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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 홍경천이 뇌출혈과 뇌부종에 미치는 효능을 관찰하기 위하여, 실험동물의 뇌 선조체 (striatum) 내에 collagenase를 주입하여 뇌조직내출혈 (intracerebral hemorrhage, ICH)을 유발하고 홍경천 에탄올추출물을 경구투여한 후 뇌부종과 뇌혈관관문 (blood-brain barrier, BBB) 누출 손상, 신경세포의 세포부종에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종과 BBB 손상에 관여하는 주요인자인 matrix metalloproteinase (MMP)-9와 MMP-12 및 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현을 면역조직화학염색으로 관찰한 바 유의한 결과를 얻어 이에 보고하는 바이다.
- 특히 어댑토겐의 효능을 나타내는 성분으로 p-tyrosol과 phenolic glycoside rhodioloside가 알려져 있으며26), p-tyrosol은 산화적 손상의 억제효능과 5-lipoxygenase 억제효능이 있고, salidroside의 일종인 rhodioloside와 rhodiolin, rosin, rosavin, rosarin, rosiridin 등의 유효성분들이 항산화 효능14), 항스트레스15), 정신적 작업능력 향상16), 운동능력 향상19), 학습과 기억 증강18) 등의 다양한 효능들과 특히 신경세포손상 보호효능17)을 발휘하는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서는 홍경천의 뇌출혈에 의한 뇌부종과 뇌혈관관문 (blood-brain barrier, BBB) 손상에 대한 효능을 관찰하고자 하였다.
- MMP-12 양성반응 혈관 수를 관찰한 결과 역시 hematoma 주변부에서는 유의하지 못하였고, 대뇌피질에서는 유의성 있는 MMP-12 양성반응의 감소가 인정되었다. 이러한 결과는 홍경천의 혈관성 부종의 억제효과가 MMP-9와 MMP-12의 과발현을 억제하는 기전에 의한 것을 추측하게 한다. 그리고 hematoma 주변부에서 유의한 효과가 나타나지 않은 것은 손상의 정도가 심한 때문인 것으로 생각된다.
제안 방법
- Cresyl violet 염색된 뇌조직의 영상을 광학현미경 (BX51,Olympus, Japan)에 장착된 CCD camera (DP70, Olympus, Japan)를 통하여 영상분석시스템에 저장하고, Image J software (ver. 1.41)를 사용하여 신경세포의 크기를 측정하였다. 그 영상분석 과정을 간단히 기술하면 다음과 같다 (Fig.
- 뇌조직은 cryocut으로 20 μm 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다. Cresyl violet 염색은 뇌조직을 실온에서 1.0% (w/v) cresyl violet acetate 용액에 2분간 염색하고, 농도별 ethanol 용액으로 탈수한 다음 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- Image J에서 측정 대상의 영상을 불러온 다음 (step 1), 영상을 8-bit의 흑백영상으로 변환하고 (step 2), 적정의 grey level threshold를 입력하여 (step 3), 흑백영상으로부터 threshold 값 이상의 optical density를 나타내는 신경세포 area를 결정하였다 (step 4). 선정된 pixel들이 구성하는 area 중 300 μ m2 이상과 30 μ m2 이하의 area들 즉, 신경 세포 이외의 불필요한 area들을 제거하고 (step 5), 각각의 pixel area를 측정하였다 (step 6).
- MMP-9, MMP-12 및 iNOS 발현의 측정을 위한 영상분석 및 측정방법은 위의 신경세포 크기 측정 8-2와 동일한 과정으로, 뇌의 각 부위별로 동일한 일정면적 (105 μ m2 ) 내에서 양성반응을 나타낸 신경세포의 수를 Image J software (ver. 1.41)를 사용하여 측정하였다.
- 마취와 두정부의 피부절개및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 뇌조직 내에 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham)과 위의 과정과 같은 사전준비 수술에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌조직내출혈을 유발한 대조군 (ICH) 및 대조군과 같이 뇌조직내출혈을 유발한 다음 3일간 홍경천 에탄올추출물을 경구투여한 홍경천투여군 (ICH+RR)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 각각 18마리씩 총 54마리로, 뇌부종 측정과 뇌조직 수분함량 측정, 뇌혈관관문 손상 관찰 및 뇌조직의 면역조직화학염색용으로 사용하였다.
