선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 16S rRNA를 바탕으로 한 분자생물학적 분석법을 이용하여 다양한 젓갈에 존재하는 원핵세균 군집을 분석하고자 하였으며, 또한 우리나라 전통 발효식품인 젓갈로부터 기존에 보고되지 않은 새로운 미생물을 분리, 보고하고자 한다.
- 우리나라 전통발효식품인 젓갈의 원핵 세균 군집 분포 분석및 신규 미생물 분리를 목적으로 지역과 주재료를 고려하여 총 17종류의 젓갈을 선정하여 분석하였다. 우리나라에는 약 164여 종의 젓갈이 존재하는 것으로 보고되어 있으며(5, 19), 고염의 환경으로 인하여 호염성 미생물 비율이 높고 이들이 젓갈의 숙성에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(13).
제안 방법
- 분석한 염기서열의 절편을 SeqMan software (DNASTAR)로 조합하여 16S rRNA의 염기서열을 얻었다. 각 미생물 별로 조합된 16S rRNA 염기서열을 Korea bioinformation center의 EzTaxon (9)과 GenBank database (NCBI database) 통해 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 비교함으로서 젓갈 내 군집을 이루는 원핵 세균의 분류군과 대표적인 종, 이를 바탕으로 한 군집의 분포도를 확인하였다. 그리고 분리된 미생물의 16S rRNA 염기서열을 CLUSTAL X program (21)으로 Multiple Sequence Alignment한 후, MEGA 4.
- 균주의 genomic DNA는 G-spin™ Genomic DNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 추출하였다.
- 0% 이상으로 나타나는 균주를 reference 균주로 선정하였다. 그리고 서로 간의 Genomic DNA relatedness를 분석하여 신규 미생물 여부를 확인하였다(10, 11). 균주의 genomic DNA는 G-spin™ Genomic DNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 추출하였다.
- 순수 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻기 위해 colony PCR을 수행하였다. 단일 colony로부터 1 toothpick 채취하여 PCR-premix (iNtRON Biotechnology, Korea)와 혼합한 후, archaea (21f, 1492r)과 bacteria (8f, 1492r)에 특이적인 primer를 이용하여 16S rRNA gene을 증폭하였다(6). 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit (QIAquick®PCR Purification kit, Germany)을 사용하여 정제한 후, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, USA)와 automated DNA analyzer system (PRISM 3730XL DNA analyzer, Applied Biosystems)을 통하여 염기서열을 분석하였다.
- 본 연구에서는 12종류의 미생물 선택배지를 사용하여 젓갈로부터 bacteria와 archaea를 분리하였다. 그러나 기존에 사용된 배양에 의존적인 분리방법으로는 존재하는 미생물의 99% 이상을 배양하지 못한다는 것이 밝혀진 이후 다양한 분자생물학적 방법, 예를 들어 PCR (polymerase chain reaction), DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), Pyrosequencing 등이 대두되었으며, 이로서 기존의 배양법으로 접근하지 못한 난배양성 미생물에 대한 분석 또한 가능할 것이다.
- 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit (QIAquick®PCR Purification kit, Germany)을 사용하여 정제한 후, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, USA)와 automated DNA analyzer system (PRISM 3730XL DNA analyzer, Applied Biosystems)을 통하여 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열의 절편을 SeqMan software (DNASTAR)로 조합하여 16S rRNA의 염기서열을 얻었다. 각 미생물 별로 조합된 16S rRNA 염기서열을 Korea bioinformation center의 EzTaxon (9)과 GenBank database (NCBI database) 통해 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 비교함으로서 젓갈 내 군집을 이루는 원핵 세균의 분류군과 대표적인 종, 이를 바탕으로 한 군집의 분포도를 확인하였다.
- 희석액은 12종류의 선택배지에 각각 도말하여 30o C에서 48시간 이상 배양하며 관찰하였다. 사용된 배지는 세균 분리를 위한 Marine agar, Nutrient agar, MRS agar, Lysogeny agar, Tryptic soy agar, R2A agar 그리고 고세균 분리를 위한 배지(DSMZ954)이며, 2% NaCl을 함유하고 있는 Marine agar에 NaCl을 첨가하여 각각 5, 6, 10, 15, 20%의 NaCl이 첨가된 배지를 제조하여 사용하였다. 배양 후 형성된 집락(colony)은 크기, 모양과 색 등의 형태학적 특성에 따라 분류, 무작위로 308개를 선택하였으며, 3회의 계대배양을 통해 미생물을 순수분리 할 수 있었다.
