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문제 정의
- 따라서 본 연구는 남해안 일대에서 봄부터 여름철에 어획되어 부산과 경남지역을 중심으로 소비되고 있는 군소에서 다당류를 추출하고, GAG를 분리, 정제하여 면역기능과 관련이 있는 대식세포주와 암세포주를 통하여 군소 유래 GAG의 생리 기능성을 탐색하였다.
- LPS 1 μg/ mL과 비교할 때 군소 GAG 분획물 100 μg/mL이 거의 비슷한 NO 생성량을 나타내었다. 이 같은 결과는 군소 GAG 분획물이 대식세포를 활성화시킴을 제시하였다.
- 군소 당추출물 200 μg/mL와 GAG 분획물 100 μg/mL에서는 대조군에 비해 30%가 넘는 대식세포 증식률을 보여주 었다. 이 같은 결과는 군소의 당 추출물이 면역세포의 생육을 활성화시켜 면역조절 효과가 있음을 보여주는 것으로 추정하였다. 해양생물의 세포독성을 확인한 연구로 Pan 등 (12)은 4종 해조류의 RAW 264.
제안 방법
- 24시간 배양한 후 배양 상등액을 취하여 원심분리기(5415C, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany)로 10,000 rpm에서 5분간 원심분리 시켜 상등액으로 TNF-α의 생성량을 측정하였다.
- 96 well에서 24시간 동안 군소 당 추출물은 배지의 최종 농도가 50, 100 및 200μg/mL의 농도로, GAG 분획물은 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 배양액에 생성된 TNF-α의 생성량을 측정하였다.
- TNF-α 생성능 측정과 같은 방법으로 세포를 배양하고 시료처리를 한 후, 배양 상등액을 취하여 10,000 rpm에서 5분간 원심분리 시킨 후 그 상등액을 취해 interleukin-6의 생성량을 측정하였다. IL-6의 생성량은 Mouse Interleukin6 ELISA Ready-SET-Go kit(Cat. 88-7064-22, eBioscience Co.)으로 측정하였다. IL-6의 함량은 표준 kit에 포함된 IL-6로 작성한 표준곡선에 따라 계산하였다.
- )으로 측정하였다. IL-6의 함량은 표준 kit에 포함된 IL-6로 작성한 표준곡선에 따라 계산하였다.
- RAW 264.7 cell line에 대한 시료의 독성을 알아보기 위하여 군소에서 추출한 당 추출물(ASE)의 최종 농도는 25, 50, 100 및 200 μg/mL로 처리하였고, GAG 분획물(ASF)의 농도는 1, 10, 50, 100 μg/mL로 처리하였다.
- TNF-α 생성능 측정과 같은 방법으로 세포를 배양하고 시료처리를 한 후, 배양 상등액을 취하여 10,000 rpm에서 5분간 원심분리 시킨 후 그 상등액을 취해 interleukin-6의 생성량을 측정하였다.
- TNF-α의 생성량은 TNF-α kit[Cat. 88-7324, Mouse TNF-α(Tumor Necrossis Factor alpha ELISA Ready-SET-Go, eBioscience Co., Seoul, Korea)]으로 측정하였다.
- TNF-α의 함량은 kit에 포함된 TNF-α로 작성한 표준곡선에 따라 계산하였다.
- 군소 다당 추출물과 GAG 분획물이 대식세포 활성화 여부를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포주에 군소에서 추출한당 추출물과 GAG 분획물의 농도를 달리하여 24시간 처리하고 NO 생성량의 변화를 측정하였다(Fig. 3). LPS 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 NO 생성량과 비교하였을 때, 약 31배 높은 NO 생성량을 보였고, 군소 당 추출물 및 GAG 분획물 처리군도 농도가 증가함에 따라 NO 생성량은 증가 하였다.
- 군소 다당 추출물은 최종 농도가 25, 50, 100 및 200 μg/mL가 되도록 처리하였고, 군소 GAG는 5, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하였다.