- 또한 NO와 free radicals 는 MMPs를 활성화시켜 뇌조직 손상과 신경세포 사망을 유발한다고 하였다40). 그러므로 홍경천이 iNOS 발현에 미치는 영향을 면역조직화학염색을 통하여 관찰하였다. 그 결과, hematoma 주변부에서는 유의하지 못하였고, 대뇌피질과 외 포에서는 홍경천이 iNOS 양성반응을 유의하게 감소시켰다.
- 뇌조직내출혈 유발과 홍경천 에탄올추출물 투여 3일 후에 실험동물을 2% isoflurane을 포함한 70% N2O와 30% O2 gas로 흡입마취하고, 대퇴정맥을 통하여 4% Evans blue 용액을 4 ml/kg 주입한 다음 30분 후에 단두하여 실험동물을 희생시켰다. 즉시 뇌를 적출한 다음 -40℃의 dry ice-isophentane 용액으로 동결시키고, cryocut으로 20 μm 두께의 관상절편으로 제작하여 slide glass에 부착한 다음 hot plate에서 완전히 건조시켰다.
- 뇌조직내출혈 유발과 홍경천 에탄올추출물 투여 3일 후에 실험동물을 pentobarbital sodium의 복강주사로 깊게 마취한다음 개흉하고 심장을 통하여 0.05M phosphate buffered saline (PBS)과 4% paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담가 침전시켰다.
- 뇌조직내출혈 유발과 홍경천 에탄올추출물 투여 3일 후에 실험동물을 pentobarbital sodium의 복강주사로 깊게 마취한다음 개흉하고 심장을 통하여 0.05M phosphate buffered saline (PBS)과 4% paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담가 침전시켰다.
- 뇌조직내출혈 유발과 홍경천 에탄올추출물 투여 3일후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 뇌로부터 소뇌와 뇌간을 제거하고 정중선을 따라 정상측과 ICH유발측 대뇌반구를 분리하였다. 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 무게를 전자저울로 측정하고, 120℃의 mechanical convection oven (DMC121, Daeil Engineering Co.
- 뇌조직내출혈 유발을 위한 수술과정은 electronic temperature controller (CMA150, CMA, Sweden)를 통하여 정상체온 (37±0.5℃)이 유지되는 상태에서, 2% isoflurane을 포함한 70% N2O와 30% O2 gas의 흡입마취하에서 이루어졌으며, 필요한 경우 추가적으로 pentobarbital sodium (50 mg/kg)을 복강주사 하였다.
- 뇌조직내출혈 유발과 홍경천 에탄올추출물 투여 3일후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 뇌로부터 소뇌와 뇌간을 제거하고 정중선을 따라 정상측과 ICH유발측 대뇌반구를 분리하였다. 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 무게를 전자저울로 측정하고, 120℃의 mechanical convection oven (DMC121, Daeil Engineering Co., Korea)에서 24시간 동안 건조한 다음 건조중량을 측정하여 그 무게 차이의 비율을 수분함량 자료로 사용하였다.
- 다음 3,3‘-diaminobenzidine tetrachloride (DAB, SigmaAldrich, USA)에서 1-2분간 발색 반응시키고, 수세한 다음 탈수, 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- Primary antibody는 anti-MMP-9 1：200 (AB19016, Chemicon, USA), anti-MMP-12 1：20 (MAB919, R&D, USA) 및 anti-iNOS 1：250 (610329, BD, USA)을 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 overnight로 반응시켰다. 다음 biotinylated anti-rabbit secondary antibody 1：200 (Vector Labolatories, USA)에 실온에서 1시간동안 반응시키고, 조직을 PBS로 씻어내고, abidin-biotin immuno-peroxidase의 방법 (ABC Vectastain Kit)에 따라 각각 1시간씩 반응시켰다. 다음 3,3‘-diaminobenzidine tetrachloride (DAB, SigmaAldrich, USA)에서 1-2분간 발색 반응시키고, 수세한 다음 탈수, 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.2 mm, 외측으로 3.5 mm 위치에 전기드릴을 사용하여 약 1 mm 직경의 구멍을 만들고, 뇌정위고정장치에 장착된 hamilton 주사기 (26-gauge, 10 μl, Hamilton, USA)를 뇌경막 (dura mater)으로부터 5.5 mm 깊이로 선조체에 삽입하였다.
