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문제 정의
- 연구 논문에서는 처음으로 확인하는 미선나무에 대한 피부주름개선 효과를 확인한 것이다. 본 연구에서는 생산의 증대로 인하여 각 종 생리활성에 대한 새로운 천연물 소재로 관심받기 시작한 미선나무의 가치를 확인하고자 하였다. 피부노화로 인한 주름개선의 소재로서 미선나무의 항산화 효과에 대한 선행 연구를 바탕으로, 종래의 추출방법인 열수 및 에탄올 추출물을 사용하여 미선나무의 주름개선 강화에 대한 효과를 비교하였다 (Park, 2011).
- , 2011). 뿐만 아니라, 기존의 추출방법은 높은 온도를 사용하기 때문에 활성물질의 불안정 및 손실을 초래할 수 있어서, 미선나무에 함유 되어있는 catechin, chlorogenic acid, coumaric acid등 각종 성분의 초음파 공정을 통해 용출되는 성분물질함량을 증가 시키고 활성의 증진효과를 도모하고자 연구하였다 (Shin and Ahn, 2013; Lee et al., 2009; Kim et al., 2005). 초음파 공정 및 저온 추출을 실시함으로써 시간 단축과 온도를 낮춤으로서 추출효율을 높이고, 미선나무 활성물질의 보호 및 용출이 용이할 것으로 기대할 수 있다.
- 연구 논문에서는 처음으로 확인하는 미선나무에 대한 피부주름개선 효과를 확인한 것이다. 본 연구에서는 생산의 증대로 인하여 각 종 생리활성에 대한 새로운 천연물 소재로 관심받기 시작한 미선나무의 가치를 확인하고자 하였다.
- 그러나 앞서 연구한 특허는 추출물의 농도로 인해 피부세포에 대한 독성 또한 확인하지 않아 효과가 있어도 쓰일 수 있는 것인지 알 수 없고, 향장활성에 대한 효과를 한 가지씩 보아 효능에 대한 검증역시 확실하지 않다. 이에 본 연구는 미선나무를 이용하여 주름개선강화 효과를 확인하였다.
- , 2000). 초음파 추출을 실시하여 항산화 활성 또는 주름개선에 대한 효능증진을 보고한 천연물에 대한 기존의 연구 결과를 토대로 초음파 공정을 추가하여 활성의 증진을 돕고자 하였다 (Kim et al., 2014; Choi and Lee, 2014; Jin et al., 2011). 뿐만 아니라, 기존의 추출방법은 높은 온도를 사용하기 때문에 활성물질의 불안정 및 손실을 초래할 수 있어서, 미선나무에 함유 되어있는 catechin, chlorogenic acid, coumaric acid등 각종 성분의 초음파 공정을 통해 용출되는 성분물질함량을 증가 시키고 활성의 증진효과를 도모하고자 연구하였다 (Shin and Ahn, 2013; Lee et al.
제안 방법
- 20분 후 elastase 효소 용액 50 ㎕를 추가 주입한 뒤 상온에서 다시 20분 동안 방치하였다. 20분 뒤 반응을 종료하고 410 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 저해 활성도를 평가하였다.
- 용액 제거 후 한 번 더 wash buffer로 세척하고 substrate reagent를 넣어 30분 동안 빛을 차단하여 실온에 방치하였다. 30분 뒤 50 ㎕ stop solution 넣어 반응을 종결시키고 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였고 양성대조군은 retinoic acid를 사용하였으며, 표준품을 이용한 정량곡선을 통해 각 샘플별 MMP-1의 생성량을 확인하였다.
- Collagen을 분해하는 효소 MMP-1의 생성량을 미선나무 추출물을 처리하여 확인함으로서 미선나무 추출물의 주름개선 활성 정도를 확인하였다. Fig.
- 24시간 배양한 뒤 추출물을 제거하고, 200 ㎍/㎖ 농도의 MTT 용액을 150 ㎕만큼 주입하여 37℃에서 빛을 차단한 채 다시 3시간 동안 배양 한 후, MTT 용액을 제거하였다. PBS로 세척 후 DMSO를 200 ㎕ 주입하고 30분 간 반응하여 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 570 ㎚에서 흡광도를 측정한 후 무처리군을 100%로 하여 미선나무 추출물의 세포 생존율을 확인하였다.
- Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara, Otsu, Japan)을 이용 하여 collagen 생성량을 측정하였다. 피부 섬유아세포 CCD-986sk를 1.
- 5 : 1)하였을 때, 0분에서 11분까지 (A) 100%로 하고, 11분에서 40분까지 (A) 85%, (B) 15%, 40분에서 60분까지 (A) 65%, (B) 35% 로 하였다 (oruh and and zdogan, 2015). 기기에 투입되는 시료의 양은 20 ㎕로 하고 유속은 1 ㎖/min으로 하였으며, 280 ㎚ 파장에서 측정하여 실험을 진행하였으며 지표 물질의 peak 면적을 기준으로 각 추출물 내 존재하는 지표 성분의 농도를 계산했다.
- 초음파 70% 에탄올 추출은 140 khz의 초음파 (AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea) 조건에서 1시간 전 처리 후 60℃에서 12시간 추출하였다. 모든 추출물은 전부 환류 추출로 실시하였다. 추출한 액상은 감압여과기 필터를 이용하여 여과하고, 여과액을 회전감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
- 미선나무 추출물의 지표 성분의 농도를 비교하기 위해 측정 시료의 농도를 각각 1000 ppm로 설정하여 측정하였으며, 분석 장비로는 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC, Aglient 1260 series, Aglient Technologies, Santa clara, USA)를 이용하였고, 칼럼은 Jupiter 5u C18 3000A (250 × 4.6 ㎜, Phenomenex, Seoul, Korea)을 사용하였다.
- 미선나무의 항산화능 측정을 위하여, DPPH (α,α-diphenylβ-picrylhydrazyl) 자유 라디칼 활성평가를 실시하였다.
- 다음 배지를 제거하고, 농도 별 미선나무 추출물을 처리한 뒤에 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 준비된 MMP-1키트 Human MMP-1 ELISA Kit (RayBiotech, Norcross, GA, USA)에 있는 plate에 옮겨 처리한 샘플을 100 ㎕ 만큼 주입하여 상온에서 2시간 배양하였다. 2시간 후 처리한 샘플을 제거하고 kit에 준비 된 wash buffer를 이용하여 4회 세척한 뒤 detection antibody MMP-1을 100 ㎕ 주입하여 1시간 동안 상온에서 배양하였다.
- 상기와 같은 미선나무의 주름개선 효능에 대한 결과를 기존에 보고 된 항산화와 항주름의 관계를 검증하기 위하여, DPPH 자유 라디칼 소거활성에 대한 IC50 확인하였다.
- 피부섬유아세포를 이용하여 미선나무추출물의 세포 생존율을 확인하였다 (Table 1). 생존율은 무처리군의 생존율을 100%로 하였을 때 각 추출물의 세포 수 비율로 비교하여 측정하였다. 열수, 70% 에탄올 그리고 초음파 70% 에탄올의 최저 세포 생존율은 각각 91.
- 미선나무는 3일 간 충분히 말려 건조 된 상태의 미선나무 지상부 (잎과 줄기)를 길이 약 3 ㎝로 잘라 추출 하였다. 열수 추출은 미선나무 잎, 줄기를 증류수에서 100℃ 조건으로 24시간 추출하였으며, 70% 에탄올 추출은 80℃에서 24시간 추출하였다. 초음파 70% 에탄올 추출은 140 khz의 초음파 (AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea) 조건에서 1시간 전 처리 후 60℃에서 12시간 추출하였다.
- 생존율은 무처리군의 생존율을 100%로 하였을 때 각 추출물의 세포 수 비율로 비교하여 측정하였다. 열수, 70% 에탄올 그리고 초음파 70% 에탄올의 최저 세포 생존율은 각각 91.12%, 85.52%, 85.33%로 높은 세포 생존율을 보여, 세포 실험에 있어 해당 농도 내에서 독성이 없을 것으로 판단되므로 세포 실험을 진행하였다.
