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문제 정의
- 현재 시중에서 발모제로 잘 알려진 약물인 미녹시딜은 실험동물에서 모낭을 자극하여 모낭이 충분히 길어지고 모발 재 성장에 도움을 준다고 알려져 있어 현재 발모촉진제로 사용하고 있다. 하지만 서론에서도 언급한 것 같이 미녹시딜은 여러 가지 부작용을 초래하므로 본 실험에서는 경옥고에 하수오를 추가한 경옥고가미방 추출물 시료(YNS-10)를 이용하여 실험동물에서 모발 성장에 효과가 있는지를 평가하여 부작용이 없는 발모촉진 시료를 확보하고자 하였다. 결과, YNS-10은 미녹시딜과 유사한 효과를 보이므로 발모를 촉진 하는 유용한 시료로서 헤어토닉이나 발모제품에 이용될 수있을 것으로 사료된다.
제안 방법
- 7일, 14일, 21일에 적출한 조직을 분석시까지 4% 포름알데히드 용액에 고정하여 보관한 후 채취한 시료를 동일 시점에서 분석하였다. 밀도 및 굵기 변화 관찰을 위해 적출된 조직을 와트만 종이에 평평하게 잘 펴서 의료용 카메라를 이용하여 촬영한 후 2개 부위의 일정한 면적을 정하여 Folliscope (Ver.
- 또한 IGF transgenic 동물에서 모발의 성장이 유의성 있게 증가한 다는 보고가 있다20). YNS-10에 의해 촉진된 모발의 성장이 IGF-1 와 관련이 있는지 확인하기 위해 시험물질 도포 개시후 7일 및 14일째에 채취한 조직을 사용하여 IGF-1의 발현을 확인하였다. IGF-1의 발현의 증가가 미녹시딜군과 YNS-10 군에서 뚜렷하게 나타났다.
- 이는 혈관 내피를 성장시켜 혈액 순환을 개선하여 모발의 성장과 모근세포의 분화를 강화시키는 인자로 알려져 모발관련 연구에 사용되는 지표인자 중 하나이다. YNS-10의 발모 촉진 효과가 혈액순환과 관련이 있는지 확인하기 위해 시험물질도포 개시후 7일 14일째 조직을 사용하여 VEGF의 발현을 확인하였다. 결과 YNS-10군에서 VEGF의 발현이 증가되었 음을 확인할 수 있었고 미녹시딜 수준의 유의적 증가가 확인되었다.
- 또한 경옥고(瓊玉膏)는 延年益壽不老의 生精補氣 하는 처방으로 동의보감에서塡精, 補髓하여 毛髮을 검게 하고 齒牙를 소생시키며, 萬身이俱足하여 百病을 제거하는 효능이 있다고 하였다17). 따라서본 연구는 인삼(Ginseng Radix), 백복령(Poria), 생지황 (Rehmanniae Radix) 및 꿀의 원방에 補肝腎, 益精血하는 하수오(Polygoni Multiflori Radix)18)를 첨가한 경옥고가미방을 시료로 하였으며, 5% 미녹시딜을 양성대조물질로 사용하여 자발적 탈모가 진행되는 특징을 가진 C57BL/6 마우스에서 경옥고가미방이 모발 성장에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 7일, 14일, 21일에 적출한 조직을 분석시까지 4% 포름알데히드 용액에 고정하여 보관한 후 채취한 시료를 동일 시점에서 분석하였다. 밀도 및 굵기 변화 관찰을 위해 적출된 조직을 와트만 종이에 평평하게 잘 펴서 의료용 카메라를 이용하여 촬영한 후 2개 부위의 일정한 면적을 정하여 Folliscope (Ver. 2.8, Lead M, Korea)로 털의 밀도와 굵기를 측정하였다.
- 알려진 성장인자로는 insulin-like growth factor (IGF)-1, vascular endothelial growth factor (VEGF)들이 있다19). 본 실험에서는 YNS-10에 의한 IGF-1과 VEGF 발현 변화를 14일째에 관찰하였다.
- Phototrichogram 방법은 가장 이상적인 모발성장 평가방법이며, 비침습적인 방법으로서 여러 가지 모발 관련 지표들을 반복적으로 신뢰성 있게 관찰할 수 있는 장점을 가지고 있다26). 본 연구에서는 발모양상이 가장 현저하게 나타난 14일째에 모발 밀도와 굵기를 측정하였다. 결과 YNS-10 처리 마우스가 모발밀도 뿐 아니라 모발굵기에 있어서 미녹시딜과 유사한 효과를 유의적으로 보여 주 었다.