- 군소 육질에서 다당류의 추출은 동결 건조시료 1 g에 10배량의 50 mM sodium phosphate 완충액(pH 6.0)을 첨가하고, 기질에 대하여 단백질 농도비가 1/50이 되도록 Flavourzyme 500MG을 첨가하여 60℃의 항온 수조에서 흔들어 주면서 15시간 동안 가수분해하였다. 원심분리(3,000×g, 30분)하여 얻은 가수분해물의 상등액에 최종농도가 3% 되도록 trichloroacetic acid를 첨가하여 실온에서 30분 방치한 후 원심분리(3,000×g, 30분)하여 침전한 단백질을 제거하였다.
- 군소에서 분리한 당 추출물과 GAG 분획물이 TNF-α 생성에 미치는 영향을 검토하였다(Fig. 4).
- 군소에서 추출한 다당 추출물 및 GAG 분획물의 세포독성은 RAW 264.7 대식세포주로 확인하였다. 즉 세포 배양용 플라스크에 배양한 RAW 264.
- 그리고 암세포에 대한 성장 억제률을 측정하기 위하여 AGS 세포주(human stormach cancer cell line)를 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다.
- 대조군으로는 시료 미처리군을, 양성 대조군으로는 lipopolysaccharide(LPS)를 1 μg/mL의 농도로 처리하였다.
- 새로운 배지에 시료를 최종 농도가 25, 50, 100 및 200 μg/mL이 되도록 녹여 세포주에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
- 각 세포주를 10 cm well plate에서 배양하여 1주일에 2～3회 계대하였으며, 배지는 10% FBS 배지를 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO2, 36.5℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한 번씩 교환하였다.
- 새로운 배지에 시료를 최종 농도가 25, 50, 100 및 200 μg/mL이 되도록 녹여 세포주에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포주의 생존률을 측정하기 위해 MTT 시약을 이용하여 microplate reader(Perkin Elmer 1420, VICTORTM X Multilabel Plate Readers, Waltham, MA, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.
- cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 시료의 농도를 달리하여 24시간 동안 처리한 후 MTS 시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하여 정상세포에 대한 독성여부를 측정하였다. 그리고 암세포에 대한 성장 억제률을 측정하기 위하여 AGS 세포주(human stormach cancer cell line)를 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다.
- 그리고 암세포에 대한 성장 억제률을 측정하기 위하여 AGS 세포주(human stormach cancer cell line)를 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 시료의 농도를 달리하여 72시간 동안 처리한 후 MTT 시약을 이용하여 세포의 생존률을 측정하고 암세포에 대한 성장 억제률을 측정하였다.
- 여기에 대조군으로는 무시료 처리군을, 비교 대조군으로 LPS를 1 μg/mL로 처리하였으며 실험군은 시료의 농도를 달리하여 24시간 동안 처리하였다.
- 정상세포에 대한 독성여부를 확인하기 위하여 rat 유래의 회장세포인 IEC-6 세포주(mouse illeum cell line)를 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다.
- 7 대식세포주로 확인하였다. 즉 세포 배양용 플라스크에 배양한 RAW 264.7 세포주를 10 mL 피펫으로 세포를 플라스크에서 떼어내어 계대하였고, 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 배양하였다. RAW 264.
대상 데이터
- 배양에 관련된 기기는 NUNC Co.(Langenselbold, Germany)의 제품을 사용하였다.
- 끓는 물에서 5분 동안 자숙하여 냄새를 제거한 군소(Aplysia kurodai)를 통영시 잠수기조합에서 구입하여 육질과 내장을 분리한 다음, 육질부분만을 동결건조 하여 -20℃ 의 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다. 단백질 분해효소로서 Flavourzyme 500MG와 Neutrase는 Novozymes(New York, USA)에서 구입하였으며, DEAE-Sepharose 수지와 Superdex HR-200 칼럼은 GE health Korea사(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 분자량 측정을 위한 표준단백질과 GAG 및 그 외의 시약은 Sigma-Aldrich사(St.