- Louis, MO, USA) 100 ppm으로 사용하였다. 이동상 용매의 조건은 기존의 연구를 참고 및 일부 변형하여, (A) H2O (1% acetic acid), (B) acetonitrile : methanol : 2% acetic acid (2 : 2.5 : 1)하였을 때, 0분에서 11분까지 (A) 100%로 하고, 11분에서 40분까지 (A) 85%, (B) 15%, 40분에서 60분까지 (A) 65%, (B) 35% 로 하였다 (oruh and and zdogan, 2015). 기기에 투입되는 시료의 양은 20 ㎕로 하고 유속은 1 ㎖/min으로 하였으며, 280 ㎚ 파장에서 측정하여 실험을 진행하였으며 지표 물질의 peak 면적을 기준으로 각 추출물 내 존재하는 지표 성분의 농도를 계산했다.
- 열수 추출은 미선나무 잎, 줄기를 증류수에서 100℃ 조건으로 24시간 추출하였으며, 70% 에탄올 추출은 80℃에서 24시간 추출하였다. 초음파 70% 에탄올 추출은 140 khz의 초음파 (AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Korea) 조건에서 1시간 전 처리 후 60℃에서 12시간 추출하였다. 모든 추출물은 전부 환류 추출로 실시하였다.
- 평가 미선나무 추출물의 주름개선에 대한 효과를 확인하기 위하여 elastase 효소 저해 활성 평가를 진행하였으며, 결과는 Fig.1에 표시하였다. 열수 추출물은 0.
- 본 연구에서는 생산의 증대로 인하여 각 종 생리활성에 대한 새로운 천연물 소재로 관심받기 시작한 미선나무의 가치를 확인하고자 하였다. 피부노화로 인한 주름개선의 소재로서 미선나무의 항산화 효과에 대한 선행 연구를 바탕으로, 종래의 추출방법인 열수 및 에탄올 추출물을 사용하여 미선나무의 주름개선 강화에 대한 효과를 비교하였다 (Park, 2011). 추가적으로, 단단한 미선나무의 특성상 추출 시 활성성분 용출의 어려움이 있을 것으로 판단하여 초음파 진동으로 인해 발생한 에너지가 천연물에 작용해 충격을 주고 압력을 발생시켜 혼합 효과를 일으킨다고하는 연구 보고가 있다 (Park et al.
- 피부섬유아세포를 이용하여 미선나무추출물의 세포 생존율을 확인하였다 (Table 1). 생존율은 무처리군의 생존율을 100%로 하였을 때 각 추출물의 세포 수 비율로 비교하여 측정하였다.
- 30분 후 517 ㎚의 파장에서 흡광도 측정 하였다. 항산화 효능의 확인은 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 자유 라디칼 소거활성 IC50으로 확인하였다.
대상 데이터
- 구입한 세포를 유동적으로 첨가량을 조절한 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 포함 된 DMEM 배지에 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하였다.
- , Tokyo, Japan)로 충분히 농축하였다. 농축 후 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSHINBioBase, Dongducheon, Korea)에 3일 간 건조하여 파우더 된 샘플을 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 미선나무 잎, 줄기는 국내 자생지인 충청북도 괴산군에서 구입하였다. 미선나무는 3일 간 충분히 말려 건조 된 상태의 미선나무 지상부 (잎과 줄기)를 길이 약 3 ㎝로 잘라 추출 하였다.
- 인간피부섬유아세포 CCD-986sk는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 구입한 세포를 유동적으로 첨가량을 조절한 fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 포함 된 DMEM 배지에 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 6 ㎜, Phenomenex, Seoul, Korea)을 사용하였다. 지표 물질로는 coumaric acid (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ppm으로 사용하였다. 이동상 용매의 조건은 기존의 연구를 참고 및 일부 변형하여, (A) H2O (1% acetic acid), (B) acetonitrile : methanol : 2% acetic acid (2 : 2.
- 피부섬유아세포 CCD-986sk를 사용하였고, 1.5 ×105 cells/㎖ 농도로 96-well plate에 주입한 뒤 부착할 때 까지 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험의 데이터 통계처리는 3회 반복하였으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)프로그램을 통하여 two-way ANOVA법으로 처리하였다. 처리구간의 최소 유의 수준의 차는 p < 0.
