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문제 정의
- 본 연구에서는 미선나무잎 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 EtOAC 분획물과 열수 추출물을 이용하여 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거활성과 Fe2+ 킬레이팅 활성을 측정하였다. 또한 산화적 DNA 손상억제 효과는 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 통해 평가하였다.
- 본 연구에서는 우리나라에서만 자생하고 있는 1속1종의 미선나무(Abeliophylli distichi Folium)를 항산화 및 암예방적 소재로써의 이용 가능성을 높이고자, 미선나무 잎 추출물의 항산화활성과 산화적 DNA 손상 억제활성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 우리나라에서만 자생하고 있는 미선나무 잎 추출물의 항산화효과와 산화적 DNA 손상 억제활성을 평가함으로써, 미선나무의 항산화 및 암 예방적 소재로써의 이용 가능성을 높이고자한다.
제안 방법
- 30분 후 반응 혼합물 20 ㎕와 φ X-174 RF I plasmid DNA 5 ㎕를 다시 혼합하여 37 ℃에서 약 30분간 재반응 시켰다. 5 ㎕ 버퍼(50% glycerol(v/v), 40 mM EDTA and 0.05% bromophenol blue)를 첨가하고 1% agarose gel로 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 사진 촬영하였다.
- EtOAC와 열수 추출에 의해 분리된 미선나무 잎 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거 활성과 Fe2+ 킬레이팅 활성을 측정하였다.
- 건조된 미선나무 잎 200 g을 분쇄한 후 80% methanol 1,000 ㎖을 가하여 3일간 침지한 후 여과하였다. 여과된 추출물은 200 ㎖로 농축한 다음 50 ㎖ 증류수를 첨가하고 이를 petroleum ether로 분획하였다.
- 또한 산화적 DNA 손상억제 효과는 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 통해 평가하였다.
- 미선나무 잎 추출물의 산화적 DNA 손상 억제 활성은 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 이용한 비 세포적 시스템과 intracellular DNA migration assay를 통한 세포적 시스템으로 평가 되었다.
- 5：5) 의 37℃에서 Fenton 반응에 의해 생성된 hydroxyl 라디칼 760 ㎕와 농도별 시료 40 ㎕를 혼합한 후 37℃에서 약 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 200 mM sodium salicylate 200 ㎕를 첨가 한 후 UV/Visible spectrophotometer(Berkman, USA)을 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식으로 소거능(%)을 구하였다.
- 건조된 미선나무 잎 200 g을 분쇄한 후 80% methanol 1,000 ㎖을 가하여 3일간 침지한 후 여과하였다. 여과된 추출물은 200 ㎖로 농축한 다음 50 ㎖ 증류수를 첨가하고 이를 petroleum ether로 분획하였다. 분획된 수용층을 다시 ethyl acetate(EtOAC)로 분획한 다음, EtOAC 층을 sodium sulfate anhydrous로 탈수시킨 뒤 감압 농축하여 건조 하였다.
- 05% bromophenol blue) 10㎕를 첨가한 후 70℃에서 10분간 방치 후 2% agarose 겔로 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 사진 촬영을 하였다.
- 세포 용해 후 원심분리를 통해 세포 잔해물을 제거하고 RNase 5 ㎕ 첨가 후 약 55℃에서 60분간 재 반응 시켰다. 주입버퍼(50% glycerol(v/v), 40 mM EDTA and 0.05% bromophenol blue) 10㎕를 첨가한 후 70℃에서 10분간 방치 후 2% agarose 겔로 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV하에서 사진 촬영을 하였다.
- O 1,000 ㎖을 가하여 100℃에서 2시간 동안 추출하였다. 추출물을 여과한 뒤 동결건조기를 이용하여 건조 하였다. 열수 추출물의 추출 수율은 약 8%(w/w)로 나타났다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 미선나무(Abeliophylli distichi Folium) 잎은 충북 괴산군 칠성면 농가에서 재배되고 있는 개체로부터 채취하여 동결 건조한 후 다음과 같은 방법으로 추출하여 항산화 활성 평가를 위한 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 각 추출물의 DPPH에 대한 전자 공여능은 Bondet 방법7) 에 의해 측정하였다. 여러 농도의 추출물 40 ㎕를 300 μM DPPH/EtOH 760 ㎕에 첨가한 후 30분간 37℃에서 방치한 후 UV/Visible spectrophotometer(Berkman, USA)을 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 각 추출물의 hydroxyl 라디칼 소거 능은 Smirnoff와 Cumbes 방법8)에 따라 FeSO4와 H2O2의 Fenton 반응에 의해 생성된 Hydroxyl 라디칼에 의해 가수분해 되는 정도를 통해 측정되었다. 1.
- 미선나무 잎 추출물의 산화적 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage 억제활성은 Jung(2001) 등의 방법으로 측정되었다.
- 미선나무 잎 추출물의 철-킬레이팅 활성은 Hus 방법9)에 의해 측정되었다. 2 mM FeCl2 60 ㎕, 농도별 시료 40 ㎕와 증류수 700 ㎕를 혼합한 후 상온에서 약 10분간 반응 시켰다.