- 또한 뇌조직내출혈의 유발 방법에서 hematoma가 선조체내에 생성되도록 collagenase를 주입하였으므로, 혈관성 부종이 유발되는 선조체의 hematoma 주변부와 세포독성 부종이 일어나는 대뇌피질에서 각각 신경세포의 크기를 관찰하였다. 그 결과, hematoma 주변부의 신경세포는 Sham군에 비하여약 16.
- 마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치 (Stoelting, USA)에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.
- 뇌조직내출혈에 대한 홍경천의 효능을 관찰하기 위하여 실험군을 다음과 같이 구분하였다. 마취와 두정부의 피부절개및 두개골의 천공 과정은 시행하였으나 뇌조직 내에 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham)과 위의 과정과 같은 사전준비 수술에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌조직내출혈을 유발한 대조군 (ICH) 및 대조군과 같이 뇌조직내출혈을 유발한 다음 3일간 홍경천 에탄올추출물을 경구투여한 홍경천투여군 (ICH+RR)으로 나누었다. 각 군의 실험동물은 각각 18마리씩 총 54마리로, 뇌부종 측정과 뇌조직 수분함량 측정, 뇌혈관관문 손상 관찰 및 뇌조직의 면역조직화학염색용으로 사용하였다.
- 본 실험의 결과에서 홍경천이 뇌조직내출혈로 인하여 BBB가 손상되어 유발되는 혈관성 뇌부종을 억제하는 효능이 관찰되었으므로 나아가 홍경천이 MMP-9와 MMP-12 발현에 미치는 영향을 면역조직화학염색을 통하여 관찰하였다. 그 결과, 뇌조직내출혈로 인하여 hematoma 내부와 주변부에서 매우 강한 MMP-9 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되 었으며, 대뇌피질에서도 일부 신경세포에서 약한 MMP-9 양성반응이 관찰되었다.
- 선정된 pixel들이 구성하는 area 중 300 μ m2 이상과 30 μ m2 이하의 area들 즉, 신경 세포 이외의 불필요한 area들을 제거하고 (step 5), 각각의 pixel area를 측정하였다 (step 6).
- 본 실험에 사용한 한약물은 홍경천 (Rhodiola rosea, RR)으로 益康藥材有限公社 (安國市, 中國)에서 구입하였다. 세절한 홍경천 400 g에 40% ethanol 3,000 ml를 가하여 실온에서 5일간 추출하였으며, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축 후 동결건조하여 62.5 mg/g의 추출물을 얻어 수율은 6.3% 이었다. 실험동물의 1회 투여량은 흰쥐 체중 100 g 당 20.
- 3% 이었다. 실험동물의 1회 투여량은 흰쥐 체중 100 g 당 20.8 mg을 2 ml의 온수에 녹여 뇌조직내출혈 유발 3시간 후부터 1일 1회 3일간 경구투여 하였다.
- 즉시 뇌를 적출한 다음 -40℃의 dry ice-isophentane 용액으로 동결시키고, cryocut으로 20 μm 두께의 관상절편으로 제작하여 slide glass에 부착한 다음 hot plate에서 완전히 건조시켰다. 이후 별도의 염색 없이 봉입하여 조직표본을 제작하고 광학현미경 (BX51, Olympus, Japan)으로 관찰하였다22).
- 뇌조직내출혈 유발과 홍경천 에탄올추출물 투여 3일후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시켰다. 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI, USA)를 사용하여 2 mm 두께의 뇌조직 절편을 만들고, digital camera로 촬영한 다음 ImageJ software (ver. 1.41)를 사용하여 각각의 뇌 절편으로부터 정중선을 기준으로 ICH유발측과 정상측의 대뇌반구 면적을 측정하고, 정상측 대뇌반구 면적에 대한 ICH유발측 대뇌반구의 면적비율로 뇌부종 비율을 계산하였다 (Fig. 1).
- 홍경천이 뇌출혈에 미치는 효능을 관찰하기 위하여, 흰쥐의 뇌 선조체 내에 collagenase를 주사하여 뇌조직내출혈을 유발하고, 홍경천 에탄올추출물을 경구투여한 후 뇌부종과 뇌조직 수분함량, 뇌혈관관문 누출 손상, 신경세포의 세포부종에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종과 BBB 손상에 관여하는 주요인자인 MMP-9와 MMP-12 및 iNOS 발현을 면역조직화학염색으로 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 뇌조직은 cryocut으로 20 μm 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 한약물은 홍경천 (Rhodiola rosea, RR)으로 益康藥材有限公社 (安國市, 中國)에서 구입하였다. 세절한 홍경천 400 g에 40% ethanol 3,000 ml를 가하여 실온에서 5일간 추출하였으며, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축 후 동결건조하여 62.