- 끓는 물에서 5분 동안 자숙하여 냄새를 제거한 군소(Aplysia kurodai)를 통영시 잠수기조합에서 구입하여 육질과 내장을 분리한 다음, 육질부분만을 동결건조 하여 -20℃ 의 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다. 단백질 분해효소로서 Flavourzyme 500MG와 Neutrase는 Novozymes(New York, USA)에서 구입하였으며, DEAE-Sepharose 수지와 Superdex HR-200 칼럼은 GE health Korea사(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 분자량 측정을 위한 표준단백질과 GAG 및 그 외의 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포 실험에 사용된 배지는 Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM), RPMI 1640 및 fetal bovine serum(FBS)은 Hyclone Co.
- 실험에 사용한 대식 세포주(RAW 264.7 cell line), 위암세포주(AGS cell line), 정상 상피 세포주(IEC-6 cell line)는 모두 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 각 세포주를 10 cm well plate에서 배양하여 1주일에 2～3회 계대하였으며, 배지는 10% FBS 배지를 함유한 성장배지를 이용하였다.
데이터처리
- 통계분석은 Student's t-test를 이용하였고, 대조군에 대한 통계적 유의성은 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서각 실험군 평균값 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 시료 처리 후 24시간 동안 배양하였다. NO 생성량은 Griess 시약으로 측정하였다. Griess 시약은 5%의 질산용액에 1% sulfanilamide를 넣고 0.
성능/효과
- 7 cell line에 대한 시료의 독성을 알아보기 위하여 군소에서 추출한 당 추출물(ASE)의 최종 농도는 25, 50, 100 및 200 μg/mL로 처리하였고, GAG 분획물(ASF)의 농도는 1, 10, 50, 100 μg/mL로 처리하였다. ASE와 ASF는 상기의 농도 구간에서 세포에 대한 독성은 보이지 않았으며, 오히려 대식세포가 활성화되어 세포 증식률이 증가하는 결과를 나타내었다(Fig. 1, 2). MTT에 의한 세포 성장률의 측정은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium이 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]으로 환원되는 정도를 측정하는 검사법으로, 이 파장에서 측정된흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다(11).
- 5). GAG 분획물도 당 추출물과 비슷한 생성량의 증가를 보여, 군소 당 추출물 및 GAG 분획물은 IL-6의 생성량을 크게 증가시킴을 확인할 수 있었다. 황산 다당을 함유한 Spirulina maxima의 저온초음파추출물이 세포의 IL-6과 TNF-α의 분비량을 증가시켜 면역세포 생육을 증진하는 효과를 보여준 것처럼(18), 군소당 추출물 및 GAG 분획물 등은 세포의 생육증진과 cytokine 의 분비량 증가를 통해 면역조절 소재로서의 활용이 가능할 것으로 여겨진다.
- IEC-6 정상세포의 성장에 미치는 영향 Rat intestinal epithelial 유래 세포주인 IEC-6로 장내 상피세포의 성장에 미치는 영향을 알아본 결과(Fig. 7), 24시간 배양하였을 때 군소 당 추출물은 100 μg/mL과 200 μg/mL의 농도에서 유의적인 증가효과를 보여주었다.
- 3). LPS 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 NO 생성량과 비교하였을 때, 약 31배 높은 NO 생성량을 보였고, 군소 당 추출물 및 GAG 분획물 처리군도 농도가 증가함에 따라 NO 생성량은 증가 하였다. 군소 당 추출물 50 μg/mL 농도에서는 14.
- 군소 당 추출물 및 GAG 분획물의 처리 시 모든 실험군에서 TNF-α 생성량은 무첨가 대조군에 비해 약 3배 증가하였다.