- 시료를 도포한 등 조직의 발모 변화를 관찰하기 위해 디지털사진기를 이용하여 5일 간격으로 촬영하였다.
- 시료의 발모 효과를 보기 위해 21일 동안 제모 된 생쥐 등에 시료를 도포하였다. 제모 후 5일째 까지는 모든 군에서 발모 상태에 대한 차이가 거의 없었다.
- 이 후 1x PBST 로 10분씩 3회 세척하고, 2차 항체를 실온에서 1:1,000으로 희석 하여 1시간 반응시켰다. 이후 1xPBST로 10분씩 3번 세척하고 ECL substrate와 반응시킨 후 Image 분석기(Gel Documentation system, UVP, USA)를 이용하여 각 factor 의 발현을 조사하였다.
- 본 시험에 사용한 인삼(한국산), 하수오(한국산), 백복령(한국산), 숙지황(한국산) 및 꿀은 대원한약국(대구)에서 구입하여 냉장 보관하여 사용하였다. 인삼, 하수오, 백복령, 숙지황은 각각 10% propylene glycol, 10% 1, 3-butylene glycol에 침지하여 50℃에서 48시간 방치하여 추출하였다. 마우스 도포 시료인 YNS-10은 인삼, 하수오, 백복령, 숙지황 추출물과 꿀을 1:1:1:1:0.
- 제모된 C57BL/6 수컷 마우스는 미지근한 물로 피부에 남아있는 제모제를 씻어내고, 24시간 회복기를 거친 뒤 정상군(normal), 미녹시딜군 (minoxidil), 실험군(YNS-10)으로 분리하여 각각의 약물을 매일 1회 제모 된 등 부위에 마리당 200ul씩 도포하였다. 정상군은 추출용매(PG:1:3-BG:d-Water=10:10:80)를, 미녹시딜군은 추출용매에 용해한 5% minoxidil 용액을, 시험군은 YNS-10 용액을 도포하였다.
- 피부 속에 남아있는 모낭과 미세한 털을 제거하기 위하여 제모제(니크린, 일동제약)를 피부에 도포하여 5분간 방치한 후 제모주걱을 이용하였다. 제모된 C57BL/6 수컷 마우스는 미지근한 물로 피부에 남아있는 제모제를 씻어내고, 24시간 회복기를 거친 뒤 정상군(normal), 미녹시딜군 (minoxidil), 실험군(YNS-10)으로 분리하여 각각의 약물을 매일 1회 제모 된 등 부위에 마리당 200ul씩 도포하였다. 정상군은 추출용매(PG:1:3-BG:d-Water=10:10:80)를, 미녹시딜군은 추출용매에 용해한 5% minoxidil 용액을, 시험군은 YNS-10 용액을 도포하였다.
- 펜토바비탈(50 mg/kg, 엔토발, 한림제약)을 복강 주사하여 마취시킨 다음 이발기를 이용하여 마우스의 등 부위 털을제거하였다. 피부 속에 남아있는 모낭과 미세한 털을 제거하기 위하여 제모제(니크린, 일동제약)를 피부에 도포하여 5분간 방치한 후 제모주걱을 이용하였다.
- 펜토바비탈(50 mg/kg, 엔토발, 한림제약)을 복강 주사하여 마취시킨 다음 이발기를 이용하여 마우스의 등 부위 털을제거하였다. 피부 속에 남아있는 모낭과 미세한 털을 제거하기 위하여 제모제(니크린, 일동제약)를 피부에 도포하여 5분간 방치한 후 제모주걱을 이용하였다. 제모된 C57BL/6 수컷 마우스는 미지근한 물로 피부에 남아있는 제모제를 씻어내고, 24시간 회복기를 거친 뒤 정상군(normal), 미녹시딜군 (minoxidil), 실험군(YNS-10)으로 분리하여 각각의 약물을 매일 1회 제모 된 등 부위에 마리당 200ul씩 도포하였다.
대상 데이터
- 6주령의 C57BL/6 수컷 마우스는 효창사이언스에서 입수하였으며, 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 조명주기 조건하에서 식이와 식수는 자유롭게 섭취토록 하였으며 7일 간의 적응기간 후 실험에 사용하였다.
- 인삼, 하수오, 백복령, 숙지황은 각각 10% propylene glycol, 10% 1, 3-butylene glycol에 침지하여 50℃에서 48시간 방치하여 추출하였다. 마우스 도포 시료인 YNS-10은 인삼, 하수오, 백복령, 숙지황 추출물과 꿀을 1:1:1:1:0.2 비율로 혼합하여 사용하였다.
