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문제 정의
- 본 연구에서는 개개인에 대해 약효의 차이가 크게 나타나는 한방처방의 문제점을 보완하기 위해 갈근탕과 쌍화탕의 한방처방을 Lactobacillus 균주로 발효하였으며, 발효 갈근탕과 쌍화탕의 흡수율 개선으로 인한 약효가 강화되었는지 입증하기 위하여 혈소판 응집 억제 효과를 in vitro와 in vivo에서 측정하였다. 인체 혈액을 이용한 in vitro 실험에서 collagen(4 µg/ml)에 의한 혈소판 응집의 갈근탕과 쌍화탕의 저해효과는 Sigmoid Emax model에 잘 적용되었다.
- 두 처방 모두 감기 증상의 완화 및 치료에 사용되는 한방처방으로서 체온의 변화, 염증의 감소, 혈행 개선 효과 등이 있다. 본 연구에서는 혈소판 응집 억제 효과 측정을 통해 혈행 개선 효과 강화를 입증하고자 하였다.
- 따라서 인체 내에 존재하는 장내 세균총의 차이로 인해 흡수되는 양에 차이가 생겨 결국 개개인의 효능차이가 야기된다. 이러한 문제점을 보완하는 방법으로 본 연구에서는 한약재를 유산균이나 효모균과 같은 미생물로 발효시켜 유효성분을 추출함과 동시에 한방처방의 흡수율 문제를 개선시키고자 하였다.1,2)
제안 방법
- Collagen(4 µg/ml)에 의해 유도되는 혈소판 응집에 대한 한방 처방의 억제 효과는 platelet aggregometer(Chrono-Log Corp., 570VS, USA)를 이용하여 측정하였다.
- PRP는 혈구분석기를 이용하여 혈소판수를 측정하였으며 PPP를 이용하여 혈소판 수가 3.5×108/ml가 되도록 희석하여 사용하였다.
- SD-rat에 각 한방처방을 8일간 총 15번의 경구 반복 투여를 한 후 collagen(10 µg/ml)에 의해 유도된 혈소판 응집에 대한 총 6가지 한방처방의 저해효과를 측정하여 각각에 대한 inhibition %를 산출하였다.
- 각각의 혈액은 혈구분석기(Coulter Beckham®, Coulter Electronics, USA)로 일반 혈액검사를 실시하여 백혈구 수, 적혈구 수, 혈색소수치, 적혈구 용적(HCT; Hematocrit) 등의 측정 항목이 정상범위에 해당하는 혈액만을 실험에 사용하였다.
- 9% saline(1 : 3, v/v) 혼합용매에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 동일 혼합용매로 계열 희석하여 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10 mg/ml 농도의 용액을 제조하였다.
- 반복 투여 후 rat 혈액의 준비 − 단기간에 효과가 나타나지 않는 한방처방의 특징을 고려하여 각 한방처방을 1 g/kg의 용량으로 처음 7일간은 12시간 간격으로 하루 두 번, 마지막 8일째는 아침에 한 번 투여하여 총 15번 반복 투여하였다.
- MRS 배지의 조성을 Table II에 표시하였다. 발효는 1M NaOH로 각 한방처방의 pH를 조정한 후(갈근탕: 7.0, 쌍화탕:8.0), 121oC, 1.5 기압에서 15분간 가압멸균하고, 상온까지 냉각시킨 후, 유산균을 1%(v/v)로 접종하고 37oC의 항온배양기에서 48시간 동안 통기 배양하여 갈근탕과 쌍화탕을 발효하였다.4) 원방 갈근탕(GGT-con)을 Lactobacillus plantarum 144로 발효한것은 GGT-A, Lactobacillus plantaum 402로 발효한 것은 GGT-B라 명칭 하였으며 원방 쌍화탕(SHT-con)을 Lactobacillus fermentum 164로 발효한 것은 SHT-A, Lactobacillus gasseri 658로 발효한 것은 SHT-B라 명칭 하였다.
- 본 연구에 사용된 갈근탕과 쌍화탕은 각 생약재의 무게를 측정한 후 건조중량의 10배수 생수(화이트, 무학 산청 샘물)를 가하여 180분간 열수 추출하여 전탕 추출법(초고속 진공 저온 농축 추출기, Cosmos-660, 경서기계산업)을 이용하여 제조하였다. 각 구성 한약재의 원산지 및, 전탕 시 사용된 각 약재의 무게는 Table I에 기술하였으며 본 연구에 사용된 갈근탕과 쌍화탕은 한의학연구원에서 받아 사용하였다.