- 군소 당 추출물과 GAG 분획물 처리 시 IL-6 생성량을 비교해 보면 무첨가 대조군은 7.0±1.5 pg/mL이었으며, 군소당 추출물 50 μg/mL은 1,248.4±50.1 pg/mL, 100 μg/mL은 1,197.7±67.0 pg/mL, 그리고 200 μg/mL은 1,223.5±109.9 pg/mL로 생성량이 크게 증가하였다(Fig. 5).
- 군소에서 정제한 GAG는 대식세포주인 RAW 264.7에서 세포독성은 보이지 않았으며 NO 생성량, TNF-α, IL-6 생성량을 증가시켜 면역조절 효과가 있음을 확인하였다.
- 그러나 72시간 시료 처치 후에는 대조군에 대비하여 군소 당 추출물 50 μg/mL은 88.9±8.5%의 생존율을, 200 μg/mL에서는 69.5±11.9%, 군소 GAG 분획물 10 μg/mL의 경우는 68.6±14.5%, 100 μg/mL에서는 59.4±4.6%의 생존율을 보여 40% 가까운 암세포의 성장억제 효능을 보였다.
- 그리고 100 μg/mL 농도에서 배양 72시간 후 약 40%에 가까운 위암 세포(AGS) 성장 억제 효과가 나타났고, 정상세포 IEC-6에는 독성을 보이지 않았다.
- 3%의 생육 저해를 나타내었으며, 푸코이단 표준물질도 55% 이상의 활성이 나타났다(19). 또한 해송이버섯 산성다당 획분의 위암세포주 AGS에 대한 세포증식 억제효과를 검정한 결과, 산성다당체가 0.5 mg/mL의 농도에서 73.9%의 유의적인 세포증식억제를 나타내었다. 이 결과는 군소의 GAG 분획물에서 측정한 위암세포에 대한 항암효과와 유사하였다.
- 면역조절능이 암세포의 성장을 억제하는 지 확인하기 위하여 위암세포주인 AGS 세포주로 암세포주의 성장 억제 효과 여부를 확인한 결과(Fig. 6), 24시간의 시료처치군에서는 성장 억제 효과를 확인할 수는 없었다. 그러나 72시간 시료 처치 후에는 대조군에 대비하여 군소 당 추출물 50 μg/mL은 88.
- 즉 10 μg/mL에서 26배, 100 μg/mL에서는 30배가 넘는 증가량을 보여 정제도가 증가함에 따라 NO 생성량의 증가를 확인하였다.
- 대조군과 비교하였을 때 군소 GAG 분획물 50 μg/mL와 100 μg/mL에서 세포가 증식이 이루어지는 것으로 나타났다. 즉, 군소에서 추출한 당 추출물과 GAG 분획물은 정상적인 장내 상피세포에는 독성을 나타내지 않았다.
후속연구
- 그리고 100 μg/mL 농도에서 배양 72시간 후 약 40%에 가까운 위암 세포(AGS) 성장 억제 효과가 나타났고, 정상세포 IEC-6에는 독성을 보이지 않았다. 이 같은 결과는 면역조절을 위한 기능성식품 혹은 위암 치료제로서 군소의 당 추출물과 GAG의 활용 가능성을 제시한다.
- 이와 같은 연구결과로 보아 군소 유래의 GAG가 소화계의 기능 및 종양 형성 등에 미치는 영향이 큰 것으로 여겨지며, GAG의 이러한 작용 기전에 관한 연구가 앞으로 더 진행되어야 할 것이다.
- 황산 다당을 함유한 Spirulina maxima의 저온초음파추출물이 세포의 IL-6과 TNF-α의 분비량을 증가시켜 면역세포 생육을 증진하는 효과를 보여준 것처럼(18), 군소당 추출물 및 GAG 분획물 등은 세포의 생육증진과 cytokine 의 분비량 증가를 통해 면역조절 소재로서의 활용이 가능할 것으로 여겨진다.
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