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문제 정의
- 후)소단위체 간의">소단위체간의 결합에 B2c와 관련하여 어떤 잔기들이 참여되는지는 밝혀져 있지만, 그들의 단백질 생합성과 관련된 직접적인 기능으로서의 특징은 아직 밝혀진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 B2c 인터브리지의 핵심적인 역할을 하는 16S rRNA 잔기인 C770과 기능적으로 연관된 16S rRNA 염기들을 선별하기 위해 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 다음으로 플라스미드 pASS3에 있는 16S rRNA의 770번째 잔기인 C를 G로 치환시키기 위해, 플라스미드 pRNA122-G770[10]으로부터 BglII, DraIII 제한효소로 절단하여 얻어진 부위를 동일한 제한효소를 사용하여 pASS3에 클로닝하여 pASS3-C770G 플라스미드를 제조하였다. 그 후 pASS3-C770G 플라스미드를 주형으로 삼아 16S rDNA 유전자 부위에 무작위 염기치환을 일으키기 위해 PCR 반응에 0.1 mM의 MnCl2을 첨가하여 얻은 돌연변이 DNA 단편들을 BglII, DraIII로 절단한 후, 동일한 제한효소를 사용하여 pASS3-C770G에 삽입시켜, C770G의 이차복귀돌연변이체들을 얻었다. 다음으로 대략 104개의 세포를 0.1 mM IPTG, 암피실린(ampicillin, 0.1 mg/ml), 그리고 클로람페니콜의 농도가 각각 0, 50, 100, 200, 300 μg/ml 포함된 배지에서 20시간 동안 배양시킨다.
- 다음으로 플라스미드 pASS3에 있는 16S rRNA의 770번째 잔기인 C를 G로 치환시키기 위해, 플라스미드 pRNA122-G770[10]으로부터 BglII, DraIII 제한효소로 절단하여 얻어진 부위를 동일한 제한효소를 사용하여 pASS3에 클로닝하여 pASS3-C770G 플라스미드를 제조하였다. 그 후 pASS3-C770G 플라스미드를 주형으로 삼아 16S rDNA 유전자 부위에 무작위 염기치환을 일으키기 위해 PCR 반응에 0.
- 45 μm; Whatman)에 옮긴 다음, 항 CAT(Sigma), 항 S1[19] 항체를 이용하여 분석하였다. 단백질 밴드의 상대적인 양은 Versa Doc 이미징 시스템과 Quantity One 소프트웨어를 이용하여 정량하였다.
- 후)코딩 부분만을">코딩부분만을 다루기 용이하도록 플라스미드 pASS3을 제작하였다. 먼저 플라스미드 pASS2[1]의 N-cat 유전자 부분과 lacI repressor, 16S rDNA 유전자를 NcoI 제한효소로 절단한 후, NcoI 제한효소로 절단된 p16ST122[11] 플라스미드에 삽입하였다. 플라스미드 pASS3의 특징은 다음과 같다.
- 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane (Protran®, 0.45 μm; Whatman)에 옮긴 다음, 항 CAT(Sigma), 항 S1[19] 항체를 이용하여 분석하였다.
- 이 시스템을 기반으로 본 연구에서는 pASS3 플라스미드의 16S rRNA 유전자의 C770 부위에 G로 염기치환을 일으켜 단백질 합성 능력이 저하된 리보솜 돌연변이체를 만든 후, pASS3-770G를 가진 세포(최소억제농도 Cm 150 μg/ml)보다 높은 농도에서 생장하는 콜로니 100개 중 20개의 이차복 귀돌연변이체들을 발췌하였으며, DNA 염기분석 결과 이 중 하나에서 C569G, U904C의 염기치환을 가진 것으로 확인하였다(Fig. 1).
- 대장균의 16S rRNA 염기 중 진화적으로 매우 보존되어 있는 B2c 인터브리지의 구성요소 중 하나인 C770염기에 치환을 일으키면 단백질 합성이 저하되는 것으로 알려져 있다. 이 연구에서는 770 위치에 C에서 G로 염기치환(C770G)된 16S rRNA의 기능을 회복시키는 이차복귀돌연변이(secondsite revertant)를 얻기 위해 16S rRNA를 암호화하는 DNA 부분에 무작위로 염기치환을 유발시켜, 재조합 리보솜이 번역하는 CAT mRNA로부터의 단백질 합성능력이 향상된 클론을 선별하였다. 이 실험으로 C770G 염기치환을 가진 플라스미드 pASS3을 가진 세포를 암피실린(ampicillin, 0.1 mg/ml)이 포함된 배지에서 OD600=0.1이 될 때까지 배양한 후, 0.1 mM의 IPTG를 첨가하여 재조합 플라스미드로부터 기원한 SSU rRNA를 발현시키는 동시에 CAT mRNA의 합성을 유도하였다. OD600=1.