이론/모형
- Elastase 효소 저해활성 실험은 Kim 등(2011)의 선행연구를 참고하여, 실험을 진행하였다. pH 8.
- 미선나무 추출물의 세포생존율을 확인하고자 MTT assay를 사용하였다. 피부섬유아세포 CCD-986sk를 사용하였고, 1.
성능/효과
- 80%로 낮은 활성 값을 보였으며, 농도 의존적이지 못했다. 70%에탄올 추출물은 최고 농도에서 22.01%로 열수 추출물에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 농도의존적으로 활성 값이 증가하였다. 마찬가지로 초음파 전처리 샘플 또한 농도에 따라 활성 값이 증가하였으며, 0.
- 01%로 열수 추출물에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 농도의존적으로 활성 값이 증가하였다. 마찬가지로 초음파 전처리 샘플 또한 농도에 따라 활성 값이 증가하였으며, 0.3 ㎎/㎖에서 25.32%로 70% 에탄올 추출물에 비해 값이 증가하였음을 확인할 수 있다. 양성대조군으로 쓰인 ursolic acid는 51.
- 4에 나타내었다. 미선나무에 존재하는 coumaric acid의 정량 결과 열수 추출물의 경우 0.9 ㎎/100 g로 측정되었으며, 70% 에탄올 추출물에서는 12.6 ㎎/100 g이 계산되어 물보다는 에탄올 용매에서 더 높은 용출량을 나타냈다. 이에 비해 초음파 공정을 통해 얻어진 추출물의 경우, 지표 성분인 courmaric acid의 농도가 16.
- 1 ng/㎖로 확인되었다. 미선나무의 경우 열수 추출물은 가장 높은 농도에서 최대 31.2 ng/㎖의 생성량이 측정 되었고, 70% 에탄올 추출물이 150 ng/㎖로 열수 추출에 비해 월등히 높은 collagen 생성량을 나타내었다. 초음파 추출물은 70% 에탄올 보다 높은 collagen 생성량이 확인 되었으나, 이 역시 오차범위 내로 차이가 없었다.
- 2을 보면, 모든 추출용매별 미선나무 샘플에서 농도가 증가함에 따라 생성량이 감소하는 양상을 보여 MMP-1 저해에 대한 활성을 확인하였다. 양성대조군으로 쓰인 retinoic acid의 경우 113.6 pg/㎖의 MMP-1생성량을 보였으며, 미선나무 추출물은 앞의 실험결과와 마찬가지로 열수 추출물은 최대농도에서 MMP-1 생성량이 6640.8 pg/㎖로 측정되었고, 70% 에탄올 추출물은 3240.6 pg/㎖의 MMP-1 생성량을 보여 70% 에탄올 추출물의 주름개선효능이 높게 측정되었다. 초음파 전처리 샘플의 경우 70% 에탄올 추출물보다 MMP-1에 대한 저해활성이 높았으나, 차이는 오차 범위 내로 큰 차이는 없었다.
- 32%로 70% 에탄올 추출물에 비해 값이 증가하였음을 확인할 수 있다. 양성대조군으로 쓰인 ursolic acid는 51.16%의 elastase 저해율로 미선나무 추출물에 비해 높은 수치를 보였으나, 주름개선효과에 대해 연구 보고한 오가피 열매의 elastase 저해 활성의 경우 비슷한 60% 에탄올 추출물에서 22.4%의 활성을 보여 (Jo and Cho, 2012), 비슷한 값을 보이는 미선나무 추출물 역시 주름개선효능이 있음을 알 수 있었다.
- 양성대조군인 retinoic acid의 collagen 생성량은 423.1 ng/㎖로 확인되었다.
- 7 ㎍/㎖의 IC50값이 확인 되었다. 열수 추출물보다는 70% 에탄올 추출물에서 더 좋은 항산화 활성을 보였으며, 초음파 전처리한 70% 에탄올 추출물의 경우 70.5 ㎍/㎖의 IC50값이 측정 되어, 항산화 효능의 증진을 확인할 수 있었다. 이전의 주름개선 관련 실험들과 비교해보면 라디칼 소거능에 대한 효과가 높을수록 주름개선에 대한 활성정도가 높은 것을 확인할 수 있다.
