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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천일염 생산의 근원이 되는 해수로부터 천일염이 형성되어 저장하기까지의 생산공정별 미생물분포 조사를 16S rRNA sequencing분석을 바탕으로 한 분자생물학적 기법을 이용하여 조사하였다. 이를 토대로 국내 최대 생산지에서 생산된 천일염의 미생물학적 위생안전성을 확인하고, 기존에 보고되지 않은 새로운 호염미생물을 분리하여 보고하고자 한다.
- 우리나라 전남지역에서 생산되는 천일염의 생산공정별 미생물 분포 조사 및 배양 분리법을 이용하여 호염미생물을 분리하여 동정하는 것을 이번 연구의 목표로 삼았다. 천일염시료는 생산지를 고려하여 육지 염전인 영광군 한 지역과 해안 염전 지역인 신안군 두 군데에서 생산공정별로 세분화하여 총 28개 분석시료를 수집하여 사용하였으며, 이들 시료를 십진 희석하여 4종류의 미생물 분리용 배지에 도말, 배양한 후 나타난 집락(colony)을 계수하였다.
- 따라서 본 연구에서는 천일염 생산의 근원이 되는 해수로부터 천일염이 형성되어 저장하기까지의 생산공정별 미생물분포 조사를 16S rRNA sequencing분석을 바탕으로 한 분자생물학적 기법을 이용하여 조사하였다. 이를 토대로 국내 최대 생산지에서 생산된 천일염의 미생물학적 위생안전성을 확인하고, 기존에 보고되지 않은 새로운 호염미생물을 분리하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 16S rRNA gene sequence 분석을 통한 분리미생물의 동정을 위해 순수 분리된 집락에서 균체를 취하여 colony PCR을 수행하였다. PCR premix와 혼합한 후, 27f와 1492r의 primer를 이용하여 16S rRNA gene을 증폭하였다.
- 28개의 분석 시료에서 각각 1g 또는 1mL를 취하여 생리식염수 용액 9mL과 혼합하여 1분간 vortex하였고, 이를 균질화한 후 10-1~10-7으로 십진 희석하였다. 희석액은 4종류의 선택배지에 각각 도말하여 35℃에서 48시간 이상 배양하였다.
- Fig. 1에서 보는 것처럼 16S rRNA 염기서열 간의 상동성비교를 위한 계통학적 분석 접근법을 통해 신규미생물의 위치를 파악해 보았다. 97% 미만의 동정율을 나타낸 Salinivibrio sp.
- 16S rRNA gene sequence 분석을 통한 분리미생물의 동정을 위해 순수 분리된 집락에서 균체를 취하여 colony PCR을 수행하였다. PCR premix와 혼합한 후, 27f와 1492r의 primer를 이용하여 16S rRNA gene을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 Solgent Co.
- 각 공정에서 분리된 호염미생물 총 62균주를 순수 분리배양하여 16S rRNA 염기서열 분석법을 통해 미생물 동정을 실시한 후 중복된 균종을 제외하고 대표적으로 37분리균주만을 정리하여 Table 2에 나타내었다. 천일염 생산공정 중 채취한 시료에서는 총 12속 미생물의 존재를 확인하였는데, 이들의 미생물속은 Halobacillus, Halomonas, Bacillus, Idiomarina, Marinobacter, Pseudoalteromonas, Vibrio, Sa-linivibrio, Virgibacillus, Alteromonas, Staphylococcus, unknown sp.
- 각 미생물 별로 조합된 16S rRNA 염기서열은 DDBJ database를 통해 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 비교함으로서 세균을 분류하고 동정하였다. 그리고 분리된 미생물의 16S rRNA 염기서열을 CLUSTAL X program으로 multiple sequence alignment한 후 phylo-genetic consensus tree를 작성하였다.