- 본 시험에 사용한 인삼(한국산), 하수오(한국산), 백복령(한국산), 숙지황(한국산) 및 꿀은 대원한약국(대구)에서 구입하여 냉장 보관하여 사용하였다. 인삼, 하수오, 백복령, 숙지황은 각각 10% propylene glycol, 10% 1, 3-butylene glycol에 침지하여 50℃에서 48시간 방치하여 추출하였다.
- 실험에 사용한 C57BL/6 마우스는 7주령에 이르러 모발주기의 휴지기가 시작되어 자발적인 탈모가 일어나며 melanocyte가 모낭에 한정적으로 존재함으로 멜라닌 합성이 모발의 성장 주기와 일치하게 나타난다. 즉, 마우스의 피부색으로 모발성장 주기를 판정할 수 있는 장점 때문에 대부분의 탈모실험에서 실험동물로 사용된다.
데이터처리
- 실험결과의 통계 처리는 SPSS 11.5 (SPSS Inc, USA)를이용하였으며 one-way-ANOVA를 실시, 분석결과에 대한 p<0.05의 수준에서 LSD 다중 검정법으로 사후 검정을 실시 하여 각 처리구간의 평균치에 대한 유의성을 분석하였다.
성능/효과
- 반면, 미녹시딜이 도포된 군에서 검게 변한 등 표피의 색 변화가 전반적으로 관찰되었고 실험 시료인 YNS-10을 도포한 실험 군에서도 전반적인 색 변화가 관찰되었다. 15일째 정상 군에서 검게 변한 색변화가 뚜렷하게 관찰 되었고 육안으로 관찰할 수 있는 발모도 부분적으로 나타났다. 반면, 미녹시딜군과 실험군에서는 현저하게 발모가 진행되었음을 확인할 수 있었다 (Fig 1).
- 7일째 미녹시딜에 의한 IGF-1의 발현은 정상군에 비해 155±20 % 증가 하였고 YNS-10을 처리한 군은 137±10 % 증가함을 보였다 (Fig 4).
- IGF-1와 VEGF 는 모두 발모 기전을 확인할 수 있는 대표적인 지표인자들인데 이들의 발현을 14일째 확인한 결과 미녹시딜 및 YNS-10의 발모효과가 모발 성장인자들의 발현과 연관이 있는 것으로 나타났다. 따라서 미녹시딜과 YNS-10 약물은 모발 성장과 관련된 유전자의 발현을 촉진 시킴으로써 발모 효과를 나타낸다고 생각된다.
- YNS-10도 미녹시딜과 유사한 효과를 보여 평균 91.4±8.6 개/cm2로 관찰되어 정상 군에 비해 유의적으로 증가하였다(Fig 2).
- 07 mm로 정상군의 2배 이상으로 미녹시딜의 효과와 유사하였고 정상 군에 비해 유의적인 증가를 보였다(Fig 3). YNS-10은 굵기 변화에서도 육안 관찰과 일치되는 결과를 보여 주었으며 미녹시딜과 유사한 모발의 굵기를 증가시키는 효과도 확인되었다.
- 본 연구에서는 발모양상이 가장 현저하게 나타난 14일째에 모발 밀도와 굵기를 측정하였다. 결과 YNS-10 처리 마우스가 모발밀도 뿐 아니라 모발굵기에 있어서 미녹시딜과 유사한 효과를 유의적으로 보여 주 었다.
- YNS-10의 발모 촉진 효과가 혈액순환과 관련이 있는지 확인하기 위해 시험물질도포 개시후 7일 14일째 조직을 사용하여 VEGF의 발현을 확인하였다. 결과 YNS-10군에서 VEGF의 발현이 증가되었 음을 확인할 수 있었고 미녹시딜 수준의 유의적 증가가 확인되었다. 미녹시딜에 의한 VEGF의 발현은 정상군에 비해 157±17 % 증가 하였고 YNS-10을 처리한 군은 168±20% 증가함을 보였다(Fig 5).
- 반면, 미녹시딜군과 실험군에서는 현저하게 발모가 진행되었음을 확인할 수 있었다 (Fig 1). 결과적으로 시료 YNS-10은 정상 군보다 발모를 촉진시키며 그 정도가 미녹시딜과 유사한 것으로 확인되었다.
- 미녹시딜에 의한 VEGF의 발현은 정상군에 비해 157±17 % 증가 하였고 YNS-10을 처리한 군은 168±20% 증가함을 보였다(Fig 5).