- Fitted된 그래프로부터 산출된 Emax, EC50의 약물동력학 매개변수는 Table IV와 같다. 실험 비교를 위하여 양성대조군인 ASA의 약물동력학 매개변수도 함께 정리하였다. GGT-A는 GGTcon에 비하여 EC50의 값이 79.
- 양성 대조군은 ASA(acetyl salicylic acid, Sigma, USA)를 선정하여 한방처방과 동일 혼합용매에 1 mg/ml의 농도로 용해시킨후 계열 희석하여 10, 50, 100, 500, 1000 µg/ml 농도의 용액을 제조하였다.
- 한방처방 용액 및 양성 대조군 용액의 조제 − 갈근탕(GGT-con, GGT-A, GGT-B)과 쌍화탕(SHT-con, SHT-A, SHT-B) 6가지 한방처방의 동결건조분말을 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Samchon cheminal Co., Korea) : 0.9% saline(1 : 3, v/v) 혼합용매에 10 mg/ml의 농도로 용해시켰다.
- 혈소판 응집 억제 효과 측정을 통해 갈근탕과 쌍화탕 두 한방 처방의 발효 전후 효과를 비교하였다. 양성 대조군으로는 혈소판 응집 억제가 규명된 ASA(Acetyl salicylic acid)를 선정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 갈근탕과 쌍화탕은 각 생약재의 무게를 측정한 후 건조중량의 10배수 생수(화이트, 무학 산청 샘물)를 가하여 180분간 열수 추출하여 전탕 추출법(초고속 진공 저온 농축 추출기, Cosmos-660, 경서기계산업)을 이용하여 제조하였다. 각 구성 한약재의 원산지 및, 전탕 시 사용된 각 약재의 무게는 Table I에 기술하였으며 본 연구에 사용된 갈근탕과 쌍화탕은 한의학연구원에서 받아 사용하였다.
- 4) 원방 갈근탕(GGT-con)을 Lactobacillus plantarum 144로 발효한것은 GGT-A, Lactobacillus plantaum 402로 발효한 것은 GGT-B라 명칭 하였으며 원방 쌍화탕(SHT-con)을 Lactobacillus fermentum 164로 발효한 것은 SHT-A, Lactobacillus gasseri 658로 발효한 것은 SHT-B라 명칭 하였다. 배양된 시험물질을 동결건조하여 시험에 사용하였으며, 추출수율은 23.10% 이었다.
- 실험 동물 − 본 실험에 사용된 동물은 웅성 Sprague-Dawley rat(290~320 g)으로 (주) 효창 사이언스사로부터 공급받았으며, 실험 당일까지 고형 사료와 물은 충분히 공급하고, 사육 실내 온도는 22±2oC, 상대 습도 55±5%, 조명은 12시간 명/암 주기가 되도록 조절하여 일주일간 순화 시킨 후 실험에 사용하였다.
- 혈소판 응집 억제 효과 측정을 통해 갈근탕과 쌍화탕 두 한방 처방의 발효 전후 효과를 비교하였다. 양성 대조군으로는 혈소판 응집 억제가 규명된 ASA(Acetyl salicylic acid)를 선정하였다.
- 한방처방의 흡수를 개선하기 위해 갈근탕과 쌍화탕의 발효에 사용된 균주는 모두 한국식품연구원(Korea Food Research Institute; KFRI, Seongnam, Korea) 식품미생물 유전자 은행에서 분양 받았으며, MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에서 계대 배양한 뒤 초기균수를 1×106CFU/ml로 조절하여 사용하였다.
- 혈액의 준비 − 채혈 지원자는 2주 전부터 혈소판 관련 약물을 복용하지 않은 건강한 남성으로서 채혈한 혈액은 3.8% sodium citrate가 담긴 vacutaine tube에 담았다.
데이터처리
- 한방처방의 응집도(%)는 mean±S.D로 나타내었고 통계적인 유의성은 student t-test를 통해 검정하였다.
이론/모형
- 각 한방처방의 농도에 따른 inhibition %는 computer program WinNonlin을 이용하여 Sigmoid Emax model에 적용하여 fitting하였다. Fitted된 그래프로부터 산출된 Emax, EC50의 약물동력학 매개변수는 Table IV와 같다.
- 혈소판 응집 저해 효과 분석 − 각 한방처방에 대한 혈소판 응집 억제율(%)은 WinNonlin program을 이용하여 Sigmoid Emax model에 적용하여 fitting 하였다.