- 각 미생물 별로 조합된 16S rRNA 염기서열은 DDBJ database를 통해 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 비교함으로서 세균을 분류하고 동정하였다. 그리고 분리된 미생물의 16S rRNA 염기서열을 CLUSTAL X program으로 multiple sequence alignment한 후 phylo-genetic consensus tree를 작성하였다. 해당 분석은 neighbour-joining 알고리즘을 바탕으로 수행되었다.
- 이들 분리균들은 형태학적 특성에 따라 무작위로 62개 집락을 선정하여 분리하였다. 순수 분리된 미생물들은 PCR 기법을 통해 16S rRNA유전자의 염기서열을 분석한 후, 기존에 보고된 미생물 유전자 database와 비교함으로써 12속의 천일염 유래 호염균들의 존재를 확인하였다. 이번 연구 결과 천일염 생산 단계에서 분리된 halophilic bacteria은 Halobacillus, Halomonas, Bacillus, Idiomarina, Marinobacter, Pseudoalteromonas, Vibrio, Salinivibrio, Virgibacillus, Alteromonas, Staphylococcus및 unknown 등이다.
- 따라서 이번 연구결과를 통해 우리는 천일염의 경우는 식품의 일반세균에 대한 검출 기준이 아니라 호염미생물에 대한 별도의 기준이 마련되어야 하고, 이들 미생물의 총균수 계수를 위한 일정 농도의 염을 포함한 배양배지를 사용하여야 분석시료 중 존재하는 호염균을 분리할 수 있음을 알 수 있었다. 이번 연구에서 분리된 균주들은 약 1.2 M 염농도에서 배양되었기 때문에 Gilmour[3]의 분류에 따라 0.2 M~2.0 M 염농도에서 자라는 중호염성균 군으로 분류하였다.
- 이와 같은 결과를 통해 천일염이 결정화되면서 염농도가 높아지는 함수저장고와 소금창고에서는 호염균조차도 생육이 억제됨을 알 수 있었고, 천일염 중 좀 더 다양한 미생물 분포 조사를 위해서는 유전학적 기법을 이용한 비배양법을 통해 조사되어야 할 것이다. 이번 연구에서는 배양법을 통해 분리된균주들의 동정을 위해 각 공정별로 콜로니 모양, 크기를 고려하여 무작위로 선별하여 총 호염미생물 62균주를 순수 분리 배양하여 미생물을 동정하였다.
- 우리나라 전남지역에서 생산되는 천일염의 생산공정별 미생물 분포 조사 및 배양 분리법을 이용하여 호염미생물을 분리하여 동정하는 것을 이번 연구의 목표로 삼았다. 천일염시료는 생산지를 고려하여 육지 염전인 영광군 한 지역과 해안 염전 지역인 신안군 두 군데에서 생산공정별로 세분화하여 총 28개 분석시료를 수집하여 사용하였으며, 이들 시료를 십진 희석하여 4종류의 미생물 분리용 배지에 도말, 배양한 후 나타난 집락(colony)을 계수하였다. 그 결과 천일염생산 공정 중 대장균 등의 식품 오염지표 미생물은 검출되지 않았지만, 저장수에서 증발지 단계로 진행되면서 1.
대상 데이터
- 희석액은 4종류의 선택배지에 각각 도말하여 35℃에서 48시간 이상 배양하였다. 사용된 배지는 세균 분리를 위한 Trypticase soy agar(TSA), Plate count agar(PCA) 그리고 호염세균 분리를위한 7% NaCl을 함유하고 있는 배지 Mannitol salt agar (MSA)와 대장균 분리용 선택배지인 Eosin methylene blue (EMB)를 사용하였다. 본 연구에 사용된 미생물 배양에 이용된 배지들은 모두 DIFCO Co.
- 그러나 이후 단계인 함수저장고, 결정지에서는 미생물 수가 점차적으로 감소되었으며, 소금저장소에 보관된 천일염 시료에서는 미생물이 전혀 검출되지 않았다. 이들 분리균들은 형태학적 특성에 따라 무작위로 62개 집락을 선정하여 분리하였다. 순수 분리된 미생물들은 PCR 기법을 통해 16S rRNA유전자의 염기서열을 분석한 후, 기존에 보고된 미생물 유전자 database와 비교함으로써 12속의 천일염 유래 호염균들의 존재를 확인하였다.