- 실험동물은 샘타코 (Samtako, Korea)에서 구입한 11주령, 약 300 g 전후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용 하였다. 흰쥐는 온도 (21-23℃), 습도 (40-60%), 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료를 자유롭게 공급하며 사육되었고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 선정된 pixel들이 구성하는 area 중 300 μ m2 이상과 30 μ m2 이하의 area들 즉, 신경 세포 이외의 불필요한 area들을 제거하고 (step 5), 각각의 pixel area를 측정하였다 (step 6). 총 500 개의 신경세포 크기를 측정하여 그 평균을 자료로 사용하였다.
데이터처리
- 측정된 모든 자료는 Student's t-test를 사용하여 대조군 (ICH)과 홍경천투여군 (ICH+RR) 사이에서 P<0.05의 유의수준으로 검정하였다.
성능/효과
- 1. 홍경천 에탄올추출물은 뇌조직내출혈로 인한 뇌부종을 유의하게 감소시켰다.
- 2. 홍경천 에탄올추출물은 뇌조직내출혈로 인하여 증가된 뇌조직 수분함량을 유의하게 감소시켰다.
- 3. 홍경천 에탄올추출물은 뇌조직내출혈로 인한 대뇌피질의 뇌혈관관문 누출을 억제하였다.
- 4. 홍경천 에탄올추출물은 뇌조직내출혈로 인한 hematoma 주변부와 대뇌피질의 신경세포 세포부종을 유의하게 감소시켰다.
- 5. 홍경천 에탄올추출물은 뇌조직내출혈로 인하여 증가된 hematoma 주변부의 MMP-9 발현을 유의하게 억제하지 못하였으나, 대뇌피질에서 증가된 MMP-9 발현은 유의하게 억제하였다.
- 6. 홍경천 에탄올추출물은 뇌조직내출혈로 인하여 증가된 hematoma 주변부의 MMP-12 발현을 유의하게 억제하지 못하였으나, 대뇌피질에서 증가된 MMP-12 발현은 유의하게 억제하였다.
- 7. 홍경천 에탄올추출물은 뇌조직내출혈로 인하여 증가된 hematoma 주변부의 iNOS 발현을 유의하게 억제하지 못하였으나, 대뇌피질과 외포에서 증가된 iNOS 발현은 유의하게 억제하였다.
- A significant decrease of percentage of cell population in cell-size over 150 μm2 resulted from administration of ethanol extract of Rhodiola rosea (ICH+RR), compared with that of ICH control group in the cerebral cortex layer V (*, P<0.05； n=6).
- Hematoma 주변부에서 ICH 대조군과 홍경천투여군은 Sham군에 비하여 세포크기가 50-100 μ m2 이하인 것은 감소하고, 100-150 μ m2이하 및 150 μ m2이상의 것은 증가하였으며, ICH 대조군과 홍경천투여군 간에 크기별 분포는 유의한 차이가 없었다 (Fig. 8).
- 13-7) 모두에서 극히 미약한 iNOS 양성반응을 관찰할 수 있었다. ICH 대조군은 hematoma 내부와 주변부에서 iNOS에 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며 (Fig. 13-2, arrow), 대뇌피질에서도 일부 신경세포에서 iNOS 양성반응을 관찰할 수 있었다 (Fig. 13-5, arrow). 특히 hematoma 가 형성된 선조체와 대뇌피질 사이의 외포에서도 iNOS 양성반응을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 11-4) 모두에서 MMP-12 양성반응 세포를 관찰할 수 없었다. ICH 대조군은 hematoma 내부와 주변부에서 강한 MMP-12 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며 (Fig. 11-2, arrow), 대뇌피질에서는 일부 혈관 벽에서만 강한 MMP-12 양성반응이 관찰되었다 (Fig. 11-5, arrow). 이에 비하여 홍경천투여군은 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 MMP-12 양성반응의 강도는 ICH 대조군과 차이가 없었으나 양성반응의 세포와 혈관 수가 감소한 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 9-4) 모두에서 극히 일부의 세포에서만 MMP-9 양성반응을 관찰할 수 있었다. ICH 대조군은 hematoma 내부와 주변부에서 매우 강한 MMP-9 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며 (Fig. 9-2, arrow), 대뇌피질에서도 일부 신경세포에서 약한 MMP-9 양성반응이 관찰되었다 (Fig. 9-5, arrow). 이에 비하여 홍경천투여군은 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 MMP-9 양성반응의 강도는 ICH 대조군과 차이가 없었으나 양성반응 세포수가 감소한 것을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 이에 비하여 홍경천투여군은 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 MMP-9 양성반응의 강도는 대조군과 차이가 없었으나 양성반응 세포수가 감소하는 경향을 보였으며, MMP-9 양성반응 세포수의 변화를 정량적으로 관찰한 결과는 대뇌피질에서 유의성 있는 감소가 인정되었다. MMP-12 양성반응 혈관 수를 관찰한 결과 역시 hematoma 주변부에서는 유의하지 못하였고, 대뇌피질에서는 유의성 있는 MMP-12 양성반응의 감소가 인정되었다. 이러한 결과는 홍경천의 혈관성 부종의 억제효과가 MMP-9와 MMP-12의 과발현을 억제하는 기전에 의한 것을 추측하게 한다.