성능/효과
- ΨX-174 RF I plasmid DNA를 이용한 미서나무 잎 추출물의 DNA 손상 억제력을 확인한 결과(Figure 4), 각 추출물 공히 저 농도에서 산화적 DNA 손상 억제력은 매우 낮았으나, 200 ㎍/㎖ 농도에서 EtOAC 분획물 및 열수 추출물 각각 68%, 47%로 높은 DNA 손상 억제 활성을 나타냈다.
- 연자육의 열수 추출물과 EtOAC 분획물의 항산화 활성 비교 연구에 의하면 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물의 활성이 다소 높게 나타난 것은 추출물 내 페놀성 화합물의 함량 차이 때문 일 것 이라고 보고 되었다.14) 미선나무 잎 EtOAC 분획물과 열수 추출물 공히 산화적 DNA 손상 억제효과가 높은 것으로 나타났다.
- 또한 산화적 DNA 손상억제 효과는 φ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay를 통해 평가하였다. EtOAC 분획물은 200 ㎍/㎖에서 DPPH, Hydroxyl 라디칼 소거활성과 Fe2+ 킬레이팅 활성이 각각 94.72%, 62.88%, 41.13%의 활성이 나타났으며, 열추 추출물에서는 각각 88.86%, 56.7%, 37.4%로 열수 추출물에 비해 EtOAC 분획물의 항산화 활성이 다소 높은 것으로 나타났다. 또한 ψ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay에서 EtOAC 분획물 및 열수 추출물 각각 68%, 47%로 높은 DNA 손상 억제 활성을 나타냈다.
- Intracellular DNA migration assay를 통한 미선나무 잎 추출물의 DNA 손상 억제 활성을 평가한 결과(Figure 5), EtOAC 분획물 및 열수 추출물 공히 저농도에서 DNA 손상 억제활성은 매우 낮았으나, 200 ㎍/㎖ 농도에서는 DNA 손상 억제 활성을 나타냈다.
- 또한 ψ X-174 RF I plasmid DNA cleavage assay에서 EtOAC 분획물 및 열수 추출물 각각 68%, 47%로 높은 DNA 손상 억제 활성을 나타냈다.
- 미선나무 잎의 Ethyl acetate 추출물 농도별(0.32, 1.6, 8, 40, 200㎍/㎖) DPPH 및 hydroxyl radical 소거활성과 Fe2+ Chelating을 평가한 결과, 추출물 농도 200㎍/㎖에서 각각 94.72%, 62.88%, 41.13%로 높은 항산화 활성을 나타내었다. 또한 열수 추출물은 EtOAC 분획물에 비해 다소 낮지만 유사한 패턴과 활성을 나타내었다.
- 미선나무 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과(Figure 1), EtOAC 분획과 열수 추출 공히 추출물의 함량이 높을수록 DPPH 소거 활성이 높았으며, 추출물 농도 200㎍/㎖에서 각각 94.7%, 88.8%의 소거 활성을 나타내었다.
- 미선나무 추출물의 Fe2+ 킬레이팅 활성을 측정한 결과(Figure 3), EtOAC 분획물 및 열수 추출물 공히 추출물의 농도가 증가할수록 킬레이팅 활성이 완만히 증가 하였다. 추출물 농도 200㎍/㎖에서 각각 41.
- 미선나무 추출물의 Hydroxyl 라디칼 소거활성을 측정한 결과(Figure 2), EtOAC 분획물의농도가 8㎍/㎖ 까지 완만히 증가하는 소거활성을 나타냈으나, 40㎍/㎖부터 급격히 높아져 추출물 농도 200㎍/㎖에서 62.8%의 소거활성을 나타내었다. 열수 추출물은 농도가 증가할수록 활성이 완만히 증가하여, 추출물 농도 200㎍/㎖일때 56.
- 본 연구 결과에 의하면, 기존 관상학적 가치가 높았던 미선나무는 항산화 활성 및 산화적 stress에 의한 DNA손상 억제효과가 매우 높은 것으로 보아 새로운 천연 항산화 및 암예방적 소재로써의 이용 가능성이 매우 높은 것으로 판단된다.
- 8%의 소거활성을 나타내었다. 열수 추출물은 농도가 증가할수록 활성이 완만히 증가하여, 추출물 농도 200㎍/㎖일때 56.7%의 소거활성을 나타내었다.
후속연구
- 미선나무 잎 추출물의 항암 및 항염증에 관한 특허가 최근 등록되었으나, 단순한 대장암 세포 증식 억제 효과 및 COX-2 활성 저해 효과만 확인 했을 뿐 약용식물로 활용하기 위한 물질적 탐색과 항산화 활성에 관한 학문적 연구는 전무한 실정이다. 따라서 미선나무의 다양한 부위를 소재로한 체계적인 생물학적 활성 규명은 새로운 고 부가가치의 약용식물의 개발과 더불어 세계적 유일의 종인 미선나무를 우리나라 고유의 천연자원임을 알리는 기회가 될 것으로 사료된다.
- 본 연구결과를 통해 미선나무는 기존 알려진 관상용적인 가치뿐 만 아니라, 세포내 산화적 DNA손상을 항산화 효과에 의해 매우 효과적으로 억제시키는 천연 항산화 소재로써의 가치가 매우 높을 것으로 판단된다.
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