- 천일염 시료는 2009년 6월에 전라남도 서해안에 위치한 신안군의 증도면(T 염전)과 도초면(S 염전) 그리고 영광군(D 염전)에서 생산공정을 저장수, 증발지, 함수저장고, 결정지, 소금저장고 등 5단계 과정으로 구분하여 총 28개 시료를 수집하여 사용하였다.
이론/모형
- 그리고 분리된 미생물의 16S rRNA 염기서열을 CLUSTAL X program으로 multiple sequence alignment한 후 phylo-genetic consensus tree를 작성하였다. 해당 분석은 neighbour-joining 알고리즘을 바탕으로 수행되었다. 미생물 분류 체계상 16S rRNA 염기서열의 상동성이 99% 이상이면 기존에 보고된 미생물을 참고하여 동일 균주로, 97.
성능/효과
- 그 결과 천일염생산 공정 중 대장균 등의 식품 오염지표 미생물은 검출되지 않았지만, 저장수에서 증발지 단계로 진행되면서 1.1×103 ~1.8×105 CFU/g의 호염성 미생물들이 검출되었다.
- 그 외 저호염균인 Alteromonas macleodii는 D염전의 저장수에서, Staphylococcus epidermidis는 T염전의 토판염 제조 공정 중 결정지에서만 검출되었다. 특히 97% 미만의 낮은 동정율을 나타낸 Salinivibrio속에 분류된 2개의 분리균은 유연관계가 낮아 추후 유전자 상동성 분석을 통해 신규성 검토를 위해 좀더 연구를 수행할 예정이다.
- 8×105 CFU/g의 호염성 미생물들이 검출되었다. 그러나 이후 단계인 함수저장고, 결정지에서는 미생물 수가 점차적으로 감소되었으며, 소금저장소에 보관된 천일염 시료에서는 미생물이 전혀 검출되지 않았다. 이들 분리균들은 형태학적 특성에 따라 무작위로 62개 집락을 선정하여 분리하였다.
- 그리고 해안지역에 위치한 T염전의 경우 다른 염전에 비해 저장수에서 3.4×104 CFU/mL의 상당히 높은 수의 미생물이 검출되었고,그 다음 증발지 단계에서는 염도 10도인 2차 증발지에서1.8×105 CFU/mL 수준으로 가장 높은 수의 검출율을 나타내었다.
- 그러나 이들 분리균들은 총균수 계수용 배지인 Plate count agar(PCA)와 Trypticase soy agar(TSA)에서는검출되지 않았거나 검출율이 낮았고, 7%(w/v) NaCl이 첨가되어 있는 Mannitol salt agar(MSA)에서만 생육하였다. 따라서 이번 연구결과를 통해 우리는 천일염의 경우는 식품의 일반세균에 대한 검출 기준이 아니라 호염미생물에 대한 별도의 기준이 마련되어야 하고, 이들 미생물의 총균수 계수를 위한 일정 농도의 염을 포함한 배양배지를 사용하여야 분석시료 중 존재하는 호염균을 분리할 수 있음을 알 수 있었다. 이번 연구에서 분리된 균주들은 약 1.
- 마지막으로 우리나라 소금생산지 중 청정지역으로 알려져 있는 S염전에서는 저장수와 증발지에서 1.6×104~1.3×104 CFU/mL 수준으로 미생물이 검출되었지만, 다른 염전과 달리 함수저장고와 결정지 단계에서 미생물이 전혀 검출되지 않았다.
- 본 연구에서 우리는 천일염 생산 공정별 미생물 분포를 조사한 결과 대장균 등 식품 오염지표 미생물들의 불검출과 다양한 호염미생물의 존재를 확인하였다. 이 결과는 비록 일본의 식용염 규격 기준[16]을 토대로 비교하였지만, 추후 우리나라 식염에 대한 미생물 검출기준이 마련되기 위한 기초자료로 활용될 수 있고, 현 시점에서는 국내산 천일염 생산지는 식품 오염지표 미생물들의 불검출이라는 연구 결과를 토대로 위생학적으로 안전하다고 판단된다.