- 그러므로 홍경천이 iNOS 발현에 미치는 영향을 면역조직화학염색을 통하여 관찰하였다. 그 결과, hematoma 주변부에서는 유의하지 못하였고, 대뇌피질과 외 포에서는 홍경천이 iNOS 양성반응을 유의하게 감소시켰다. 특히 홍경천이 회백질로 구성된 외포에서 iNOS 발현을 유의 하게 감소시킨 결과는 회백질을 통하여 뇌부종이 확산되는 것을 억제하는 효과가 있음을 추정하게 한다.
- 또한 뇌조직내출혈의 유발 방법에서 hematoma가 선조체내에 생성되도록 collagenase를 주입하였으므로, 혈관성 부종이 유발되는 선조체의 hematoma 주변부와 세포독성 부종이 일어나는 대뇌피질에서 각각 신경세포의 크기를 관찰하였다. 그 결과, hematoma 주변부의 신경세포는 Sham군에 비하여약 16.5%의 부종이 일어났으며, 대뇌피질의 layer V 신경세포에서는 약 23.8%의 세포부종이 일어나는 것이 관찰되었다. 이에 비하여 홍경천투여군은 조직학적 관찰에서 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 신경세포의 부종을 감소시킨 것을 관찰할 수 있었으며, 신경세포의 크기를 측정한 정량적 관찰에서도 유의한 신경세포 크기의 감소가 인정되었다.
- 본 실험의 결과에서 홍경천이 뇌조직내출혈로 인하여 BBB가 손상되어 유발되는 혈관성 뇌부종을 억제하는 효능이 관찰되었으므로 나아가 홍경천이 MMP-9와 MMP-12 발현에 미치는 영향을 면역조직화학염색을 통하여 관찰하였다. 그 결과, 뇌조직내출혈로 인하여 hematoma 내부와 주변부에서 매우 강한 MMP-9 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되 었으며, 대뇌피질에서도 일부 신경세포에서 약한 MMP-9 양성반응이 관찰되었다. 이에 비하여 홍경천투여군은 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 MMP-9 양성반응의 강도는 대조군과 차이가 없었으나 양성반응 세포수가 감소하는 경향을 보였으며, MMP-9 양성반응 세포수의 변화를 정량적으로 관찰한 결과는 대뇌피질에서 유의성 있는 감소가 인정되었다.
- 뇌조직내출혈을 유발하기 위하여 흰쥐의 뇌 선조체(striatum)에 bacterial collagenase type VII를 주입하여 뇌조직내출혈과 이에 따른 뇌부종을 유발하고, 3일간 홍경천 에탄올추출물을 경구투여한 다음 뇌부종 정도를 측정한 본 실험의 결과, 홍경천투여군은 대조군에 비하여 유의성 있는 뇌부종 비율의 감소를 나타내었으며, 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 수분함량 증가를 유의하게 억제하였다. 또한 Evans blue를 혈관으로 주입하여 뇌혈관관문의 누출을 관찰한 결과, hematoma 주변부에서 뇌혈관관문 손상에 의하여 심한 Evans blue 누출을 관찰할 수 있었으며, 대뇌피질에서도 혈관주위에 Evans blue가 누출된 것을 관찰할 수 있었다.