- 10일째 정상 군에서는 hair follicle에 의한 표피의 색 변화가 일부분 관찰되었다. 반면, 미녹시딜이 도포된 군에서 검게 변한 등 표피의 색 변화가 전반적으로 관찰되었고 실험 시료인 YNS-10을 도포한 실험 군에서도 전반적인 색 변화가 관찰되었다. 15일째 정상 군에서 검게 변한 색변화가 뚜렷하게 관찰 되었고 육안으로 관찰할 수 있는 발모도 부분적으로 나타났다.
- 더구나, IGF transgenic animal에서 hair elongation이 유의성 있게 증가한다20). 본 실험에서 YNS-10의 도포에 따라 14일째에 IGF-1 및 VEGF의 발현이 증가함을 보였다. 분자생물학적인 분석 결과를 근거로 YNS-10의 기전을 유추해 보면 IGF와 VEGF 등 성장인자들을 조절하여 hair follicle 및 주변 조직의 성장을 촉진하고 혈액순환을 개선하므로 발모를 촉진하는 것으로 사료된다.
- 본 실험에서는 7주령 C57BL/6마우스의 제모한 등 피부 표면이 분홍색을 띤 휴지기였음을 확인하였고 실험이 진행됨에 따라 분홍색의 피부 표면이 회색과 검은색으로 변해가므로 모발주기가 휴지기에서 성장기로 전환되는 것을 육안적으로 확인할 수 있었다.
- 15일째는 미녹시딜과 YNS-10을 처리한 마우스에서 검은색 표피와 육안으로도 모발의 성장을 확인할 수 있었고 정상군에서는 짙은 회색의 모낭과 검은색의 피부가 관찰되었지만 정도가 미미하였다. 본 연구에서 YNS-10은 모발성장 촉진양상이 양성대조군이 미녹시딜과 유사하게 나타났다. 또한 털의 밀도와 굵기를 기기적으로 평가하였는데, 이때 사용한 Folliscope는 phototrichogram의 일종으로 피부측정 통합 장치에 연결된 디지털 프로브 특수 외부센서가 대기 상태를 감지하고, 감지된 자료는 프로그램과 연결되어 작동 시에 내부 온습도 상태가 자동으로 측정되어 각 결과 값들과 함께 저장 되는 장비이다.
- 본 실험에서 YNS-10의 도포에 따라 14일째에 IGF-1 및 VEGF의 발현이 증가함을 보였다. 분자생물학적인 분석 결과를 근거로 YNS-10의 기전을 유추해 보면 IGF와 VEGF 등 성장인자들을 조절하여 hair follicle 및 주변 조직의 성장을 촉진하고 혈액순환을 개선하므로 발모를 촉진하는 것으로 사료된다.
- 실험 군의 모발 굵기는 0.141±0.07 mm로 정상군의 2배 이상으로 미녹시딜의 효과와 유사하였고 정상 군에 비해 유의적인 증가를 보였다(Fig 3).
- 6 개/cm2로 관찰되어 정상 군에 비해 유의적으로 증가하였다(Fig 2). 이 결과는 육안 관찰에서 나타났던 결과와 일치되는 것으로 YNS-10 시료는 미녹시딜과 유사한 모발 밀도의 증가 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 따라서 미녹시딜과 YNS-10 약물은 모발 성장과 관련된 유전자의 발현을 촉진 시킴으로써 발모 효과를 나타낸다고 생각된다. 즉, YNS-10의 발모 촉진효과는 IGF-1의 발현을 증가시켜 모발의 성장및 모근세포의 분화를 촉진하고, VEGF의 발현을 촉진함으로써 혈액순환이 개선되어 발모가 촉진한다고 사료된다.
- 한편, 본 실험에서 육안적인 모발의 성장, 털의 밀도 및 굵기의 변화 뿐 아니라 모발성장인자인 IGF-1와 VEGF의 변화를 관찰해 본 결과 모든 부분에서 실험군인 YNS-10군이 양성대조군인 미녹시딜군의 변화에 뒤지지 않는 효과를 보였다. 발모관련 단백질인 IGF-1은 in vitro에서 배양된 hair follicle 뿐만 아니라 epithelial cell의 성장을 촉진한다19).
후속연구
- 하지만 서론에서도 언급한 것 같이 미녹시딜은 여러 가지 부작용을 초래하므로 본 실험에서는 경옥고에 하수오를 추가한 경옥고가미방 추출물 시료(YNS-10)를 이용하여 실험동물에서 모발 성장에 효과가 있는지를 평가하여 부작용이 없는 발모촉진 시료를 확보하고자 하였다. 결과, YNS-10은 미녹시딜과 유사한 효과를 보이므로 발모를 촉진 하는 유용한 시료로서 헤어토닉이나 발모제품에 이용될 수있을 것으로 사료된다.
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