성능/효과
- 5 기압에서 15분간 가압멸균하고, 상온까지 냉각시킨 후, 유산균을 1%(v/v)로 접종하고 37oC의 항온배양기에서 48시간 동안 통기 배양하여 갈근탕과 쌍화탕을 발효하였다.4) 원방 갈근탕(GGT-con)을 Lactobacillus plantarum 144로 발효한것은 GGT-A, Lactobacillus plantaum 402로 발효한 것은 GGT-B라 명칭 하였으며 원방 쌍화탕(SHT-con)을 Lactobacillus fermentum 164로 발효한 것은 SHT-A, Lactobacillus gasseri 658로 발효한 것은 SHT-B라 명칭 하였다. 배양된 시험물질을 동결건조하여 시험에 사용하였으며, 추출수율은 23.
- 발효 갈근탕(GGT-A)과, 발효 쌍화탕(SHT-A, SHT-B)의 EC50값은 원방 한방처방의 EC50값보다 더 낮게 산출되었는데 즉, 발효 후 갈근탕과 쌍화탕의 혈소판 응집 억제 효과가 증가한 것을 알 수 있다. In vivo 실험에서 SD-rat에 발효 전후 갈근탕과 쌍화탕을 1 g/kg의 용량으로 15번 반복투여 한 후 측정한 혈소판 응집 억제 작용은 갈근탕과 쌍화탕 모두 원방 한방처방에 비하여 더 높게 측정되었다. Student t-test 결과 갈근탕의 경우 통계적으로 유의한 차이가 보이지 않았지만, 쌍화탕의 경우 통계적으로 유의한 차이가 있어 발효 후 혈소판 응집 억제 효과가 증가하였다.
- In vivo 실험에서 SD-rat에 발효 전후 갈근탕과 쌍화탕을 1 g/kg의 용량으로 15번 반복투여 한 후 측정한 혈소판 응집 억제 작용은 갈근탕과 쌍화탕 모두 원방 한방처방에 비하여 더 높게 측정되었다. Student t-test 결과 갈근탕의 경우 통계적으로 유의한 차이가 보이지 않았지만, 쌍화탕의 경우 통계적으로 유의한 차이가 있어 발효 후 혈소판 응집 억제 효과가 증가하였다.
- 갈근탕의 경우 원방 갈근탕보다 혈소판 응집 억제 효과가 GGTA, GGT-B 모두 통계적으로 유의한 차이성을 보이진 않았지만, 쌍화탕은 발효 쌍화탕인 SHT-A, SHT-B 모두 원방 쌍화탕보다 통계적으로 혈소판 응집 억제 효과가 증가하였다(p-value<0.05).
- 대조군으로 한방처방을 먹이지 않은 SD-rat의 혈액에 collagen을 처리하여 측정한 최대 응집율은 61.00±6.89%로 측정되었다.
- 인체 혈액을 이용한 in vitro 실험에서 collagen(4 µg/ml)에 의한 혈소판 응집의 갈근탕과 쌍화탕의 저해효과는 Sigmoid Emax model에 잘 적용되었다. 발효 갈근탕(GGT-A)과, 발효 쌍화탕(SHT-A, SHT-B)의 EC50값은 원방 한방처방의 EC50값보다 더 낮게 산출되었는데 즉, 발효 후 갈근탕과 쌍화탕의 혈소판 응집 억제 효과가 증가한 것을 알 수 있다. In vivo 실험에서 SD-rat에 발효 전후 갈근탕과 쌍화탕을 1 g/kg의 용량으로 15번 반복투여 한 후 측정한 혈소판 응집 억제 작용은 갈근탕과 쌍화탕 모두 원방 한방처방에 비하여 더 높게 측정되었다.
후속연구
- 6,13-17) 혈소판 응집 억제 효과가 있는 갈근탕과 쌍화탕이 발효에 의하여 효과가 증가된 것은, 발효과정을 통해 성분들의 흡수가 증대되었기 때문이라 예상되며 특히 배당체인 glycyrrhizin, paeoniflorin과 같은 경우는 발효과정에서 당이 떨어져 나가 aglycone 상태가 되면서 흡수율이 더 증대된 것이라 예상된다.18-22) 이미 한국에서는 발효 한방처방에 대한 연구가 진행되고 있으며 앞으로 실험을 통한 과학적인 입증과 기전 연구를 계속 진행해 나간다면 개개인에 따라 효과 차이가 나는 문제점 해결을 물론이고 발효 한방처방만의 이점도 규명해 낼 수 있을 것이다.23-25)
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