- 확인하였다. 열수 추출물의 IC50값은 138.3 ㎍/㎖로 확인 되었고, 70% 에탄올 추출물의 경우 76.7 ㎍/㎖의 IC50값이 확인 되었다. 열수 추출물보다는 70% 에탄올 추출물에서 더 좋은 항산화 활성을 보였으며, 초음파 전처리한 70% 에탄올 추출물의 경우 70.
- 1 ㎎/100 g보다도 (Yoo and Kim, 2001) 많은 양이 추출될 수 있다는 것이 입증되었다. 이로써 초음파 저온 추출 공정을 이용함으로 목적하는 물질들의 용출량에 대한 획기적 증진과 함께, 고온 추출 시 야기 될 수 있는 유용 성분들의 파괴 및 변성의 가능성이 줄어 초음파 추출물의 생리 활성이 높아진 결과의 설명이 가능하다. 또한 초음파로부터 발생되는 파장 진동에 의한 높은 에너지에 따른 공동현상으로 천연물에 상대적으로 높은 압력이 가해져 목적하는 유용 성분외에 기타 미량의 성분들의 용출량도 같이 증가해 이들 성분들의 시너지 효과에 의해 미선나무 초음파 추출물의 향장 활성 증진에도 기여했다고 유추할 수 있다 (Park et al.
- 6 ㎎/100 g이 계산되어 물보다는 에탄올 용매에서 더 높은 용출량을 나타냈다. 이에 비해 초음파 공정을 통해 얻어진 추출물의 경우, 지표 성분인 courmaric acid의 농도가 16.3 ㎎/100 g로 계산되어 통상적인 추출 공정인 70% 에탄올로 추출한 경우보다 60℃의 저온임에도 불구하고 30%에 가깝게 용출량이 증진되는 것이 확인되었다. 또한 기존에 보고된 미선나무의 coumaric acid 함량인 8.
후속연구
- , 2014). 그러나 앞서 연구한 특허는 추출물의 농도로 인해 피부세포에 대한 독성 또한 확인하지 않아 효과가 있어도 쓰일 수 있는 것인지 알 수 없고, 향장활성에 대한 효과를 한 가지씩 보아 효능에 대한 검증역시 확실하지 않다. 이에 본 연구는 미선나무를 이용하여 주름개선강화 효과를 확인하였다.
- , 2014), 상기와 같은 연구의 결과는 천연 화장품 소재로서 미선나무의 상업화 가능성을 입증하였고, 국내에서만 자생하는 미선나무의 특성을 살려 생산 기술의 발달로 점차 생산성이 증가하게 되면, 천연추출물의 생리활성분야에서 경쟁력을 갖출 수 있을 것으로 사료 된다. 또한, 미선나무를 이용한 화장품 소재 개발 뿐만 아니라 미선나무를 이용하여 다른 생리 활성도 확인하여 미선나무자체의 가치를 증대 시킬 수 있을 것으로 보인다.
- , 1989; Yoo and Kim, 2001; Lee, 2011). 이로써 본 미선나무의 향장 활성 실험 결과는 근래 대량생산에 성공하여 다양한 분야에 활용 될 수 있는 미선나무에 대해, 상대적으로 연구가 미흡한 주름 개선 활성을 확인하였을 뿐만 아니라 (Kwon et al., 2014), 상기와 같은 연구의 결과는 천연 화장품 소재로서 미선나무의 상업화 가능성을 입증하였고, 국내에서만 자생하는 미선나무의 특성을 살려 생산 기술의 발달로 점차 생산성이 증가하게 되면, 천연추출물의 생리활성분야에서 경쟁력을 갖출 수 있을 것으로 사료 된다. 또한, 미선나무를 이용한 화장품 소재 개발 뿐만 아니라 미선나무를 이용하여 다른 생리 활성도 확인하여 미선나무자체의 가치를 증대 시킬 수 있을 것으로 보인다.
- , 2005). 초음파 공정 및 저온 추출을 실시함으로써 시간 단축과 온도를 낮춤으로서 추출효율을 높이고, 미선나무 활성물질의 보호 및 용출이 용이할 것으로 기대할 수 있다.
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