- 순수 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻기 위해 colony PCR을 수행하였다. 단일 colony로부터 1 toothpick 채취하여 PCR-premix (iNtRON Biotechnology, Korea)와 혼합한 후, archaea (21f, 1492r)과 bacteria (8f, 1492r)에 특이적인 primer를 이용하여 16S rRNA gene을 증폭하였다(6).
- 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit (QIAquick®PCR Purification kit, Germany)을 사용하여 정제한 후, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, USA)와 automated DNA analyzer system (PRISM 3730XL DNA analyzer, Applied Biosystems)을 통하여 염기서열을 분석하였다.
- 선정된 젓갈은 개봉 직후 PBS (phosphate buffered saline) 용액과 동량 혼합하고 1분간 vortex하여 균질화한 후 10-1~10-10으로 십진 희석하였다. 희석액은 12종류의 선택배지에 각각 도말하여 30o C에서 48시간 이상 배양하며 관찰하였다. 사용된 배지는 세균 분리를 위한 Marine agar, Nutrient agar, MRS agar, Lysogeny agar, Tryptic soy agar, R2A agar 그리고 고세균 분리를 위한 배지(DSMZ954)이며, 2% NaCl을 함유하고 있는 Marine agar에 NaCl을 첨가하여 각각 5, 6, 10, 15, 20%의 NaCl이 첨가된 배지를 제조하여 사용하였다.
대상 데이터
- 어류의 몸통이나 살을 주재료로 하는 가자미식해, 멸치젓, 황새기젓, 전어젓, 내장을 주로 사용하는 대구 아가미젓, 갈치속젓, 전어밤젓으로 정하였다. 갑각류로는 몸통 전체를 재료로 하는 간장게장, 토하젓을 선택하였으며, 부족류 및 복족류로는 가리비젓, 조개젓, 어리굴젓, 키조개젓을 선정하였다. 그 외 의충류인 개불젓, 두족류인 꼴뚜기젓, 미더덕젓, 성게류이면서 생식소를 주재료로 사용하는 성게알젓을 선택하였다.
- 그 외 의충류인 개불젓, 두족류인 꼴뚜기젓, 미더덕젓, 성게류이면서 생식소를 주재료로 사용하는 성게알젓을 선택하였다. 실험에 사용한 젓갈은 대부분 시중에서 구입하였으며, 전어젓과 전어밤젓은 전남 고흥의 일반 가정에서 재래식 방법으로 제조한 것을 제공받아 사용하였다. 선정된 젓갈은 개봉 직후 PBS (phosphate buffered saline) 용액과 동량 혼합하고 1분간 vortex하여 균질화한 후 10-1~10-10으로 십진 희석하였다.
- 젓갈은 지역과 주재료를 고려하여 17 종을 선정하였다. 어류의 몸통이나 살을 주재료로 하는 가자미식해, 멸치젓, 황새기젓, 전어젓, 내장을 주로 사용하는 대구 아가미젓, 갈치속젓, 전어밤젓으로 정하였다.
데이터처리
- 각 미생물 별로 조합된 16S rRNA 염기서열을 Korea bioinformation center의 EzTaxon (9)과 GenBank database (NCBI database) 통해 기존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 비교함으로서 젓갈 내 군집을 이루는 원핵 세균의 분류군과 대표적인 종, 이를 바탕으로 한 군집의 분포도를 확인하였다. 그리고 분리된 미생물의 16S rRNA 염기서열을 CLUSTAL X program (21)으로 Multiple Sequence Alignment한 후, MEGA 4.0 (20)을 사용하여 Phylogenetic consensus tree를 작성하였다. 해당 분석은 neighbour-joining (16) 알고리즘을 바탕으로 하였다.
이론/모형
- 0 (20)을 사용하여 Phylogenetic consensus tree를 작성하였다. 해당 분석은 neighbour-joining (16) 알고리즘을 바탕으로 하였다.