대상 데이터
- 16S rDNA 코딩부분만을 다루기 용이하도록 플라스미드 pASS3을 제작하였다. 먼저 플라스미드 pASS2[1]의 N-cat 유전자 부분과 lacI repressor, 16S rDNA 유전자를 NcoI 제한효소로 절단한 후, NcoI 제한효소로 절단된 p16ST122[11] 플라스미드에 삽입하였다.
- 본 연구에서 사용된 균주는 Escherichia coli DH5α (F-, φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96)이며, LB 배지를 사용하여 배양하였다.
- 이 때 사용되었던 프라이머는 16S-537F(5'-GGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAA-3')와 16S-1534R(5'-TGATCCAACCGCAGGTTC-3)이며, PCR 반응의 조건은 94℃에서 30초, 52°에서 30초, 72℃에서 90초의 주기로 30번을 반복하였다.
성능/효과
- 넷째, IPTG가 없는 배지 에서는 pASS3을 가지고 있는 대장균 세포는 cat mRNA를 해독할 수 있는 재조합 리보솜의 부재로 인해 클로람페니콜 (chloramphenicol)에 대한 저항성이 낮으며(최소생장억제농도 = 100 μg/ml), 0.1 mM IPTG가 포함된 배지에서는 재조합 리보솜이 발현되어 높은 농도의 클로람페니콜(최소생장 억제농도 = 600 μg/ml)에 저항성을 갖게 된다.
- ">하다[7]. 또한, 각각의 변형된 리보솜을 가진 세포들의 단백질 합성능력을 직접적으로 확인하기 위해 야생형과 변형된 리보솜에 의해 만들어지는 CAT 단백질의 양을 확인한 결과, 예상한 바와 같이 C770G는 야생형보다 약 13.4배나 감소하였고, 이를 보완하는 이차복귀돌연변이체는 C770G보다 약 1.8배 증가됨을 관찰할 수가 있었다(Fig. 2).
- 선별된 이차복귀돌연변이체의 단백질 합성능력의 변화를 알아보기 위해서 클로람페니콜(Cm)에 대한 최소억제농도를 측정해 본 결과, 770 위치에서 야생형인 C에서 G로 치환된 돌연변이체를 발현하는 대장균들은 클로람페니콜에 대한 최소억제농도가 600 μg/ml에서 100 μg/ml로 급격히 낮아진데에 반해, 발췌된 이차돌연변이복귀체는 클로람페니콜에 대한 최소억제농도를 200 μg/ml로 증가시키는 것을 관찰할 수가 있었다(Fig. 2).
- 셋째, CAT mRNA의 RBS(ribosome binding sequence)는 야생형인 5'-GGAGG에서 5'-AUCCC로 변형되어있고, 16S rRNA 유전자의 MBS(mRNA binding sequence)는 야생형인 5'-CCUCC 에서 5'-GGGAU로 변형되어 있다.
- 이 결과로, C770 염기가 리보솜의 단백질 합성 수행능력에 매우 중요한 역할을 한다는 사실과 B2c 인터브리지의 또 다른 잔기인 U904와 C569가 저하된 리보솜(C770G-리보솜) 의 단백질 합성 기능을 어느 정도 회복시킴을 확인할 수가 있었다.
-
후)리보솜이번역하는">리보솜이 번역하는 CAT mRNA로부터의 단백질 합성능력이 향상된 클론을 선별하였다. 이 실험으로 C770G 염기치환을 가진 변이체 리보솜의 단백질 합성능력을 일부 회복시키는 하나의 이차복귀돌연변이체를 획득하였으며, DNA 염기분석을 통하여 C569G와 U904C 염기치환을 가진 것을 확인하였다. 이러한 연구결과를 이용하여
후속연구
- 후)감안할 때,">감안할때,
- 후)염기 분석을">염기분석을 통하여 C569G와 U904C 염기치환을 가진 것을 확인하였다. 이러한 연구결과를 이용하여 770 염기가 단백질 합성 과정에서 16S rRNA의 어떤 다른 부분과 결합을 하는지, 또한 그러한 결합으로 이루어지는 구조가 가지게 되는 기능은 무엇인지 등에 대한 리보솜의 구체적인 단백질 합성기작 연구에 도움이 될 것으로 기대한다.
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