체질소에 침지하여 동결정액 제조를 완료하였고, goblet에 담아 LN2 tank에 넣어 보존하였다. 동결정액의 융해는 37℃ 에서 20초간 실시하고 가온판이 부착된 현미 경하에서 정액의 활력과 생존율을 검사하고 CASA 검사로 정액의 운동성을 평가하여 인공수정 이용 여부를 판단하였다
- 본 연구에서는 당의 종류뿐만 아니라 이들을 2 종류 또는 3종류의 당을 조합하여 Tris-buffer에 첨가하여 정액의 동결 . 융해 후 운동성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 당의 종류뿐만 아니라 이들을 2 종류 또는 3종류의 당을 조합하여 Tris-buffer에 첨가하여 정액의 동결 . 융해 후 운동성을 조사하였다.
- Dakota, USA)에 연결시키고 음경을 마사지하여발기와 돌출을 유도하여 돌출된 음경의 구선부위(bulbus glandis)# 잡고 압력을 가하면서 음경을인공질에 삽입하여 채취하였다. 이때 음경에 상처 를 주지 않고 적당한 압력을 주면서 2차 fraction (sperm-rich Baction)만을 인공질을 이용하여 채취 하였고, 정상적인 정액만을 택하여 400xg로 약 5 분간 원심분리하여 상층액은 버리고 37℃의 2 ml Ext I으로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
- 정액채취는 1~2년생 진도개를 주당 1~2회씩 마사지법과 인공질법을 병행 실시하였다. 정액채취 수캐는 정액채취대로 옮기고 10 ml tube를 semen collection cone (AG-TEK, KANE Enterprises,S.
대상 데이터
- 정액채취와 동결정액 제조를 위해 공시되는 진 도개는 전남 진도군 진도개보육관리소의 사육장에서 선발된 종견을 순천대학교의 사육장에서 물과 사료를 자유급식시키면서 사육하였다. 공사견은 총 4두로 생후 12~24개월령의 혈통관리된 종견이 었으며 사육장의 견방당 1마리씩 단독사육을 원칙 으로 사육 관리하였다.
데이터처리
- 이상의 연구에서 얻어진 결과는 %2 test에 의하여 분석하였다.
이론/모형
- 동결정액 제조를 위한 Tris-buffere Rota 등 (1997)의 방법에 준하여 제조하였는데 이의 조성 표는 Table 1과 같다. Ext II에만 8% 이ycerol(최종 4%)과 1% Equex STM paste(최종농도 0.
성능/효과
- 정액채취와 동결정액 제조를 위해 공시되는 진 도개는 전남 진도군 진도개보육관리소의 사육장에서 선발된 종견을 순천대학교의 사육장에서 물과 사료를 자유급식시키면서 사육하였다. 공사견은 총 4두로 생후 12~24개월령의 혈통관리된 종견이 었으며 사육장의 견방당 1마리씩 단독사육을 원칙 으로 사육 관리하였다. 본 연구결과를 토대로 진 도개의 선발은 진도군에서 사육되고 있는 진도개 순종중에서 외모심사규정에 의해 우수한 진도개를 선발하여 장차 인공수정 및 유전자원보존 등에 이 용할 수 있는 종견으로 활용하기로 하였다.
- 특히 전진운동율은 수정율과 유의성이 매우 높은. 관계로서 전진운동율이 가장 높은 Fru + Tre처리구가 가장 효과적인 것으로 판단되었다.
- 0%의 운동성을 보여 유사한 결과를 얻었다. 그러나 Fru + Tre, Fru + Tre + Xyl 처 리구에서는 65.0, 69.0%의 높은 운동성을 얻어 보다 효과적인 조합인 것으로 판단되었다. 또한 전진운동율은 Fru + Tre와 Tnehalose구에서 59.
- 05). 또한 수정율과 유의성이 높은 전진 운동율은 Fru + Tre, trehalose구가 fructose, xylose, Tre + Xyl, Fru + Tre + Xyl보다 높았으며,Fru + Xyl구는 여타 다른 처리구보다 유의적으로 낮은 성적을'얻었다.
- 0%의 높은 운동성을 얻어 보다 효과적인 조합인 것으로 판단되었다. 또한 전진운동율은 Fru + Tre와 Tnehalose구에서 59.0, 55.0 %의 높은 성적을 얻어 효과적인 조합인 것으로 판 단되었다. 특히 전진운동율은 수정율과 유의성이 매우 높은.
- 7%의 운동성을 보고하였다. 본 연구에서는 단독처리구인 fiuctose와 trehalose 에서 각각 58.0, 61.0%의 운동성을 보여 유사한 결과를 얻었다. 그러나 Fru + Tre, Fru + Tre + Xyl 처 리구에서는 65.
- 동결정액 제조 시 예비동결의 시간은 약 10분 정도가 적당한 것으로 판단되었다. 예비동결을 10 분 정도 함으로서 충분한 예비동결시간을 부여함 으로써 안정적 인 예비동결을 유도할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 이렇게 조성된 희석액으로 동결보존액을 제조 하여 동결 - 융해 정자의 운동성을 조사하기 위하여 CASA system으로 평가한 자료는 Table 3에서 와 같다. 운동성은 Fru + Tre + Xyl, Fru + Tre, trehalose, fructose구가 xylose, Fru + Xyl, Tre + Xyl 구보다 유의적으로 높았다(69, 65, 61, 58 vs. 50, 20, 54%; P<0.05). 또한 수정율과 유의성이 높은 전진 운동율은 Fru + Tre, trehalose구가 fructose, xylose, Tre + Xyl, Fru + Tre + Xyl보다 높았으며,Fru + Xyl구는 여타 다른 처리구보다 유의적으로 낮은 성적을'얻었다.
후속연구
- Garcia와 Graham(1989)은 3당류는 소동결정 액 의 융해 후 운동성 에 단당류나 2당류보다 효과적이지 못하다고 지적하였다. Yildiz 등(2000) 은 융해 후 운동성이 xylose나 fiuctose에서는 증가 되었다고 보고하였는데 본 연구와 유사한 결과이나 2중 조합 및 3중 조합 중에서 Fru + Tre, Fru + Tre + Xyl의 구에서 더욱더 운동성이 높은 결과를 보여 당의 조합에 의한 새로운 희석제의 개발이 가능할 것으로 판단된다.
- 25 ml straw로 제 작하면 straw당 농도를 계산하여 제작함으로써 straw 숫자가 줄면서도 Ext I, Ⅱ의 volume이 줄어들기 때문에 희석제의 영향과 동결보호제의 실제적인 영향이 정확하게 미치게 하기 어려운 점이 있다. 그러나 본 연구결과에서는 10분 예비동결과 0.25 ml straw를 이용할 때 가장 효과적인 점을 고 려한다면 실용화 시키기 위해서는 인공수정 시 동 결정액의 농도를 낮출 수 있는 방법 또는 동결융 해 후 생존성의 향상 등을 개선해야 할 필요성이 있다.
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