문제 정의

• ⁶⁾ Trichostatin A(TSA)는 1세대 Histone deacetylase(HDAC) 억제제이며, 반응성과 독성이 비교적 높다고 알려져 있다.⁷⁾ 이에 본 연구에서는 두 약제의 종양 증식 억제 효과, 관련 기전 및 심장 독성 정도를 비교하고자 하였다.
• 본 연구에서는 대장암 세포주에 KML001과 TSA 처리에 따른 항암 효과 및 심장 독성 효과를 비교하였다. 두 약물의 처리에 따라 대장암 세포의 과증식이

  제안 방법

  • HCT116 세포(5×105 cells/ml)에 1 µM 농도의 KML001을 처리한 다음 24시간 주기로 세포를 수확하여 PBS로 수세 하였다.
  • 후)실험조건에">실험 조건에 따라 배양되었으며, 약물 처리 후 정해진 시간에 트립신-EDTA를 사용하여 수거하였다. 0.4% 트립판 블루 용액으로 염색한 다음, 염색 유무에 따라 헤모시토미터를 사용하여 생존 세포와 사멸 세포의 수를 각각 측정하였다. 세포의 성장 곡선은 염색되지 않은 생존한 세포의 수로 나타내었으며, 세포 생존율은 전체 세포에 대해 생존한 세포의 상대적 비율로 나타내었다.
  • RIPA 완충액(135 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 2.7 mM KCl, 20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.5 mM Na₃VO₄, 10 mM NaF, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 0.2 mM PMSF, 10 mg/ml each of aprotinin, leupeptin, pepstatin)을 사용하여 실험 조건에서 배양한 HCT116 세포에서 단백질을 추출하였다. Bradford 단백질 정량 시약(Bio-Rad Laboratories, USA)과 분광광도계(Mecasys, Korea)를 사용하여 함유된 단백질 농도를 측정하였다.
  • 2 mM PMSF, 10 mg/ml each of aprotinin, leupeptin, pepstatin)을 사용하여 실험 조건에서 배양한 HCT116 세포에서 단백질을 추출하였다. Bradford 단백질 정량 시약(Bio-Rad Laboratories, USA)과 분광광도계(Mecasys, Korea)를 사용하여 함유된 단백질 농도를 측정하였다. 후)고정시켜">고정 시켜 PBS로 세척한 다음, RNase A(1 mg/ml)를 처리하고 propidium iodide(BD Pharmingen, USA)로 염색했다. 세포주기는 FACS Calibur와 CellQuest acquisition software(BD Biosciences, USA)로 측정 및 분석하였다. propidium iodide는 585/42 nm 필터로 측정되었으며, 최소 20,000개 이상의 세포의 자료를 수집하여 세포주기를 측정하였다.
  • ">측정 하였다. 생리학적 지표로 박동 빈도와 배아유사세포덩어리 (embryoid body)의 박동 백분율을 측정하였으며, 방법은 다음과 같다. 핀을 사용하여 세포배양접시 바닥에 1 mm HCT116 대장암 세포주에 1 µM KML001을 처리한 다음 유세포 분석기를 사용하여 매 24시간 마다 세포 주기를 측정하였다.
  • 초대 배양한 신생 백서의 심장세포에 다양한 농도의 KML001을 처리한 다음, 세포의 형태학적 및 기능적 변화를 관찰하였다. 대조군과 비교하여 KML001을 처리한 그룹에서 농도에 관계없이 세포의 위축이 나타났다(Fig.

  대상 데이터

  • HCT116 대장암 세포주는 인제대학교 의과대학 약리학교실로부터 제공받아 배양하였다(PI: Oh ST). KML001는 세포주기는 FACS Calibur와 CellQuest acquisition software(BD Biosciences, USA)로 측정 및 분석하였다. propidium iodide는 585/42 nm 필터로 측정되었으며, 최소 20,000개 이상의 세포의 자료를 수집하여 세포주기를 측정하였다.
  • 후)배양하였다 (PI:">배양하였다(PI: Oh ST). KML001는 제조사 (KOMIPHARM, 한국)로부터 제공 받았으며, TSA(SigmaAldrich, 미국)는 구입하여 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해시켜 사용하였다.

  데이터처리

  • 사후 검정은 Turkey 검정법을 사용하였으며, 통계적 유의성은 P<.05로 나타내었다.
  • 모든 실험은 세 차례 이상 수행되었으며, 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다.
  • 후)통계처리는">통계 처리는 SPSS 18.0을 사용했으며, 독립 표본 t검정, 일원분산분석 및 반복측정 분산분석을 실시하였다.