성능/효과
- 17 종의 젓갈을 12가지 선택 배지에 배양하여 총 308개의 단일 colony를 분리하였으며, 이들 중 305균주는 bacteria로, 3균주는 archaea로 확인되었다. 각각의 젓갈에서 분리한 미생물 수와 이들에 대한 동정 결과를 Table 1에 나타내었다.
- 기존의 연구는 앞서 말한 것과 같이 정어리젓, 멸치젓, 창란젓과 같이 특정 젓갈에 한해서만 연구되었다. 17가지 젓갈을 이용한 본 연구에서는 lactic acid bacteria (Leuconostoc 속, Weisella 속, Lactococcus 속, Lactobacillus 속, Carnobacterium 속, Marinilactibacillus 속, Tetragenococcus 속)와 Bacillus 속, Pseudomonas 속, Micrococcus 속, Brevibacterium 속, Microbacterium 속, Kocuria 속이 17 종의 젓갈 전반적으로 가장 많이 분리가 되었고, 이는 주재료나 지역에 따른 젓갈 내 원핵 세균의 군집의 차이보다 발효 및 숙성 기능을 지니는 젓갈 본연의 원핵 세균 특징이 더 뚜렷함을 알 수 있었다. 물론 각 젓갈별 종이나 속의 차이는 있을지라도 해당 군집 내에서 동일한 역할로 작용하기에 때문에 차이점으로 보기 힘들다.
- 그 외 전어밤젓에서 31균주 중 Vibrio 속이 18균주로 다수 분리되었으며, 젓갈의 발효 숙성에 관여하는 것으로 알려진 Micrococcus 속에서 재분류된 Kocuria 속인 11균주가 분리되었다(12, 18). Archaea로 확인된 3균주는 모두 조개젓에서 분리되었으며, Natrialba 속이 2균주, Haladaptatus 속이 1균주인 것으로 확인되었다.
- 가자미식해, 가리비젓, 개불젓, 키조개젓, 전어밤젓, 간장게장 순서로 각각 25~48균주를 분리하였으며, 이어서 갈치속젓, 토하젓 그리고 황새기 젓갈에서 10~14균주들이, 아가미젓, 어리굴젓, 성게알젓, 멸치젓, 조개젓, 미더덕젓, 전어젓, 꼴뚜기젓에서 각각 10균주가 분리되었다. 특히 키조개젓에서 분리된 34균주에는 23종의 다양한 미생물이 분리되었다.
- 0% 미만의 상동성을 나타낸 14균주에 대하여 DNA-DNA hybridization을 실시하였다. 그 결과 14균주 모두 reference 균주와 70% 미만의 Genomic DNA relatedness를 나타내어 기존에 보고되지 않은 새로운 균주인 것으로 판단된다.
- 본 연구에서는 12종류의 미생물 선택배지를 사용하여 젓갈로부터 bacteria와 archaea를 분리하였다. 그러나 기존에 사용된 배양에 의존적인 분리방법으로는 존재하는 미생물의 99% 이상을 배양하지 못한다는 것이 밝혀진 이후 다양한 분자생물학적 방법, 예를 들어 PCR (polymerase chain reaction), DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), Pyrosequencing 등이 대두되었으며, 이로서 기존의 배양법으로 접근하지 못한 난배양성 미생물에 대한 분석 또한 가능할 것이다.
- 0% 미만이면 Genomic DNA relatedness가 70% 미만이라는 것이 통계학적인 분석에 의해 증명되었다(17). 따라서 database에 등록된 균주들과의 16S rRNA 상동성 비교 결과, 젓갈 분리 균주와 16S rRNA 염기서열 상동성이 97.0% 이상으로 나타나는 균주를 reference 균주로 선정하였다. 그리고 서로 간의 Genomic DNA relatedness를 분석하여 신규 미생물 여부를 확인하였다(10, 11).