- 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부와 대뇌피질 및 외포 (external capsule)에서 iNOS 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한 결과 Sham군에서는 선조체 (Fig. 13-1)와 대뇌피질 (Fig. 13-4) 및 외포 (Fig. 13-7) 모두에서 극히 미약한 iNOS 양성반응을 관찰할 수 있었다. ICH 대조군은 hematoma 내부와 주변부에서 iNOS에 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며 (Fig.
- 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부와 대뇌피질의 MMP-12 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한 결과 Sham군에서는 선조체 (Fig. 11-1)와 대뇌피질 (Fig. 11-4) 모두에서 MMP-12 양성반응 세포를 관찰할 수 없었다. ICH 대조군은 hematoma 내부와 주변부에서 강한 MMP-12 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며 (Fig.
- 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구에서 hematoma 주변부와 대뇌피질의 MMP-9 발현을 면역조직화학염색을 통하여 관찰한 결과 Sham군에서는 선조체 (Fig. 9-1)와 대뇌피질 (Fig. 9-4) 모두에서 극히 일부의 세포에서만 MMP-9 양성반응을 관찰할 수 있었다. ICH 대조군은 hematoma 내부와 주변부에서 매우 강한 MMP-9 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되었으며 (Fig.
- 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 수분함량을 측정한 결과 Sham군은 79.34±0.14%의 수분함량을 나타내었고, ICH 대조군은 81.16±0.33%로 뇌조직내출혈에 의하여 현저한 수분함량의 증가가 관찰되었다.
- 뇌조직내출혈을 유발하기 위하여 흰쥐의 뇌 선조체(striatum)에 bacterial collagenase type VII를 주입하여 뇌조직내출혈과 이에 따른 뇌부종을 유발하고, 3일간 홍경천 에탄올추출물을 경구투여한 다음 뇌부종 정도를 측정한 본 실험의 결과, 홍경천투여군은 대조군에 비하여 유의성 있는 뇌부종 비율의 감소를 나타내었으며, 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 수분함량 증가를 유의하게 억제하였다. 또한 Evans blue를 혈관으로 주입하여 뇌혈관관문의 누출을 관찰한 결과, hematoma 주변부에서 뇌혈관관문 손상에 의하여 심한 Evans blue 누출을 관찰할 수 있었으며, 대뇌피질에서도 혈관주위에 Evans blue가 누출된 것을 관찰할 수 있었다. 이에 비하여 홍경천투여군은 hematoma 주변부에서는 Evans blue 누출이 대조군과 큰 차이가 없었으나, 대뇌피질에서는대조군에 비하여 감소된 것을 관찰할 수 있었다.
- 또한 대뇌피질의 layer V에서 ICH 대조군은 48.3±5.5 개의 혈관이 관찰되었으며, 이에 비하여 홍경천투여군은 29.5±3.6 개로 ICH 대조군에 비하여 약 39.0% 감소하고, P<0.05의 유의성 있는 MMP-12 양성반응 혈관 수의 감소가 관찰되었다 (Fig. 12).
- 또한 대뇌피질의 layer V에서 Sham군은 1.3±0.9 개, ICH 대조군은 32.3±3.5 개가 관찰되었으며, 이에 비하여 홍경천투여군은 22.5±2.5 개로 ICH 대조군에 비하여 약 30.4% 감소하고, P<0.05의 유의성 있는 iNOS 양성반응 세포수의 감소가 관찰되었다 (Fig. 14).
- 또한 대뇌피질의 layer V에서는 Sham 군은 0.7±0.3 개를 나타내었고, ICH 대조군은 44.7±6.4개가 관찰되었으며, 이에 비하여 홍경천투여군은 26.5±4.4개로 ICH 대조군에 비하여 약 40.7% 감소하고, P<0.05의 유의성 있는 MMP-9 양성반응 세포수의 감소가 관찰되었다(Fig. 10).
- 또한 대뇌피질의 layer V에서는 Sham군은 92.93±1.61 μ m2을 나타내었고, ICH 대조군은 115.07±2.67 μ m2으로 Sham군에 비하여 세포크기가 약 23.8% 증가하였다.
- 본 연구 결과들을 종합하면, 홍경천은 뇌조직내출혈로 인하여 유발된 뇌부종 비율과 뇌조직의 수분함량을 유의하게 감소시키고, 대뇌피질에서 뇌혈관관문의 누출과 신경세포의 세포부종을 유의하게 감소시켰으므로 뇌조직의 혈관성 부종과 신경세포의 세포독성 부종을 억제하는 효능이 있는 것으로 생각된다. 또한 외포의 iNOS 과발현을 유의하게 억제하는 것으로 보아, 홍경천은 회백질을 통한 뇌부종의 확산을 방지하는 효능이 있음을 추측하게 한다.