- 육지 염전인 D염전에서는 저장수에서 1.1×103 CFU/mL의 세균이 검출되었고 증발지 단계에서 3.7×104 CFU/mL까지 증가하다 결정지에서 6.3×103 CFU/mL 수준까지 감소하였으며, 소금저장고에서는 전혀 검출되지 않았다.
- 순수 분리된 미생물들은 PCR 기법을 통해 16S rRNA유전자의 염기서열을 분석한 후, 기존에 보고된 미생물 유전자 database와 비교함으로써 12속의 천일염 유래 호염균들의 존재를 확인하였다. 이번 연구 결과 천일염 생산 단계에서 분리된 halophilic bacteria은 Halobacillus, Halomonas, Bacillus, Idiomarina, Marinobacter, Pseudoalteromonas, Vibrio, Salinivibrio, Virgibacillus, Alteromonas, Staphylococcus및 unknown 등이다.
후속연구
- 97% 미만의 동정율을 나타낸 Salinivibrio sp. D3-3M와 D3-5M는 비록 같은 속에 그룹 되어 있지만 특히 D3-5M의 경우 다른 속으로 명명될 가능성이 매우 높아 이 균 역시 좀 더 심층연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 이 결과는 비록 일본의 식용염 규격 기준[16]을 토대로 비교하였지만, 추후 우리나라 식염에 대한 미생물 검출기준이 마련되기 위한 기초자료로 활용될 수 있고, 현 시점에서는 국내산 천일염 생산지는 식품 오염지표 미생물들의 불검출이라는 연구 결과를 토대로 위생학적으로 안전하다고 판단된다. 또한 천일염 생산지는 다양한 새로운 호염미생물의 저장고로 앞으로 더욱 주목 받을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서 우리는 천일염 생산 공정별 미생물 분포를 조사한 결과 대장균 등 식품 오염지표 미생물들의 불검출과 다양한 호염미생물의 존재를 확인하였다. 이 결과는 비록 일본의 식용염 규격 기준[16]을 토대로 비교하였지만, 추후 우리나라 식염에 대한 미생물 검출기준이 마련되기 위한 기초자료로 활용될 수 있고, 현 시점에서는 국내산 천일염 생산지는 식품 오염지표 미생물들의 불검출이라는 연구 결과를 토대로 위생학적으로 안전하다고 판단된다. 또한 천일염 생산지는 다양한 새로운 호염미생물의 저장고로 앞으로 더욱 주목 받을 것으로 기대된다.
- 3×104 CFU/mL 수준으로 미생물이 검출되었지만, 다른 염전과 달리 함수저장고와 결정지 단계에서 미생물이 전혀 검출되지 않았다. 이와 같은 결과를 통해 천일염이 결정화되면서 염농도가 높아지는 함수저장고와 소금창고에서는 호염균조차도 생육이 억제됨을 알 수 있었고, 천일염 중 좀 더 다양한 미생물 분포 조사를 위해서는 유전학적 기법을 이용한 비배양법을 통해 조사되어야 할 것이다. 이번 연구에서는 배양법을 통해 분리된균주들의 동정을 위해 각 공정별로 콜로니 모양, 크기를 고려하여 무작위로 선별하여 총 호염미생물 62균주를 순수 분리 배양하여 미생물을 동정하였다.
- 그 외 저호염균인 Alteromonas macleodii는 D염전의 저장수에서, Staphylococcus epidermidis는 T염전의 토판염 제조 공정 중 결정지에서만 검출되었다. 특히 97% 미만의 낮은 동정율을 나타낸 Salinivibrio속에 분류된 2개의 분리균은 유연관계가 낮아 추후 유전자 상동성 분석을 통해 신규성 검토를 위해 좀더 연구를 수행할 예정이다.
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