- 사용된 배지는 세균 분리를 위한 Marine agar, Nutrient agar, MRS agar, Lysogeny agar, Tryptic soy agar, R2A agar 그리고 고세균 분리를 위한 배지(DSMZ954)이며, 2% NaCl을 함유하고 있는 Marine agar에 NaCl을 첨가하여 각각 5, 6, 10, 15, 20%의 NaCl이 첨가된 배지를 제조하여 사용하였다. 배양 후 형성된 집락(colony)은 크기, 모양과 색 등의 형태학적 특성에 따라 분류, 무작위로 308개를 선택하였으며, 3회의 계대배양을 통해 미생물을 순수분리 할 수 있었다.
- 특히 키조개젓에서 분리된 34균주에는 23종의 다양한 미생물이 분리되었다. 분리된 모든 전체 원핵 세균을 속에 따라 분류한 결과 Bacillus 속이 70균주, Tetragenococcus 속이 34균주, Lactobacillus 속이 31균주, Leuconostoc 속이 19균주, Weissella 속이 5균주 그리고 Pseudomonas 속, Enterobacter 속, Microbacterium 속과 Salinicoccus 속이 각각 5균주 내외로 분리되었다. 특히 발효식품에서 많이 발견되는 lactic acid bacteria (Lactobacillus 속, Leuconostoc 속, Lactococcus 속, Weissella 속, Tetragenococcus 속, Carnobacterium 속, Marinilactibacillus 속)가 전체 분리 미생물의 27.
- 분리된 미생물의 16S rRNA의 염기서열을 비교·분석한 결과, 294균주는 기존의 보고된 미생물과 99.0% 이상의 상동성을 나타내었으며, 99.0% 미만의 상동성을 나타낸 14균주에 대하여 DNA-DNA hybridization을 실시하였다.
- 1에 나타내었다. 신규 미생물로 확인된 균주는 총 14균주이며, 가자미식해에서 Alishewanella 속 1균주, 토하젓에서 Marinilactibacillus 속 1균주와 Carnobacterium 속 1균주, 조개젓에서 Cobetia 속 1균주와 Haladaptatus 속 1균주(archaea), 황새기젓과 전어밤젓에서 각각 Halomonas 속 1균주씩 총 2균주, 키조개젓에서 Kocuria 속 2균주와 Agromyces 속 2균주, 가리비젓에서 Lentibacillus 속 1균주, 전어밤젓에서 Proteus 속 1균주, 간장게장에서 Salinicoccus 속 1균주, 마지막으로 갈치속젓에서 Streptomyces 속 1균주가 각각 분리되었다.
- 물론 각 젓갈별 종이나 속의 차이는 있을지라도 해당 군집 내에서 동일한 역할로 작용하기에 때문에 차이점으로 보기 힘들다. 젓갈의 원료에서 유래 되는 해양세균과 호염 및 내염성 세균인 Paracoccus 속, Psychrobacter 속, Salinicoccus 속, Halomonas 속, Cobetia 속, Lentibacillus 속이 갈치젓, 황새기젓, 간장 게장, 개불젓, 멸치젓, 조개젓에서 분리되었고, 이는 기존 연구와 유사하다(2, 7, 8, 12, 14). Archaea의 경우, 아직까지 국내에서 archaea 영역에 대한 연구가 미비할 뿐만 아니라 분리 및 배양이 어려운 실정이다.
- 분리된 모든 전체 원핵 세균을 속에 따라 분류한 결과 Bacillus 속이 70균주, Tetragenococcus 속이 34균주, Lactobacillus 속이 31균주, Leuconostoc 속이 19균주, Weissella 속이 5균주 그리고 Pseudomonas 속, Enterobacter 속, Microbacterium 속과 Salinicoccus 속이 각각 5균주 내외로 분리되었다. 특히 발효식품에서 많이 발견되는 lactic acid bacteria (Lactobacillus 속, Leuconostoc 속, Lactococcus 속, Weissella 속, Tetragenococcus 속, Carnobacterium 속, Marinilactibacillus 속)가 전체 분리 미생물의 27.6%를 차지하는 것으로 나타났다. 그 외 전어밤젓에서 31균주 중 Vibrio 속이 18균주로 다수 분리되었으며, 젓갈의 발효 숙성에 관여하는 것으로 알려진 Micrococcus 속에서 재분류된 Kocuria 속인 11균주가 분리되었다(12, 18).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.