- 위와 같은 MMP-12 양성반응 세포 및 혈관 수의 변화를 정량적으로 관찰하기 위하여 각각 조직의 일정면적 내에서 양성반응 세포 및 혈관 수를 측정한 바, hematoma 주변부에서 ICH 대조군은 33.5±4.2 개의 세포가 관찰되었으며, 이에 비하여 홍경천투여군은 27.3±2.8 개로 ICH 대조군에 비하여 약 18.4% 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다 (Fig. 12).
- 위와 같은 MMP-9 양성반응 세포수의 변화를 정량적으로 관찰하기 위하여 각각 조직의 일정면적 내에서 양성반응 세포수를 측정한 바, hematoma 주변부에서는 Sham군은 0.8±0.5 개를 나타내었고, ICH 대조군은 84.2±8.6 개가 관찰되었으며, 이에 비하여 홍경천투여군은 66.0±5.0 개로 ICH 대조군에 비하여 약 21.6% 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다 (Fig. 10).
- 위와 같은 iNOS 양성반응 세포수의 변화를 정량적으로 관찰하기 위하여 각각 조직의 일정면적 내에서 양성반응 세포수를 측정한 바, hematoma 주변부에서 Sham군은 0.5±0.3개, ICH 대조군은 40.7±5.4 개가 관찰되었으며, 이에 비하여 홍경천투여군은 36.3±3.5 개로 ICH 대조군에 비하여 약 10.7% 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다 (Fig. 14).
- 위와 같은 세포부종의 변화를 정량적으로 관찰하기 위하여 각각의 조직으로부터 신경세포의 크기를 측정한 바, hematoma 주변부에서는 Sham군은 77.42±1.38 μ m2을 나타내었고, ICH 대조군은 90.18±1.90 μ m2으로 Sham군에 비하여 세포크기가 약 16.5% 증가하였다.
- 이에 비하여 홍경천투여군은 hematoma 주변부에서는 Evans blue 누출이 대조군과 큰 차이가 없었으나, 대뇌피질에서는대조군에 비하여 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들은 조직의 파괴와 출혈이 심한 hematoma 주변부에서는 유의하지 못하나 전체적으로는 홍경천이 뇌조직내출혈로 인하여 BBB가 손상되어 유발되는 혈관성 뇌부종을 억제하는 효능이 있음을 보여주는 결과이다.
- 이상의 결과로 보아, 홍경천은 뇌조직내출혈 상태에서 뇌부종과 신경세포의 세포독성 부종을 억제하는 효능이 있으며, 이는 MMPs와 iNOS 과발현을 억제하는 작용에 의한 것으로 생각된다.
- 그 결과, 뇌조직내출혈로 인하여 hematoma 내부와 주변부에서 매우 강한 MMP-9 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰되 었으며, 대뇌피질에서도 일부 신경세포에서 약한 MMP-9 양성반응이 관찰되었다. 이에 비하여 홍경천투여군은 hematoma 주변부와 대뇌피질 layer V 모두에서 MMP-9 양성반응의 강도는 대조군과 차이가 없었으나 양성반응 세포수가 감소하는 경향을 보였으며, MMP-9 양성반응 세포수의 변화를 정량적으로 관찰한 결과는 대뇌피질에서 유의성 있는 감소가 인정되었다. MMP-12 양성반응 혈관 수를 관찰한 결과 역시 hematoma 주변부에서는 유의하지 못하였고, 대뇌피질에서는 유의성 있는 MMP-12 양성반응의 감소가 인정되었다.
- 정상측 대뇌반구에 비교한 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 뇌부종 비율을 측정한 결과 Sham군은 1.8±0.2%의 뇌부종이 나타났으며, ICH 대조군은 19.4±0.8%로 뇌조직내출혈에 의하여 현저한 뇌부종의 증가가 관찰되었다.
- 특히 외포에서 Sham군은 1.2±0.8 개, ICH 대조군은 31.8±2.2 개가 관찰되었으며, 이에 비하여 홍경천투여군은 18.7±2.1 개로 ICH 대조군에 비하여 약 41.4% 감소하고, P<0.01의 유의성 있는 iNOS 양성반응 세포수의 감소가 관찰되었다 (Fig. 14).
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