    성능/효과

    • 후)등 과">등과 밀접한 관련이 있다.²⁾ 한국중앙암등록본부(2005)에 등록된 암환자를 대상으로 조사한 연구 결과, 대장암에 의한 우리나라의 사회-경제적 비용 부담이 연간 1조 4,000억원에 이르는 것으로 추산되었다.³⁾ 따라서 후)오래전부터">오래 전부터 동양에서 암을 비롯한 여러 질환을 치료하기 위해 사용되었으나, 독성 때문에 현재에는 주로 외용제로 사용되고 있다.⁴⁾ 최근 항암제로서 육산화비소(As₄O₆)의 개발 가능성이 시사되어 의약품으로 개발 단계에 있으나 경구 투여 후의 흡수율이 낮다.⁵⁾ 반면에 KML001(메타아 KML001이 자가포식기전의 활성화에 미치는 영향대조군과 비교하여 1 µM과 0.01 µM 농도의 KML001을 처리한 대장암 세포주에서 Beclin 1의 발현은 유의하게 감소하였다(P<.05).
    • 대조군과 비교하였을 때 시간에 따른 증식 곡선의 기울기는 KML001(1 µM) 및 TSA(1 µM) 처리에 의해 유의하게 감소하였다(Fig. 1C).
    • HCT116 대장암 세포주에 KML001을 처리한 결과 대조군에 비해 종양 세포의 증식이 억제되었으며, 이는 KML001의 처리 농도에 대해 의존적인 양상을 나타낸다(Fig. 1A, 1B). 대조군과 비교하였을 때 시간에 따른 증식 곡선의 기울기는 KML001(1 µM) 및 TSA(1 µM) 처리에 의해 유의하게 KML001(1 µM)을 처리한 심근 세포의 박동 빈도는 12시간까지 대조군과 유사한 수준이었으나, 18시간 후부터 박동 빈도가 0회로 급격히 감소하였다(P<.05, Fig. 4B).
    • 6) 본 연구에서 HCT116 대장암 세포주에 KML001 (1 µM)을 처리하였을 때 시간에 따른 세포의 증식은 저하되었으나, 세포 생존률은 대조군과 유사한 수준이었다.
    • 본 연구에서는 선행 문헌의 연구를 바탕으로 하여 1 µM 농도의 TSA를 대장암 세포에 처리하였고,9) 종양의 증식 및 생존율이 감소됨을 확인하였다.
    • KML001(1 µM) 처리 전과 비교하였을 때 처리 후 6시간에 배아세포덩어리의 박동 비율은 26%로 급격히 감소하였으며, 18시간 후에는 0%로 기록되었다(P<.05, Fig. 4C).
    • 대조군의">4B). 대조군의 배아세포덩어리 백분율은 초대 배양 후 12시간에 약 80% 정도였으나, 24시간 경과 후에 급격히 감소했다(40%). KML001(1 µM) 처리 전과 비교하였을 때 처리 후 6시간에 후)배아세포 덩어리의">배아세포덩어리의 비율은 급격히 감소하였으며, 24시간 후에는 박동이 완전히 멈추었다. 이들 결과를 종합하면, TSA는 종양 조직 외에 정상 조직에 대한 독성이 존재하는 것으로 사료된다.
    • 후)세포주기중">세포 주기 중 G1기에 분포하고 있는 세포의 비율이 증가한 것과 일치하는 결과이다. KML001은 대조군에 비해 심장 독성이 있는 것으로 나타났으나, TSA에 비해서는 현저하게 낮은 양상을 보였다.
    • 후)이중의자가포식막">이중의 자가포식막 형성이 특징적이며, 이 과정 동안 Beclin 1 복합체와 LC3 system이 중요하게 작용한다.¹⁹⁾ 본 실험에서 KML001을 처리한 HCT116 대장암 세포에서 대조군에 비해 Beclin 1및 LC3 II의 발현이 감소하였다. 반면 고농도(10 µM, 1 µM)의 TSA 처리는 LC3 II의 발현을 유의하게 증가시켰으나 Beclin 1의 발현에는 영향을 끼치지 않았다.
    • 후)활성화시킨다는">활성화 시킨다는 것을 알 수 있다. 즉 세포 성장 곡선 및 세포 생존률과 자가포식활성 정도를 비교해 보면 종양의 과증식을 억제하는 과정 동안 두 약물에 의해 자가포식기전이 다르게 작용함을 확인할 수 있다.
    • 후)억제되었으나">억제 되었으나 관련 기작은 달랐다. TSA는 HDAC 효소의 활성을 억제하고 항암 유전자를 전사시켜 종양 세포의 사멸을 유발하는 반면, KML001은 자가포식기전을 억제하고 G1기에서 세포 주기의 진행을 차단해 종양의 증식을 억제하였다. 약물 처리에 따라 후)세포주기의">세포 주기의 진행을 차단해 종양의 증식을 억제하였다. 약물 처리에 따라 심근 세포의 박동 빈도 및 박동 유무에 따른 배아세포덩어리 백분율을 비교한 결과, 두 약물 모두 대조군에 비해 현저하게 감소하였으며, 이를 통해 심장세포에 대한 독성이 존재함을 알 수 있다.
    • 01 µM)에서는 대조군과 유사한 수준을 나타내었다. 동일한 농도의 KML001을 처리한 대장암 세포주에서 LC3 II의 발현은 대조군에 비해 감소하는 양상을 보였으나, 통계적인 유의성은 나타나지 않았다(Fig. 2).
    • KML001 처리 후 24시간(55.22%) 및 48시간(67.19%)이 경과한 시기에 G1기에 존재하는 세포의 분포를 비교하였을 때, 통계 적으로 유의하게 증가하였다(11.97%). 뿐만 아니라KML001 처리 후 24시간(26.
    • 97%). 뿐만 아니라KML001 처리 후 24시간(26.52%)과 48시간(14.28%)에 S기에 존재하는 세포의 분포를 비교한 결과, 통계적으로 유의하게 감소하였다 (12.24%)(Fig. 3A, 3B).
    • 심장 근육 세포의 초대 배양 후 24시간 동안 박동 빈도는 분당 80회로 유지되었다. TSA 처리 12시간 후

      후속연구

      • 이러한 선행 연구처럼 본 연구에서도 대장암 세포에서 KML001에 의한 자가포식기전의 활성화 및 G1기 세포 정지를 확인하였으나, 세부 신호 전달 기작에 대해서는 추후 연구가 필요할 것으로 사료된다.